食用菌液態發酵產酶特性及其對豆渣中膳食纖維含量的影響

趙哲，楊潤強，顧振新

(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)

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食用菌液態發酵產酶特性及其對豆渣中膳食纖維含量的影響

趙哲，楊潤強，顧振新*

(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)

摘要研究了杏鮑菇(韓杏1號)、平菇(天達630)、香菇(香菇939)、珍珠菇(球香菇)和秀珍菇(夏豐1號)液態發酵產酶及其對豆渣中膳食纖維含量變化的影響。結果表明，這5種食用菌在豆渣液體培養基中生長8 d后，其生長和產酶特性差異顯著，其中平菇生長快、蛋白質利用率高，同時具有較高的C1酶(外切葡聚糖酶)活性和較低的Cx酶(內切葡聚糖酶)及βG酶(β-葡萄糖苷酶)活性，發酵后培養基中可溶性膳食纖維(soluble dietary fibre,SDF)含量達到20.49%，是原料中SDF含量的4.39倍，顯著高于其余4種食用菌。

關鍵詞食用菌；液態發酵；豆渣；膳食纖維

在制作豆制品時產生的豆渣中，干物質含量占大豆質量的16%～25%[1]，我國每年有2 000多萬噸濕豆渣排放[2]。豆渣富含膳食纖維、蛋白質、脂肪、維生素及黃酮等物質。膳食纖維(dietary fibre, DF)中的可溶性膳食纖維(soluble dietary fibre, SDF)和不可溶性膳食纖維(insoluble dietary fibre, IDF)對人體的生理作用不同[3]。SDF具有防止膽結石、排除體內有害金屬離子、防止糖尿病、降低血清及膽固醇、防止高血壓和心臟病等作用[4]，IDF則對肥胖癥、便秘、腸癌等有效[5]。因此，SDF在DF中的比例影響生理作用。豆渣DF含量為50%～55%，其中SDF含量約為6%[6]。Richard和Donald建議平衡的DF組成要求SDF占DF總量的10%以上[7]。目前已利用生物發酵法獲得蘋果渣膳食纖維[8]和藕渣膳食纖維[9]等。

平菇、香菇、杏鮑菇、秀珍菇等食用菌在我國廣為栽培，其生物學特性與栽培技術已有大量報道[10]，而產酶特性鮮見報道。食用真菌在生長過程中會生產復雜的酶系，其中包括蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶(內切葡聚糖酶(纖維素Cx酶)、外切葡聚糖酶(纖維素C1酶)和β-葡萄糖苷酶(βG酶))。在以上多種酶的協同作用下，豆渣蛋白和淀粉被逐步利用，纖維素被釋放出來，同時IDF被纖維素酶水解為SDF和纖維二糖。

本文利用杏鮑菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇等常見食用菌對豆渣進行發酵，探討發酵過程中這五種食用菌關鍵酶活性、發酵液中主要成分以及經發酵后膳食纖維含量變化，旨在為食用菌發酵豆渣制備膳食纖維提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

杏鮑菇(Pleurotuseryngii，韓杏1號)、平菇(Pleurotusostreatus，天達630)、香菇(Lentinusedodes，香菇939)、珍珠菇(Flammulinavelutiper，球香菇)、秀珍菇(Pleurotusgeesteranus，夏豐1號)均購自南京市高淳區食用菌研究所。

1.1.2原料

新鮮豆渣(由蘇州金記食品有限公司提供)于50 ℃烘干后粉碎，過50目篩。

1.1.3培養基

斜面及平板培養基：采用PDA培養基(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，自然pH)。

種子培養基：采用PD液體培養液(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH)。

豆渣培養基(發酵培養基)：新鮮豆渣瀝水后于50 ℃烘干打粉，加水配置30g/L的料液，經膠體磨5 000 r/min條件下勻漿處理5 min獲得豆渣培養基，自然pH。

豆渣固體培養基：豆渣培養基添加1.5%瓊脂，灌注于平皿。

培養基采用濕熱滅菌法滅菌，在121℃下滅菌20 min。

1.1.4試劑

牛血清白蛋白，美國sigma公司；羧甲基纖維素鈉、D-水楊苷、葡萄糖、可溶性淀粉，上海國藥集團化學試劑有限公司；酸水解酪蛋白，上?？笊锛夹g有限公司；無水乙醇，廣東光華科技股份有限公司。

1.1.5儀器與設備

UV 5100B型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；HH-S2數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；JA2003電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；PHSJ-5型實驗室pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1發酵種子液的制備

將菌種接種至裝有PDA培養基平板中央，于25℃培養12 d；用直徑8 mm打孔器取4片菌絲體接種于裝有50 mL PD培養基的250 mL三角瓶中，于25℃條件下120 r/min旋轉振蕩培養8 d，培養液在無菌條件下勻漿處理即得發酵種子液。

1.2.2液態發酵

將發酵種子液以10%(v/v)的接種量接種至裝有50 mL豆渣培養基的250 mL三角瓶中，于25℃下80 r/min旋轉振蕩培養8 d，各菌種均設3個重復。

1.2.3生長速度測定

將菌種分別接種至裝有PDA培養基和豆渣固體培養基平板中央，于25 ℃培養8 d；用游標卡尺測量菌落直徑，計算平均生長速度(mm/d)。

1.2.4酶活性測定

粗酶液制備：發酵液于4 ℃、10 000 r/min冷凍離心15 min，上清液即為粗酶液。

淀粉酶活性測定參照文獻[11]；蛋白酶活性測定參照文獻[12]；纖維素C1酶活性測定參照文獻[13]；纖維素C酶活性測定參照文獻[14]；纖維素βG酶活性測定參照文獻[15]。

