五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機理及效果

馮亞凈,張媛媛，王瑞鑫，李書國

(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊，050018)

?

五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機理及效果

馮亞凈,張媛媛，王瑞鑫，李書國*

(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊，050018)

摘要研究了五味子中的抗菌成分木脂素對食品中常見致病菌大腸桿菌的抑制作用及抑菌機理。采用牛津杯法測定抑菌圈直徑、倍比稀釋法測定最低抑菌濃度，評價了木脂素對大腸桿菌的抑菌效果；并通過測定微生物的生長曲線、電導率、耗糖率及掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)圖來推測、觀察抑菌機理。結果表明：木脂素對大腸桿菌有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑達27 mm，最低抑菌質量濃度為6.25 mg/mL；生長曲線的結果表明，木脂素可抑制大腸桿菌對數期的生長；電導率和耗糖率的測定及掃描電鏡表明，其抑菌機理之一是破壞了細菌細胞膜的平滑形態，內容物大量流出，造成代謝紊亂，影響對糖類等營養物質的吸收，從而發揮抗菌抑菌作用。

關鍵詞五味子；木脂素；抑菌效果；抑菌機理；食品安全

食品營養豐富，不但能夠為人體提供各種所需的營養物質，也為微生物的滋生和繁殖提供了優越的條件，食用腐敗變質的食品會導致食品安全問題，棄之則造成食物的資源浪費和經濟損失，因此食品的防腐保鮮是現代食品工業面臨的主要問題之一。在食品中添加適量的安全高效的抗菌劑、抑菌劑，是預防食品腐爛變質造成浪費和保證食品安全問題的主要措施。一般認為，食品防腐劑抑制微生物的機制主要是通過影響微生物的細胞亞結構，這些亞結構包括細胞壁、細胞膜以及與代謝有關的酶等，只要抑制其中一個亞結構，微生物就會被抑制甚至殺滅[1]。植物源食品防腐劑具有安全性高、來源廣泛、天然等優點，已成為食品防腐保鮮研究的熱點之一。

五味子FructusSchisandraeChinensis，始載于《神農本草經》，為木蘭科植物五味子(SchisandrachinensisTurczBaill)干燥成熟的果實[2]，廣泛分布在我國南部地區，是我國重要的藥用植物資源之一[3]，北五味子在一定的貯存條件下存放數年不發霉。前人的研究表明，五味子中有效的抗菌抑菌成分為木脂素類物質，主要以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等為代表[4-5]，是一類以 1，2，3，4-聯苯-1，3-環辛二烯為母核的木脂素，具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、保肝降酶、鎮痛以及免疫調節等作用[6-7]，還具有溫補、益氣、生津、護肝[8]、降糖[9]、減輕疲勞、改善心血管功能等保健作用?；谶@些已確定的藥理作用，五味子被廣泛應用于中藥制劑和中醫臨床中，目前對其研究也主要集中在成分分析和種類差異上[10]，而對其在食品中防腐保鮮的應用及抑菌機理的研究較少。若能將五味子提取物開發成為食品防腐劑，不僅能夠延緩食品的腐敗變質，而且還可利用其保健功能作用，對人體產生有益的影響。本文旨在研究五味子中木脂素提取物的抗菌抑菌作用及抑菌機理，以期為開發成天然、高效的植物源食品防腐劑、發揮五味子的保健功能和在食品工業的應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

五味子(FructusSchisandraeChinensis)：石家莊市神威大藥房；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉(生物試劑)：北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉(分析純)：天津市河東區紅巖試劑廠；蔗糖(分析純)：天津博迪化工股份有限公司；氯化鈉(分析純)：天津市恒興化學試劑制造有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市富宇精細化工有限公司；丙酸鈣、脫氫乙酸鈉(食用級)：石家莊市食品添加劑公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)：來源于河北科技大學微生物實驗室。

