2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的構建*

李 浩黃展森胡志明齊 濤

陳地靈3應 穎4張 宇1張 濱1陳 俊1**

1. 中山大學附屬第三醫院不育與性醫學科 （廣州 510630）;

2. 廣東省梅州市人民醫院泌尿外科; 3. 廣東省微生物研究所; 4. 深圳大學醫學院

2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的構建*

李 浩1△黃展森1△胡志明2齊 濤1

陳地靈3應 穎4張 宇1張 濱1陳 俊1**

1. 中山大學附屬第三醫院不育與性醫學科 （廣州 510630）;

2. 廣東省梅州市人民醫院泌尿外科; 3. 廣東省微生物研究所; 4. 深圳大學醫學院

目的探究2型糖尿病性勃起功能障礙（T2DED）大鼠模型的構建方法。方法SD大鼠30只，隨機分為兩組：對照組10只，飼養普通飼料；實驗組20只，飼養高脂飼料。飼養8周后，實驗組腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，30mg/kg），對照組注射同等劑量的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。腹腔注射3d后采用剪尾法測定隨機血糖，≥16.7mmol/L則認為2型糖尿?。═2DM）建模成功。糖尿?。―M）成模后于2、4、6、8周各測定一次隨機血糖及體質量；于糖尿病成模后4、8周進行進行腹腔葡萄糖耐量試驗（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)，及腹腔胰島素耐量試驗（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT）；于糖尿病成模后8周行阿撲嗎啡（apomorphine，APO）實驗，并測定每只大鼠的陰莖海綿體內壓力（intracavernous pressure，ICP）。測壓完成后，收集大鼠的血清，進行甘油三酯（triglyceride，TG），總膽固醇（total cholesterol，TC），高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol ，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）含量的測量。結果（1）高脂喂養及小劑量STZ注射后，實驗組20只大鼠有17只血糖＞16.7mmol/L，與對照組相比，在注射后第2、4、6、8周實驗組大鼠血糖均明顯升高（P＜0.05）。（2）IPGTT試驗提示糖尿病大鼠存在胰島素抵抗；IPITT試驗提示糖尿病大鼠對胰島素的敏感性下降。與對照組相比，實驗組血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05）；（3）APO實驗提示對照組大鼠勃起率為100%，實驗組中STZ注射后2只大鼠死亡，余15只大鼠有2只可觀察到勃起。行ICP測定，實驗組大鼠的ICP最大值明顯低于對照組大鼠（P＜0.05）。結論高脂喂養聯合小劑量STZ注射可成功構建T2DED的大鼠模型，APO實驗可以有效可靠地篩選ED動物模型。

糖尿病, 2型; 勃起功能障礙; 大鼠

糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction，DED）是難治性ED，嚴重影響患者及其配偶的生活質量。研究表明，在男性糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）人群中ED的患病率高達50%，是非DM人群的3倍左右，且隨著患者年齡的增長以及DM病程的延長，ED患病率明顯升高[1]。在DM人群中，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者占據絕大多數，隨著患者人群的大幅增長，由T2DM導致的ED（T2DED）問題將愈發突出，現有的藥物療效不佳，5型磷酸二酯酶抑制劑（phosphodiesterase type-5 inhibitors，PDE5i）有效率僅為50%左右，更為棘手的是迄今為止其發病機制尚不清楚[2]。因此，亟需進一步對T2DED的發病機制進行研究，以尋找有效的早期預警指標及治療靶點，而建立動物模型是進行相關研究的必要條件。

目前大多數有關 DED的基礎和應用研究均集中在T1DED模型上，但由于T1DM與T2DM的發病過程存在明顯的差異，且T1DM僅占少數，因此探究與T2DM的自然發病過程更為吻合的T2DED模型構建方法具有更為重要的意義。然而，在已有的T2DED模型報道中，建模的方法并沒有形成統一的標準，模型的篩選多采用阿撲嗎啡（APO）實驗，鮮有應用更為客觀的指標——陰莖海綿體內壓（Intracavernuous pressur，ICP）進行評價，且不同的實驗室所報道的成模率存在較大的差異。因此，本研究旨在進一步探究驗證T2DED動物模型的構建方法，同時采用ICP測定的方法對動物成模率進行驗證，評估APO實驗的可靠性，以期為后續的T2DED研究打下基礎。

