煙霧暴露大鼠氧化應激生精損害的中醫藥治療實驗研究

翁治委周少虎*梁愛軍李 翎李堂林張淑婷

1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科（廣州 510405）;

2. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科實驗中心; 3.湛江市婦幼保健院男科

煙霧暴露大鼠氧化應激生精損害的中醫藥治療實驗研究

翁治委1周少虎1*梁愛軍1李 翎2李堂林3張淑婷1

1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科（廣州 510405）;

2. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科實驗中心; 3.湛江市婦幼保健院男科

目的研究補腎填精中藥麒麟丸對煙霧暴露造成氧化應激所致大鼠睪丸、附睪與精子的抗氧化作用。方法隨機將60只雄性成年大鼠均分6組：空白組、模型組、五子衍宗丸組、麒麟丸低劑量組、麒麟丸中劑量組、麒麟丸高劑量組。除空白組外，每天上午煙霧暴露制備大鼠睪丸生殖毒性模型，下午灌胃給藥，每周測量體質量，調整給藥劑量，連續56d后，處死大鼠取樣檢測，取血清測定睪酮（T）水平；分別稱取大鼠精囊腺、附睪、睪丸的質量并計算相應器官指數；留取附睪內精液，進行計算機輔助的精液分析（CASA）及精子DNA完整率分析；酶聯法測定睪丸谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平；睪丸附睪病理組織學檢查。結果模型組大鼠精子總活力[前向運動（PR）%+非前向運動（NP）%]顯著下降，睪丸附睪勻漿MDA水平（28.0±3.2）顯著升高，而SOD（13.2±2.0）、GSH-Px（21.1±8.3）明顯降低，與空白組相比均有顯著差異（P＜0.05）；麒麟丸各劑量組大鼠精子濃度及總活力比空白組下降，但仍顯著高于模型組（P＜0.05），MDA顯著低于模型組（P＜0.05），SOD及GSH-Px顯著高于模型組（P＜0.05）；麒麟丸中、高劑量組大鼠精子正常形態率及各劑量組DNA完整率顯著高于模型組（P＜0.05）。病理檢查：與空白組相比，模型組呈生精功能減低改變。表現為睪丸生精小管萎縮，排列變稀疏，生精上皮變薄，生精細胞減少；附睪管腔內成熟精子變少；精囊腺管腔內分泌物減少，上皮乳頭萎縮、數量減少。麒麟丸組與模型組相比，隨著劑量增加，生精功能減低的例數逐漸減少，療效與劑量間有依從關系。結論補腎填精中藥麒麟丸可通過提高抗氧化酶活性，抑制氧化應激的發生，起到抗氧化作用，同時可以修復煙霧暴露對睪丸、附睪、精囊腺造成的病理損傷，最終可以保護生精功能，提高精子濃度、總活力與正常形態率，降低精子DNA碎片率。

煙霧; 氧化性應激; 補腎填精; 麒麟丸

1979年Jones等[1]首次提出，人類精子對氧化脅迫特別敏感。生物體系中自由基活性氧（ROS）是維持正常生理狀態必要因素，同時，自由基也會對生物大分子造成不同程度的損傷，自由基過高或過低都會對機體產生損傷。少量持續的活性氧是精子受精、獲能等生理過程中所必需的；但過量活性氧造成氧化應激，會導致精子膜損傷，影響影響精子功能。氧化應激不僅影響精子膜流動性，而且損傷精子核DNA的完整性。研究表明，活性氧是男性不育的重要病因和病理因素[2]。因此，目前抗氧化藥物在男性不育治療中的應用在國內外均得到重視[3,4]。研究者發現吸煙與精液參數異常之間存在顯著相關性，例如，吸煙可致精子存活率下降、精子形態異常以及精子密度降低[5]。本研究通過煙霧暴露制備弱精子癥大鼠模型，研究補腎填精中藥麒麟丸對大鼠睪丸附睪與精子的抗氧化作用及對氧化應激所致睪丸、附睪、精囊腺病理損傷的保護作用，探討中醫藥對男性不育的作用機制。