1.2主要儀器設備

手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YMSII-280B型)，寧波市鎮海金鑫醫療器械有限公司；恒溫恒濕培養箱(LHS-15 型)，上海一恒科學儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱(GZX-9070型)，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；回轉式恒溫調速搖瓶柜(YPW-I型)，上海通特電訊設備廠；快速提取儀(SZF-06A型)，上海新嘉電子有限公司；旋轉蒸發儀(RE52CS-1型)，上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計(UV-2000型)，上海尤尼柯儀器有限公司；場發射掃描電鏡(HITACHI S-4800-Ⅰ型)，日本Hitachi公司。

1.3實驗方法

1.3.1五味子木脂素的提取

五味子經60 ℃干燥2 h后粉碎，采用超聲波輔助乙醇提取的方法，在乙醇的體積分數為80 %、溫度85 ℃，超聲時間30 min，料液比1∶8的條件下回流提取2 h，得五味子木脂素提取液，經旋轉蒸發儀真空濃縮，冷凍干燥成粉，4 ℃冰箱密閉保存，備用。

1.3.2抑菌效果的測定

將大腸桿菌菌種活化后，用無菌生理鹽水稀釋，調整菌懸液濃度在107～108CFU/mL，備用。將木脂素粉末1.0 g溶于20 mL 體積分數80 %的乙醇中，制成濃度為50 mg/mL的抑菌液，以體積分數80 %的乙醇做對照，采用牛津杯法進行抑菌試驗，試驗重復3次。以體積分數80 %的乙醇配制相同濃度的化學防腐劑丙酸鈣、脫氫乙酸鈉為對照。將各平板置于恒溫恒濕培養箱中培養，溫度37 ℃，濕度80%，24 h，用十字交叉法計算平均抑菌圈直徑大小。

1.3.3最低抑菌濃度MIC的測定

采用倍比稀釋法，用體積分數80%的乙醇將木脂素稀釋成一系列濃度梯度的溶液，分別2 mL溶液加入到18 mL的培養基中，使得其終質量濃度為25，12.5，6.25，3.125，1.25，0.625，0.3125 mg/mL，倒入培養皿，待凝固后均勻涂布菌懸液各100 μL，37 ℃溫度培養48 h，每個濃度重復3次，觀察菌落生長狀況，無菌生長的最低濃度即為最低抑菌濃度。

1.3.4抑菌機理的研究

1.3.4.1五味子木脂素對大腸桿菌生長情況影響的測定

取14個試管分為兩組，分別依次編號為試驗組和對照組1～11號，分別在試管中加入8 mL液體培養基，高溫滅菌備用。試驗組11支試管中分別加入適量木脂素提取液使其終濃度為1.3.3中得到的最低抑菌濃度，菌懸液0.2 mL，對照組加入與試驗組等量的體積分數80%的乙醇溶液和菌懸液0.2 mL，置于恒溫培養箱中，37 ℃培養。將試驗組和對照組的試管按編號順序分別于0、2、5、9、12、15、20、25、30、33、36 h取出，振蕩均勻，于波長600 nm處測定吸光度值，根據OD值繪制出生長曲線。

1.3.4.2大腸桿菌菌懸液電導率的測定

用無菌水調節菌液濃度為107CFU/mL，移取1.5 mL菌液于50 mL燒杯中，加入30 mL去離子水和1.5 mL的1 MIC的木脂素溶液，然后分別在0、5、20、30、60、90、120、150和180 min時測定電導率，每次試驗重復3次；以添加1.5 mL體積分數為80%乙醇的組為對照。

1.3.4.3菌體消耗糖量的測定

根據蒽酮比色法[11]測定培養液中糖含量。添加適量提取液到活化的菌液中，適宜條件培養，每隔2 h取上清液100 μL，稀釋至1 mL，冷水浴5 min后，加入4 mL蒽酮試劑并搖勻，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫并靜置1 min，在620 nm處測吸光度值，記錄數據并計算含糖量；以不添加五味子木脂素提取液為對照。