材料與方法

一、實驗動物

30只成年雄性無特定病原體級（SPF）SD大鼠（廣東省醫學實驗動物中心提供），體質量200g左右，交配實驗證實其勃起功能正常。

二、主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma公司），檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液（pH=4.0，江萊生物科技有限公司），羅氏血糖儀和羅氏卓越型血糖試紙（德國羅氏診斷有限公司）。葡萄糖，胰島素（中山大學附屬第三醫院）。甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒，總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。阿撲嗎啡（上海源葉生物科技有限公司），肝素溶液（上海研域生物科技有限公司），BL-420S生理記錄儀（成都泰盟科技有限公司）。

三、方法

（一）實驗分組

實驗開始前30只大鼠適應性喂養1周后，使用隨機數字表法將大鼠隨機分為兩組，對照組10只，實驗組20只。對照組給予普通飲食（按照熱卡百分比計算，碳水化合物占70%，蛋白質占20%，脂肪占10%），實驗組給予高脂飲食（按照熱卡百分比計算，碳水化合物占20%，蛋白質占20%，脂肪占60%），所有大鼠均自由飲水、攝食。飼養8周后，禁食8h，以30mg/kg劑量給予實驗組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），對照組大鼠同時注射同劑量的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。腹腔注射3d后采用剪尾法測定隨機血糖，≥16.7mmol/L則認為2型糖尿病建模成功。于糖尿病成模后每2周分別測定兩組大鼠的體質量、血糖；于糖尿病成模后第4、8周從兩組中各隨機挑選5只大鼠進行IPGTT及IPITT；于糖尿病成模后第8周進行APO實驗，3d后，禁食12h分別測定每一只大鼠的ICP，測壓完成后，經腹主動脈采血，離心，取上清，進行TG、TC、HDL-C、LDL-C含量的測量。

（二）STZ溶液的配制

將600mg的STZ溶解于100mL濃度為0.1mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液（pH=0.4）中，濃度為6mg/ mL，現配現用，注意在冰浴中完成操作，并盡量保持避光。

（三）APO溶液的配制

APO 2 mg 溶解于0.5mg /kg維生素C 及生理鹽水中，調整濃度為40 μg /mL。

（四）大鼠空腹血糖的測定

大鼠禁食24h后，采用剪尾法取靜脈血，用羅氏血糖儀及配套的血糖試紙進行測定。

（五）胰島素抵抗的評估

IPGTT可以評估胰島素抵抗的情況，具體方法如下：2組大鼠禁食12h后行IPGTT。經剪尾法測定空腹血糖后，接著給予腹腔注射葡萄糖（2g/kg），于注射葡萄糖后30、60、90、120min經剪尾法測定血糖水平。IPITT可以評估胰島素敏感性的情況，具體方法如下：2組大鼠禁食4h后，經剪尾法測定空腹血糖后，繼而按1unit/kg 給予腹腔注射胰島素，于注射胰島素后30、60、90、120min 經剪尾法測定血糖水平[3,4]。

（六）生化指標的測量

ICP測量完成后，使用負壓采血管進行腹主動脈采血，靜置，離心，取上清，-80℃保存。每組分別取5只大鼠的血清，進行TG、TC、HDL-C、LDL-C含量的測量，具體方法按照南京建成生物工程研究所的說明書進行。