材料與方法

一、臨床資料

1. 實驗動物：從南方醫科大學試驗動物中心選購SPF級Wistar大鼠，實驗動物許可證號：SCXK（粵）2011-0015。本室常規飼養一周后進入實驗。實驗地點：廣州中醫藥大學第一附屬醫院。環境設施合格證號：SYXK（粵）2013-0092。溫度：20~25℃，濕度：40%~70%。

2. 受試藥物：（1）麒麟丸，廣東太安堂藥業股份有限公司，批號：B20130601，臨床用量：6g/次，3次/d。大鼠等效劑量：1.69 g/kg；（2）陽性藥：五子衍宗丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：3035371，臨床用量：6g/次，2次/d。大鼠等效劑量：1.126 g/kg。

3. 主要儀器與試劑：Multiskan MK3酶標儀；Wellwash MK2洗板機；BX50型熒光顯微鏡；TP1020型生物組織自動脫水機；EG1140H型生物組織包埋機（德國LEICA）；RM2025型生物組織切片機（德國LEICA）；丙二醛、谷胱甘肽、過氧化物酶超氧化物歧化酶都購于南京建成生物工程研究所（批號分別是20130425、20130424、20130424）。

二、實驗方法

采用隨機分組、空白對照、模型對照的實驗研究方法。煙霧暴露制備大鼠睪丸生殖毒性模型：香煙產生煙霧，煙霧流向一個放有大鼠的自制小木箱（注：木箱大小為180cm×80cm×80cm，由兩部分組成，煙霧產生部分和暴露部分，見圖1、圖2），對大鼠進行煙霧暴露，香煙釋放速度為10支/30min，20支/d，分為2次，間隔10min，每天早上9:00開始實驗。

60只雄性wistar大鼠，體質量180~220g。隨機取10只大鼠為空白組，其余50只大鼠隨機均分為麒麟丸組包括低、中、高劑量3個組、五子衍宗丸組、模型組。麒麟丸高、中、低劑量分別為7、3.5、1.75倍等效劑量；五子衍宗丸組給藥劑量為3.5倍等效劑量；模型組和空白組給予等體積生理鹽水灌胃；每天上午9:00煙霧暴露制備大鼠睪丸生殖毒性模型，下午3:00灌胃給藥，每天一次，每周測量體質量，調整給藥劑量，連續56 d后，稱量，取材并進行相關指標檢測。

圖1 煙霧造模裝置

圖2 煙霧造模實況

三、 檢測方法

采集前晚禁食。老鼠稱量后進行以下操作。

1. 血清數據采集：水合氯醛麻醉下，腹腔靜脈采血。儲存于-20℃等待作睪酮（T）檢查。

2. 性腺采集：采血后，完整取出睪丸、附睪及附性腺并稱量。性腺器官指數=性腺質量/體質量×100%。1只睪丸、附睪、前列腺、輸精管取出后，用生理鹽水清洗，用濾紙沾干，立刻置于70%酒精中直到使用。其他睪丸組織保存于-70℃以便后面的谷胱甘肽和脂質過氧化檢測。

3. 精子評價：將一整只附睪尾切碎置于5mL生理鹽水中，搖晃10min，然后在室溫下孵化2min。精子活力評價在從附睪取標本后2~4min內進行。精子濃度和活力使用計算機輔助精子分析儀分析。

4. 精子畸形率分析：參考《關于精子畸形分型的參考意見》[6]。將上述稀釋精液，分別均勻涂片兩片后待其自然干燥，改良巴氏染色，干燥后立即顯微鏡觀察，同一標本的兩張涂片各觀察評估 100個精子，計算兩次評估油鏡下觀察頭、頸部和尾畸形的精子，畸形精子包括大頭、小頭、尖頭、無鉤、無定形、香蕉形、胖頭、雙頭頸彎曲、雙頸、雙尾、卷尾和短尾巴，無頭、無尾、折體、折尾精子未列入畸形類型統計，計算兩次評估畸形精子比例均值和誤差，確定誤差在可接受的范圍之內（95%可信區間），計算兩次結果取平均值。

5. DNA完整性評價：采用精子DNA碎片試劑盒法。具體操作按試劑盒使用方法。

6. 生化檢查：睪丸內谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測采用試劑盒法，具體操作按試劑盒使用方法。血清T采用免疫酶法。