1.3.4.4菌體形態觀察

為進一步確定抑菌機理是否為破壞細菌細胞的結構，采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察菌體形態。大腸桿菌接種于液體培養基中，37 ℃條件下培養12 h(濃度調整為1 ×107CFU/mL)。取10 mL 菌懸液分別加入0 MIC、1 MIC濃度的木脂素溶液，所有樣品均培養4 h。取出菌液用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)清洗3次，2.5%戊二醛溶液在4 ℃條件下固定過夜。梯度濃度的酒精溶液(30%、50%、70%、80%、90%、100%)逐級脫水，每次20 min，離心(8 000 r/min，5 min)，棄上清液，100%乙醇脫水2次。叔丁醇置換酒精2次，每次20 min，干燥，離子濺噴金，上SEM 觀察。

1.3.5數據統計分析

以上測定均為3組平行，結果以平均值±標準差方式表示。利用spass17.0軟件進行數據統計計算，采用單因素方差分析(ANOVA)進行顯著性差異分析(P<0.05)，文中的數據圖均利用OriginLab Origin V8.0處理完成。

2結果與討論

2.1五味子木脂素的抑菌效果

由圖1可知，體積分數80%乙醇對照對其抑菌圈直徑為8 mm，添加50 mg/mL的五味子木脂素提取物對大腸桿菌的平均抑菌圈大小為27 mm，而相同濃度的化學防腐劑脫氫乙酸鈉和丙酸鈣的平均抑菌圈直徑分別為24 mm、14 mm，二者對大腸桿菌的抑菌效果均低于五味子木脂素提取液，說明五味子木脂素對大腸桿菌具有顯著的抑制作。

a-木脂素提取液;b-體積分數80 %乙醇對照；1-五味子木脂素提取液;2-脫氫乙酸鈉溶液;3-丙酸鈣溶液圖1　五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌效果Fig.1　Antibacterial effect of lignanoid against E. coli

2.2五味子木脂素對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)

由表1可知，五味子木脂素提取液對大腸桿菌的最低抑菌質量濃度為6.25 mg/mL，表明低濃度的木脂素溶液仍然可以表現出抑菌活性。

表1　大腸桿菌最低抑菌濃度(MIC)

2.3抑菌機理的探討

2.3.1五味子木脂素對大腸桿菌生長的影響

通過測定添加五味子木脂素的菌懸液(濃度為107～108CFU/mL)在波長為600 nm 處的吸光值來判斷抑菌效果，吸光值越小，活菌的數量越少，抑菌效果越好。

由圖2可知，未添加五味子木脂素的大腸桿菌生長良好，具有典型的生長曲線特征，而加入提取物試驗組的OD值位于未添加組下方，且五味子木脂素在對數期即發揮抑菌作用，大腸桿菌的生長受到抑制，對數期延后，不再符合正常大腸桿菌的生長趨勢，在12 h后微生物呈緩慢增長的趨勢。結果說明五味子中的木脂素類物質能夠明顯抑制大腸桿菌的生長繁殖，但不能殺死大腸桿菌，作用一定的時間后抑制作用會減弱或消除，分析可能是由于抑菌物質濃度的下降或者微生物適應了新的生長環境，故大腸桿菌出現了短暫的二次生長。

圖2　木脂素對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.2　Influence of lignanoid on growth curve for E. coli

2.3.2五味子木脂素對大腸桿菌菌液電導率的影響

五味子木脂素的乙醇提取液對大腸桿菌菌液電導率的影響結果如圖3所示。

圖3　木脂素對大腸桿菌菌液電導率的影響Fig.3　Influence of lignanoid on the electrical conductivity of E. coli