（七）大鼠勃起功能的評價

1. 阿撲嗎啡（APO）實驗：兩組大鼠飼養8周后，將每只大鼠放至透明觀察箱中，室內保持安靜，調整燈光亮度至僅夠觀察，適應環境15min，然后在大鼠頸部松弛皮膚下注射APO 100μg /kg，觀察30min，并記錄每組大鼠陰莖勃起次數。陰莖膨大、包皮后退、陰莖頭充血、露出即為1 次有效的陰莖勃起。勃起次數≥1 次，則認為是勃起實驗陽性，表明該大鼠勃起功能正常；反之，則為ED大鼠[5,6]。

2. 陰莖海綿體內壓（ICP）及頸動脈壓的測定：配制5%的戊巴比妥鈉溶液，按30mg/kg的劑量進行腹腔注射麻醉。沿腹白線作腹部正中切口打開腹腔，于前列腺背外側找到盆神經節，仔細辨認并游離出長約5mm的海綿體神經。剪開陰莖根部皮膚，暴露兩側陰莖腳，將注有250IU/mL肝素溶液的23G頭皮針插入左側陰莖海綿體，遠端連接生理記錄儀（成都泰盟）。利用不銹鋼雙鉤電極鉤住海綿體神經進行刺激，刺激參數為：電壓5V，波寬0.2ms，頻率20Hz，每次持續時間為60s。同時分離左側頸動脈，用預先充滿250 IU/mL肝素溶液的PE50管插入頸動脈，遠端接入生理記錄儀（成都泰盟），測定大鼠的頸動脈壓后，計算其平均頸動脈壓（mean carotid arterial pressure, MAP）。

四、統計學處理

用SPSS 22.0統計軟件進行統計學處理。兩組大鼠的血清脂類含量水平，用t檢驗；組間比較用方差分析，P＜0.05為有統計學差異。

結 果

一、實驗動物一般情況

經過8周的高脂喂養，實驗組大鼠體質量增加較明顯，體型較為肥胖，活動量有所減少。STZ注射3d后有3只大鼠血糖不達標（＜16.7mmol/L），予以剔除。隨著糖尿病病程進展，實驗組大鼠開始出現多飲、多食、多尿、消瘦，毛發干枯、脫毛，反應遲鈍、活動減少等癥狀，部分出現爛尾現象。STZ注射2周后2只實驗組大鼠因糖尿病并發癥死亡。對照組大鼠毛發光亮柔順、反應靈敏、好動，體質量增加。

二、隨機血糖及體質量變化的比較

與對照組相比，實驗組STZ注射后第6周、第8周兩個時間點的體質量下降，差異有統計學意義（P＜0.05），其余時間點差異無統計學意義。隨著造模時間推移，對照組大鼠體質量逐漸增加，對照組檸檬酸緩沖液注射后第4、6、8周與第3天的體質量比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；實驗組大鼠于STZ注射后，各時間點之間的體質量無明顯差異（P＞0.05），見表1。與對照組相比，STZ注射后第3天、第2周、第4周、第6周、第8周血糖均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組內與實驗組組內不同時間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

三、胰島素抵抗評估結果

IPGTT和IPITT的結果如圖1所示，其變化符合2型糖尿病的特征。與對照組相比，實驗組血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05）。

表1 STZ注射后各時間點大鼠體質量的變化

表1 STZ注射后各時間點大鼠體質量的變化

與對照組比較，*為P＜0.05；與對照組第3天相比，△P＜0.05

第3天 第2周 第4周 第6周 第8周對照組 544.90±52.79 592.00±55.89 631.00±64.20△659.55±77.33△689.00±78.06△實驗組 578.65±70.65 576.67±55.54 584.00±54.55 570.67±57.91*549.00±58.83*

表2 STZ注射后各時間點大鼠血糖值的變化

表2 STZ注射后各時間點大鼠血糖值的變化

與對照組比較，*為P＜0.05

第3天 第2周 第4周 第6周 第8周對照組 5.73±0.64 5.93±0.48 5.91±0.55 5.89±0.86 5.95±0.44實驗組 20.45±2.21*19.24±1.64*19.14±2.37*19.29±3.59*20.49±2.63*