四、統計學分析

采用SPSS 13.0統計分析軟件進行分析，所有數據資料以（x±s）或（%）表示，P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

結 果

一、與模型組比較

與模型組比較：麒麟丸各劑量組能提高模型大鼠睪丸內GSH-PX的水平；各劑量組同時能提高SOD的水平，并且各劑量組能降低MDA水平，差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）；各劑量組對大鼠血清T水平影響不大，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1；各劑量組對大鼠睪丸指數、附睪指數和精液囊指數影響不大，差異無顯著統計學意義（P＞0.05）（見表2）。各劑量組能增加精子濃度，但麒麟丸高、中劑量能顯著增加精子濃度（P＜0.05），各劑量組能提高精子總活力[前向運動（PR）%+非前向運動（NP）%]，中高劑量組能提高精子正常形態率；麒麟丸組精子DNA完整率顯著上升，差異具有統計學意義（P＜0.01）（見表3）。

二、形態學觀察麒麟丸對煙霧所致睪丸組織損傷的改善作用

與空白組相比，模型組呈生精功能減低改變。表現為睪丸生精小管萎縮，排列變稀疏，生精細胞減少，生精上皮變薄，腔內成熟精子變少；附睪管腔內成熟精子減少；精囊腺管腔內分泌物減少，上皮乳頭萎縮、減低。麒麟丸組與模型組相比，隨著劑量增加，生精功能減低的例數逐漸下降，療效與劑量間有依從關系。提示本實驗中麒麟丸對生精功能下降有一定的治療作用（圖3、圖4、圖5）。

表1 麒麟丸對模型大鼠睪丸GSH-PX、SOD、MDA和血清T的影響n=10）

表1 麒麟丸對模型大鼠睪丸GSH-PX、SOD、MDA和血清T的影響n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量(g/kg) GSH-PX MDA SOD T (nmol/L)空白組 - 31.6±8.3*19.8±5.9**18.3±3.4**5.04±0.74模型組 - 21.1±8.3 28.0±3.2 13.2±2.0 4.73±0.77五子衍宗丸組 3.94 30.6±5.7*20.1±8.7*18.7±3.3**5.10±0.36麒麟丸低劑量組 2.96 27.8±7.3 22.3±8.1 16.5±3.9 4.29±1.33*麒麟丸中劑量組 5.92 28.5±10.6 21.4±8.5*17.4±3.9*4.77±0.77麒麟丸高劑量組 11.83 29.9±3.2*21.4±5.6*17.7±4.8*5.06±0.61

表2 麒麟丸對睪丸指數、附睪指數和精囊指數的影響n=10）

表2 麒麟丸對睪丸指數、附睪指數和精囊指數的影響n=10）

注：與五子衍宗丸組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 睪丸指數 附睪指數 精囊指數空白組 - 0.488±0.030 0.190±0.018 0.365±0.047模型組 - 0.490±0.176 0.193±0.049 0.329±0.109五子衍宗丸組 3.94 0.527±0.063 0.187±0.017 0.353±0.050麒麟丸低劑量組 2.96 0.531±0.035 0.192±0.022#0.292±0.07麒麟丸中劑量組 5.92 0.541±0.037 0.212±0.015##0.412±0.059#麒麟丸高劑量組 11.83 0.458±0.208 0.178±0.057 0.351±0.09

表3 麒麟丸對模型大鼠精子參數的影響n=10）

表3 麒麟丸對模型大鼠精子參數的影響n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與五子衍宗丸組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 濃度(×106) PR(%) NP(%) 正常形態精子率(%) DNA完整率(%)空白組 - 16.18±10.34**47.1±9.7**7.74±4.16 94.8±3.3 96.0±1.6**模型組 - 10.62±9.00 23.4±11.7 6.03±1.73 93.1±1.3 92.3±1.8五子衍宗丸組 3.94 13.39±4.71*40.9±17.0*6.69±1.23 94.8±1.39*92.7±1.9麒麟丸低劑量組 2.96 11.59±6.98 32.9±8.6 4.81±2.08#91.7±2.8#94.3±1.3*麒麟丸中劑量組 5.92 15.63±8.36**40.6±10.3**9.59±3.41*95.3±1.8*95.0±2.0*#麒麟丸高劑量組 11.83 14.46±5.84**43.9±5.1**9.57±4.05 97.4±1.0**##94.8±2.2*