由圖3可知，添加五味子木脂素提取物菌液的電導率明顯高于空白組，在5 min時的電導率明顯升高，5 min以后增加緩慢，整體上呈上升的趨勢，而空白組幾乎保持不變。電導率是衡量溶液中離子強度高低的一個特征參數，其值與離子組分濃度密切相關。菌體的保護屏障是細胞膜，當遇到強抑菌劑時會使細胞膜遭到破壞，菌體的保護屏障被打破，其內部的電解質外泄至溶液中，從而使電導率上升，因此菌液電導率的變化可以反映細胞膜通透性的變化[12]。圖3結果說明了五味子乙醇提取液中的抗菌抑菌成分木脂素對大腸桿菌的抑制作用機理之一可能是通過破壞其細胞膜，使細胞的通透性增加，內容物大量滲出而達到抗菌的目的。也有可能是菌體在代謝過程中產生小分子物質而導致電導率變化。

2.3.3五味子木脂素對大腸桿菌糖消耗量的影響

為了驗證是否為細胞膜結構破壞導致菌液電導率上升，對菌體消耗糖的代謝進行了觀察，結果如圖4所示。

圖4　木脂素大腸桿菌培養液中糖消耗的影響Fig.4　Influence of lignanoid on the consumption of sugar of E. coli

由圖4可知，加入五味子木脂素提取液處理的菌液，其糖濃度較空白組明顯下降，反應10 h時，兩者濃度相差4倍，從而可判斷五味子木脂素對菌體的抑

制作用，一方面可能是先破壞細胞的微結構從而影響菌體的代謝和繁殖，另一方面也有可能是限制和阻礙了菌體對糖利用吸收的新陳代謝，通過破壞大腸桿菌的代謝達到抑菌作用。因為糖作為微生物生長所需的碳源和首要的能量儲備物質，對微生物的生長和繁殖有很大的相關性。當微生物處于正常生長狀態時，會吸收和利用外源糖，微生物對培養液中糖的消耗越多，說明生長越旺盛，當微生物的吸收代謝受阻或死亡時，其對糖的利用率會下降。

2.3.4不同處理情況下大腸桿菌的形態變化

為了進一步驗證五味子木脂素對細胞膜結構的破壞作用，通過掃描電鏡觀察大腸桿菌的形態變化，結果如圖5所示。

圖5　不同處理下大腸桿菌SEM圖Fig.5　SEMs of different treatments on E. coli 注：A為正常大腸桿菌的形態(× 8 k)，B、C、D為五味子木脂素處理過的大腸桿菌的形態(依次為：×8 k、×20 k、×35 k)

由圖5可知，正常的大腸桿菌菌體細胞完整、飽滿，表面光滑，分布均勻；而經過五味子木脂素提取液處理4 h后的大腸桿菌形態遭到破壞，聚集粘連。圖5(C)可以看出，菌體細胞表面褶皺不光滑，菌體形態發生變形，部分菌體發生裂解死亡；圖5(D)中可以明顯的看出菌體形態的扭曲變形，個別有孔洞出現。木脂素具有疏水性，可以透過細胞壁，大腸桿菌菌體細胞發生的形態變化說明五味子中的抗菌抑菌成分破壞了細胞膜的平滑形態，在細胞膜上形成孔洞，使菌體細胞破裂，內容物滲漏，細胞代謝發生紊亂，從而發揮抗菌抑菌的作用。掃描電鏡圖從形態學方面證實了五味子的抑菌機理，與以上從電導率變化這一生理角度的抑菌 機理推測一致。

3結論

(1)五味子木脂素對大腸桿菌有顯著的抑制作用，其在50 mg/mL濃度下的平均抑菌圈大小為27 mm，優于化學防腐劑。

(2)五味子木脂素的最低抑菌質量濃度MIC為6.25 mg/mL。

(3)五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機理主要是對細胞膜結構造成破壞作用，使細胞膜的平滑形態變得褶皺，細胞凹陷變形，甚至破損，影響菌體對糖等營養物質的吸收代謝，使菌體的生長繁殖受到阻礙和抑制。