圖1 胰島素抵抗評估

四、勃起功能評價

在注射STZ后第8周對兩組大鼠進行APO實驗，其中對照組大鼠均可觀察到明顯的陰莖勃起，陽性率高達100%（10/10）。實驗組中有2只大鼠可觀察到較為明顯的陰莖勃起，陽性率為13.3%。

在進行APO實驗后第3天我們測定了兩組大鼠的ICP，見表3，圖2。實驗組大鼠的ICP最大值明顯低于對照組大鼠（分別為38.65±18.23和95.38±20.61），ICP/MAP比值同樣呈現顯著的差異（實驗組為0.29±0.8，對照組為0.76±0.16），表明在糖尿病成模后第8周實驗組大鼠出現明顯的勃起功能障礙。

圖2 對照組（A）及實驗組（B）大鼠陰莖海綿體內壓力（ICP）及頸動脈壓

表3 兩組ICP和MAP測定結果

討 論

糖尿?。―M）主要以胰島素分泌相對或絕對不足，伴或不伴胰島素抵抗為病理生理基礎和顯著特征，導致機體的碳水化合物、脂質和蛋白質代謝紊亂，臨床上以慢性高血糖為主要標志。糖尿病可分為2種類型：胰島素依賴型糖尿?。?型糖尿病，T1DM），多見于青少年，胰島素分泌絕對不足；胰島素非依賴型糖尿?。?型糖尿病，T2DM），多見于中老年人，胰島素分泌相對不足，同時伴有胰島素抵抗。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結構以及生活方式發生了明顯的變化，糖尿病患者數量急劇增加。全球糖尿病流行病學調查報告顯示[7]：2000年全世界DM患者的總人數為1.71億 ，2012年達到3.71億，預計到2030年，全球DM患者總人數將高達4.39億。在我國，糖尿病的患病率也正在逐年快速增長。據一項全國糖尿病流行病學研究報道[8]，國內糖尿病的患病率高達9.7%，換算之后約為9 240萬人次。糖尿病及其并發癥顯然已嚴重影響患者的生活質量，并造成巨大的經濟及社會負擔。

勃起功能障礙（ED）作為DM的主要并發癥之一，在DM人群中的患病率約為35%~90%[9]。DM患者一般比非DM患者早10~15年發生ED[10]。由于在DM患者中T2DM占據絕大多數，約為90%~95%[11]，因此由T2DM所帶來的ED問題將日益突出，然而其發病機制迄今尚不清楚，現有的治療手段療效均不能令人滿意，所以有必要進一步對其發病機制進行研究，而建立動物模型是進行基礎研究的必備條件，故在本研究中主要探索T2DED模型的構建。