圖3 各組睪丸病理檢查圖例（HE染色10×20）

圖4 各組附睪病理檢查圖例（HE染色10×20）

圖5 各組精囊腺病理檢查圖例（HE染色10×20）

討 論

麒麟丸是目前有效治療男性不育的藥物之一，麒麟丸是在古方“五子衍宗丸”基礎上，承繼傳統中醫藥學“腎主生殖”理論研制。本研究中麒麟丸組大鼠睪丸附睪勻漿SOD、GSH-Px水平明顯高于模型組，而MDA水平顯著低于模型組；生精上皮較為完整，精子總活力優于模型組，中、高劑量組正常形態精子率也優于模型組，可見麒麟丸可增強生殖系統的抗氧化酶活性，拮抗氧化應激損傷，修復受損的生精上皮而保護生精功能，保護精子膜，提高精子總活力。

現代藥理研究證實枸杞所含枸杞多糖（LBP）能提高大鼠SOD水平[7]，而且能明顯抑制H2O2誘導的睪丸細胞損傷[8,9]；楊欣等[10]實驗發現菟絲子水提物可提高精子懸液SOD水平，降低MDA水平，通過其抗氧化作用干預ROS對精子膜的脂質過氧化反應；黨參多糖可以顯著降低體外培養的大鼠睪丸間質細胞MDA 的水平，并提高GSH-Px的水平[11]。

ROS是屬于自由基類的高度活躍的氧化物，主要包括H2O2、O2-、OH-、NO等自由基，能改變細胞功能，危及細胞存活。在正常情況下，ROS必須不停地被滅活，睪丸、附睪中僅保持一定程度受控的ROS以維持精子的生理功能。生殖系統中的抗氧化系統主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、各種過氧化物酶，如谷胱甘肽過氧化酶（GPX），過氧化氫酶（CAT）和其他血紅素蛋白過氧化物酶，其中SOD是機體內最重要的抗氧化酶，能清除O2-，可抵抗ROS對精子的毒性，對維持機體抗氧化系統平衡起著重要作用；SOD水平還與精子計數存在正相關關系[12]；GSH-Px通過其硫酸基團直接與過氧化氫、超氧化物陰離子及羥基反應，巰基基團可以和烷氧基、過氧化氫反應，對活性氧和組織產生的H2O2有較強的清除能力，有效保護細胞膜結構和功能的完整性。一旦這些相互保護系統中的某一成員減弱或減少，整個酶性保護系統就可能全線崩潰，導致不可逆性的細胞損傷[13]。

香煙煙霧里面包含有大量復雜的有害物質，包括尼古丁、一氧化碳、一些致癌物質以及致突變物質等，這些物質或其代謝產物可以出現在精漿中而引起生殖毒性，導致精子質量下降[14]。參考目前生殖系統氧化應激損傷的動物實驗方法[15]，本實驗發現香煙煙霧暴露（20支香煙，10支/30min，間隔10min）/d×9周，造成精液氧化應激：增加MDA和硫醇基（-SH）水平、增強SOD水平，損傷精子濃度、總活力和正常形態[16]，并能損傷精子DNA完整性[17]。

精子對過量ROS引起的損傷尤其敏感，這是因為其質膜含有大量的多聚不飽和脂肪酸（PUFA）以及胞質含有低濃度的ROS清除酶，細胞內的抗氧化酶并不能保護包圍在頂體和尾部的質膜，這就迫使精子依靠精漿提供的保護作用來補充其有限的自身抗氧化系統。生殖道內過量產生的ROS不僅破壞精子質膜的流動性，而且損傷精子核內DNA的完整性，會導致生精功能障礙，并對精子產生毒性作用，引起精子膜脂質過氧化，產生的過氧化脂質及其降解產物，如MDA等，使其形態、功能及代謝異常，從而導致男性不育[18,20]。還有證據顯示，過高水平的ROS介導損傷精子DNA，產生畸形精子，而且相互作用[21]。MDA是細胞膜脂質過氧化反應的終產物，可作為細胞氧化損傷程度的標志物，可反映體內自由基產生的程度。本實驗模型組大鼠睪丸附睪勻漿MDA水平（28.0±3.2）顯著升高，提示模型組大鼠睪丸附睪受到嚴重氧化損傷。