參考文獻

[1]郭新竹,寧正祥,胡新宇,等.食品防腐劑作用機理的研究進展[J].食品科技,2001,22(5):40-42

[2]史琳,王志成,馮敘橋.五味子化學成分及藥理作用的研究進展[J].藥物評價研究,2011,34(3) : 208-211

[3]鄧白羅,謝碧霞,劉暉,等.南五味子的地理分布與園林應用[J].中南林業科技大學學報,2009,29 (5):184-186

[4]LI Xin-ying,YANG Mei,HUANG Jie-yun,et al.Preparative separation and purification of deoxyschizandrin from Schisandrae Sphenantherae Fructus by high-speed counter-current chromatography[J].Journal of Pharmaceutical Analysis, 2013,3(6):429-433

[5]RADOSLAW J. E,AGNIESZKA S,HALINA E,et al.Analysis of lignans inSchisandrachinensisfruits, leaves, biomasses frominvitrocultures and food supplements[J]. Journal of Functional Foods,2013(5):1 576-1 581

[6]YE Chun,HAN Na,TENG Fu-kang,et al.Extraction optimization of polysaccharides ofSchisandraefructusand evaluation of their analgesic activity[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013(57):291-296

[7]LI R T,SUN H D.Studies on the chemical constituents and bioactivities of five Schisandra medicinal species andElsholtziabodinieri[J].Journal of the Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,2008,25(4):569-575

[8]YUNA Takimoto,HAI-YAN Qian,EMI Yoshigai,et al.Gomisin N in the herbal drug gomishi (Schisandrachinensis) suppresses inducible nitric oxide synthase gene via C/EBPβ and NF-κB in rat hepatocytes[J]. Nitric Oxide,2013,28:47-56

[9]DAE Young Kwon,DA Sol Kim,HYE Jeong Yang,et al.The lignan-rich fractions of Fructus Schisandrae improve insulin sensitivity via the PPAR-γpathways ininvitroandinvivostudies[J]. Journal of Ethnopharmacology,2011(135):455-462

[10]應國清,俞志明,單劍鋒,等.北五味子有效組分的研究進展[J].河南中醫，2005,25(6):84-87

[11]李麗萍,紫莖澤蘭提取物對細菌的抑制作用及抑菌機理的研究[D].北京:北京林業大學,2010

[12]趙淑艷,呼世斌,吳煥利,等.山茱萸提取物抑菌活性成分穩定性的研究[J].食品科學,2008,29(1):98-101

Antibacterial effect of Lignanoid fromFructusSchisandraechinensison theEscherichiacoliand its mechanism

FENG Ya-jing, ZHANG Yuan-yuan, WANG Rui-xin, LI Shu-guo*

(Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)

ABSTRACTThe inhibitory effect of the lignanoid from Fructus Schisandrae chinensis on the common pathogenic bacteria in food and its mechanism were studied. Diameter of inhibition zone (DIZ) and minimum inhibition concentration (MIC) were measured to describe antibacterial activity of lignanoid. More attention was emphasized on the mechanism of antibacterial action against Escherichia coli by scanning electron microscope (SEM) observation and measurement of growth curve, electrical conductivity, and sugar consume. Results showed that DIZ for Escherichia coli reached 27 mm and MIC was 6.25 mg/mL. Bacterial growth curve showed that lignanoid inhibited bacterial growth. In addition, the results showed that one of its antibacterial mechanisms was that it influenced the metabolism and played an antibacterial role due to destruction of the cell membrane of bacteria and leakage of a large number of contents.

Key wordsFructus Schisandrae chinensis; lignanoid; antimicrobial activity; antimicrobial mechanism;food safety

收稿日期：2015-09-17，改回日期：2015-10-16

基金項目：河北省科技支撐計劃項目(14227121D)；河北省大學生創新創業訓練項目(201310082045)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602013

第一作者：碩士研究生(李書國教授為通訊作者，E-mail:lishuguo602@126.com)。