用于構建DED模型的動物主要有大鼠、小鼠、狗、猴、貓和兔等。其中大鼠由于具備易于購買和飼養、抗感染能力強、繁殖能力強、對性激素感受能力高等優點而應用最為廣泛。目前有關DED的研究較多采用的是T1DM大鼠模型，其造模方法已十分成熟，即用大劑量STZ（60~70mg/kg）腹腔注射進行誘導，因STZ可特異性損傷胰島β細胞，使胰島素分泌減少，從而引發糖尿病癥狀，這與T1DM所具備的胰島素絕對缺乏的特性相吻合。隨著T2DM患者人群急劇增長，人們開始將目光轉向T2DM及其并發癥的研究，這便對T2DM動物模型的構建提出了要求。迄今報道的T2DM模型主要分為兩類：一類是以遺傳因素占主導地位的模型，如肥胖Zucker大鼠、瘦素缺乏的肥胖ob/ob小鼠、KK小鼠[12]、自發性糖尿病GK-Wistar大鼠等，它們一般表現為類似于成人2型糖尿病的輕度高血糖、肥胖、高血脂等癥狀；另一類是利用小劑量STZ聯合高脂飼料喂養誘導的模型[13]。其中高脂飼料喂養可引起大鼠體內產生胰島素抵抗，而小劑量STZ則可進一步使胰島細胞輕度損傷，能夠更好地模擬人類2型糖尿病的發病過程，相對于第一類中以遺傳因素占主導的模型更為經濟，且易于復制以及飼養。因此在本研究中，我們擬采用該法建立T2DM模型。此外，對于STZ的使用劑量，目前尚沒有統一的標準。魏占英等[14]采取不同的高脂喂養時間及不同STZ注射劑量（分別為高脂喂養4周+STZ35mg/kg；高脂喂養4周+STZ38mg/kg；高脂喂養8周+STZ25mg/ kg；高脂喂養8周+STZ30mg/kg；高脂喂養10周+STZ25mg/kg）進行T2DM模型的構建，發現隨著高脂喂養時間和STZ注射劑量的增加，T2DM大鼠的成模率和死亡率均呈上升趨勢，而8周的高脂喂養時間聯合30mg/kg的STZ注射可同時具備高成模率及低死亡率以及血糖穩定等優點；程祎等[15]采用不同劑量的STZ（40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg）進行造模，結果發現40mg/kg組與60mg/kg組的成模率存在顯著差異，而60mg/kg組與80mg/kg組之間差異無統計學意義，認為注射60mg/kg的STZ為構建T1DM模型的最適劑量。結合上述已報道的1型和T2DM造模方法以及兩種類型糖尿病的病理生理過程，我們認為60mg/kg的劑量可造成胰島β細胞功能明顯損傷，符合T1DM的病理特點，而T2DM的胰島僅有輕度受損，因此在本實驗中我們擬采用半量30mg/kg作為STZ的注射劑量，目的是模擬胰島的輕度損傷過程，同時聯合高脂飼料喂養以使大鼠體內產生胰島素抵抗。

對于糖尿病后ED成模的時間點，目前尚沒有統一的標準。程祎等[15]認為利用APO篩選ED模型的最適時間應為糖尿病成模后2周；Qiu等[16]認為在糖尿病成模后第4周可作為DED研究的最適時間點。然而既往大多數研究多采用8~10周作為時限，程晨等[17]研究發現糖尿病發病后第8周大鼠的ED發生率達65.4%，滿足進一步實驗的需求。劉貴華等[18]在糖尿病后第10周進行APO實驗，其報道的ED成模率為68%。蘇宏偉等[19]分別研究了糖尿病成模后第8周、12周、16周的ED發生率，盡管第16周時大鼠成模率更高，但結合各時間點的成模率、死亡率以及實驗周期等問題，他們認為第8周可作為最適的研究時間點。在本研究中，我們以第8周作為研究時間點，對糖尿病大鼠的ED成模率以及ED篩選方法作進一步的驗證及研究。

目前用于評估模型動物勃起功能的方法主要有APO實驗以及ICP測定。APO是一種合成嗎啡衍生物，作為一種短效多巴胺受體激動劑，其可誘發中樞性勃起反應，同時不伴麻醉或鎮痛作用[20,21]。已有許多研究[5,22,23]利用APO實驗進行ED動物模型的篩選，采用的是頸部松弛皮膚下注射的方法，創傷小且為一過性效應，故經篩選合格的動物可直接進入下一階段的研究。但該方法需要一定的觀察時間，且受實驗者主觀感受的影響，只能作為ED評估的定性指標。ICP測定則可以直觀地反映動物陰莖海綿體壓力的變化，作為定量指標為ED的評估提供較為準確客觀的衡量標準[24]，但進行該操作時需對動物進行麻醉，操作結束后動物通常會犧牲，不利于進一步的研究。為了驗證APO實驗在ED篩選中的可靠性，我們同時進行了APO實驗以及ICP測定，發現對照組大鼠APO實驗100%陽性，而實驗組中陽性率為13.3%（2/15），實驗組中2只APO（+）大鼠所對應的ICP值分別為80.8mmHg和86.9mmHg，對應的ICP/MAP比值為0.48和0.5，達到正常大鼠水平，表明兩者的結果基本相吻合。然而，在實驗組大鼠中，我們還發現其中2只大鼠的ICP值接近60mmHg，ICP/MAP比值接近0.45，高于實驗組中ED大鼠的平均水平，但APO實驗結果卻為（-），分析其可能的原因包括：（1）此時大鼠勃起功能已然受損，但未達完全性ED的水平，而ICP作為一個定量指標，可以展現出這樣一種中間狀態。相反地，APO實驗是一個定性指標，結果只能為陽性或者陰性，從而導致了存在假陰性的可能；（2）也不排除由于觀察時間較短、實驗人員主觀因素等造成誤差的可能性，這有待后續實驗進一步研究驗證。