本研究結果表明，不同劑量麒麟丸組較模型組比較，麒麟丸組干預后精液前后觀察指標比較都有統計學意義（P＜0.05），提示補腎填精中藥麒麟丸能提高少弱精子癥大鼠的精子濃度、總活力和正常形態率，增強SOD、GSH-Px等抗氧化酶水平，降低精子DNA碎片率，降低睪丸附睪MDA水平，保護抗氧化酶系統，保護生精功能，這表明復方中藥能拮抗生殖系統的氧化應激損傷，為抗氧化治療男性不育癥提供了新的思路和途徑，筆者在之前的研究也證實了這一點[22]。復方中藥可能還存在免疫內分泌調節、抗感染、改善血液循環、補充微量元素等整體治療機制，本研究證實了補腎填精中藥麒麟丸能拮抗生殖系統的氧化應激損傷，也從一個側面證明了中醫藥治療男性少弱精子不育癥的有效性和科學性。

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（2016-03-18收稿）

Effects of traditional Chinese medicine on spermatogenesis damage of rats caused by cigarette smoke exposure

Weng Zhiwei1, Zhou Shaohu1*, Liang Aijun1, Li Ling2, Li Tanglin3, Zhang Shuting1
1. Department of Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 5104052, China; 2. Laboratory Center, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine; 3. Department of Andrology, Zhanjiang Maternity and Child Care Center

Zhou Shaohu, E-mail:zhoushaohu@vip.163.com

ObjectiveTo explore the antioxidant effects of Qilinwan, which was nourishing essence of kidney, on rat spermatogenesis damage caused by cigarette smoke exposure.MethodsSixty male rats were randomly divided into 6 groups such as the blank group, the control group, Wu Zi Yan Zong Pill group, low dose group, median dose group, high dose group. Except the blank group, the rats in other groups received cigarette smoke exposure in forenoon, intragastric administration in afternoon, weight every week and change medicine dose for 56 consecutive days, and then they were executed, and their serum samples were collected for testosterone level evaluation, and their testis, epididymis and seminalvesicle were weighed for index of the corresponding organs; Analysis of semen samples and DNA fragmentation were done; Levels of glutathione peroxidase (GSH-Px),superoxide dismutase(SOD) and malonaldehyde(MDA) in testis were detected by enzyme-linked immunosorbant assay; Pathological examination of testis and epididymis were performed.ResultsCompared to the blank group, sperm motility、concentration of SOD and GSH-Px in testis were decreased signifcantly, and MDA level in testis was increased signifcantly in the model group (P <0.05).Sperm concentration and motility were reduced in all treatment groups, but still higher than control group(P<0.05),MDA level in treatment groups was signifcant decreased Compared to control group(P<0.05),concentration of SOD and GSH-Px、normal sperm morphology and sperm DNA fragmentation in treatment groups signifcant increased Compared to control group(P<0.05).Histopathological analysis showed that:Compared to the blank group there is a reduction in spermatogenesis in control group, manifest as withered and aparse arranged in seminiferous tubule、thiner seminiferous epithelium、fewer spermatogenic cells; mature spermatozoa reduced in epididymis;fewer excretion、atrophy and number depletion of epithelial in seminal vesicle.Compared to the control, treatment groups put up a effect of measuring compliance, as the dose increasing, the cases of damaged spermatogenesis reducting.ConclusionHerb medicine Qilingwan may improve antioxidant enzyme activity, suppressed the production of reactive oxygen species, and repair pathology damage in testis, epididymis and seminal vesicle, ultimately improve normal sperm concentration and morphology, reduce DNA fragmentation.

smog; oxidative stress; reinforcing kidney su emission; qilin pill

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.003

R 698.2

*通訊作者, E-mail:zhoushaohu@vip.163.com