綜上所述，采用高脂喂養聯合小劑量STZ注射的方法可成功構建2型糖尿病性勃起功能障礙的大鼠模型，成模率較高，且具備經濟、穩定等優點，而利用APO實驗則可以有效地對ED動物模型進行篩選，從而為進一步的ED研究提供理想的模型。

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（2016-03-08收稿）

Establishment of type 2 diabetes mellitus rats model with erectile dysfunction*

Li Hao1△, Huang Zhansen1△, Hu Zhiming2, Qi Tao1,
Chen Diling3, Ying Ying4, Zhang Yu1, Zhang Bin1, Chen Jun1**
1. Department of Infertility and Sexual Medicine, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510630, China; 2. Department of Urology, Guangdong Meizhou People's Hospital; 3. Guangdong Institute of Microbiology; 4. Medical College, Shenzhen University

Chen Jun, E-mail: jchen121121@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the establishment method for type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats model with erectile dysfunction.MethodsThirty sprague -dawley rats were randomly divided into two groups. The rats in the control group (n=10) were fed with normal diet and the rats in experimental group (n=20) were fed with high fat diet. Eight weekslater, the rats in the experimental group were injected intraperitoneally with low-dose Streptozotocin (STZ, 30mg/kg), while the rats in the control group were given the same dose of vehicle citrate buffer. After seventy two hours, tail-vein blood were collected for monitoring blood glucose levels, and only rats with a random blood glucose level over 16.7 mmol/L were considered as T2DM rats model. Random blood glucose and body weight of the rats were examined every two weeks. On week 4, 8 after diabetes, intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) were analyzed. On week 8 after diabetes, apomorphine (APO) test was conducted and the intracavernosal pressure (ICP) of each rat was measured. When the measurement of ICP fnished, the serums of rats were collected. Serum triglycerides (TG), total cholesterol(TC), high density lipoprotein cholesterol（HDL - C), low density lipoprotein cholesterin（LDL - C) were measured.Results(1) Under high fat diet and low-dose STZ injection, seventeen rats with T2DM modeling in the experimental group were successfully established. Compare with that of the control group, the blood glucose level in the experimental group were elevated signifcantly on week 2, 4, 6, 8 after STZ injection (P<0.05). (2)IPGTT suggested that insulin resistance existed in diabetic rats and IPITT showed that insulin sensitivity of diabetic rats decreased. Compared with those of the control group, the contents of TG, TC, HDL-C, LDL-C were signifcantly increased in the experimental group (P<0.05). (3)APO test showed that rats in the control group had no ED, while 2 of 15 (2 rats were dead due to hyperglycemia) rats in the experimental group had penile erection. The max ICP of the experimental group rats were lower than that of the control group rats signifcantly (P<0.05).ConclusionType 2 diabetes mellitus rats model with erectile dysfunction were successfully established by high fat diet combined with low-dose STZ injection, and APO test was an effective and reliable method for ED model evaluation.

diabetes mellitus, type 2; erectile dysfunction; rats

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.006

R 698.1; R 587.1

資助：國家自然科學基金項目（編號：81370705，81471450）和廣東省科技計劃項目（編號：2013B021800204）的資助

**通訊作者，E-mail: jchen121121@hotmail.com

△為共同第一作者