1.2.5膳食纖維含量測定

豆渣原料直接取樣，發酵樣品于10 000 r/min離心后獲得發酵上清液和發酵殘渣，其中SDF由上清液中SDF和發酵殘渣SDF中組成。

IDF及SDF：參照謝碧霞等[16]方法，以上均以干基計。

膳食纖維分IDF及SDF按式(1)計算百分含量。

(1)

1.2.6其他指標測定

水分含量：直接干燥法(GB 50093—2010)；淀粉含量：酸水解法(GB/T 5009.9—2008)；還原糖含量：3,5-二硝基水楊酸法[17]；粗蛋白含量：微量凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)；粗脂肪含量：索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003)；灰分：總灰分測定(GB 5009.4—2010)；pH測定：用pH測試儀測定。

1.2.7數據統計與分析

實驗設3次重復，采用SAS 9.2統計軟件進行分析。結果數據用均數±標準差(x±s)表示，不同組之間差異性采用one-way ANOVA方法進行比較，P<0.05表示差異顯著。

2結果與分析

2.1豆渣中主要成分

如表1所示，豆渣中IDF含量最高，其次是蛋白質和脂肪，礦物元素含量較豐富，淀粉含量最少。研究表明豆渣中營養成分均衡，其碳源、氮源和礦質元素適宜微生物生長[18]。

表1　豆渣主要化學成分含量

2.2菌體生長速度及其膳食纖維含量

由表2可見，杏鮑菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇在豆渣培養基中生長良好。其中，杏鮑菇、香菇和珍珠菇在豆渣培養基中的生長速度大于PDA培養基中；平菇的生長速度最快，并且在豆渣培養基中生長速度與PDA培養基中無顯著差異；而秀珍菇在豆渣培養基中生長速度小于PDA培養基。

表2　菌株在不同培養基中的生長速度

注：同列小寫子母不同表示差異顯著(P< 0.05)。

2.3發酵過程中酶活性變化

2.3.1淀粉酶活性

由表3可知，菌體在利用豆渣培養基發酵過程中體現出不同的淀粉酶活性。其中杏鮑菇和秀珍菇發酵生成淀粉酶活性最低，其最高點分別出現在發酵第2 天和第4 天；平菇、香菇在發酵過程中淀粉酶活性最高，分別于發酵第6 天和第8 天時達到最高。淀粉被水解生成單糖、二糖、三糖和短鏈糊精等被菌體利用。本研究旨在利用菌體發酵產生的酶水解DF以外物質，以提高DF的產量和品質。

表3　發酵過程中食用菌淀粉酶活性　單位：mU/mL

注：同列小寫子母不同表示差異顯著(P< 0.05)。

2.3.2蛋白酶活性

5種食用菌菌絲體在以豆渣為培養基生長時，生成的蛋白酶活性顯著不同(表4)。其中以香菇產生蛋白酶的能力為最強；其次為杏鮑菇和珍珠菇；平菇和秀珍菇蛋白酶活性相對較低，其中平菇在發酵前期蛋白酶活性較高，而秀珍菇在發酵中后期蛋白酶活性較高，并保持相對穩定的狀態?？梢?，5種食用菌均具有分解豆渣中蛋白質的能力。

表4　發酵過程中食用菌蛋白酶活性 　　單位：mU/mL

注：同列小寫子母不同表示差異顯著(P< 0.05)。

2.3.3纖維素C1酶活性

由表5可知，5種食用真菌生成纖維素C1酶的情況顯著不同，并且C1酶活性峰值出現時間也大不相同。珍珠菇生成C1酶活性最大值出現在第2 天，隨后逐漸下降；香菇生成C1酶在發酵第4天出現最大值，隨后逐漸下降；杏鮑菇、平菇及秀珍菇生成C1酶活性隨發酵時間逐漸升高，在第6天達到最大，隨后呈下降趨勢；其中，平菇在第2、4、6 天的C1酶活性均高于其它四種食用真菌(發酵第2天的珍珠菇除外)，第6天達到最大值；杏鮑菇生成C1酶活性次之；以秀珍菇生成C1酶活性為最低。

表5　發酵過程中食用菌纖維素C1酶活性 　單位：mU/mL

注：同列小寫子母不同表示差異顯著(P< 0.05)。

2.3.4纖維素Cx酶活性

纖維素Cx酶也被稱為內切葡聚糖酶，主要作用于纖維素的末端，隨機水解纖維素生成纖維二糖。5種食用真菌生成纖維素Cx酶的活性差異顯著(表6)。香菇、珍珠菇和秀珍菇生成纖維素Cx酶活性較低，其中秀珍菇最低；杏鮑菇和平菇生成纖維素Cx酶活性較高，又以杏鮑菇最高，其次是平菇。兩種菌的纖維素Cx酶活性均先隨發酵時間的延長而升高，發酵后期逐漸下降。

表6　發酵過程中食用菌纖維素Cx酶活性 　單位：mU/mL

注：同列小寫子母不同表示差異顯著(P< 0.05)。

2.3.5纖維素βG酶活性

纖維素βG酶又被稱為β-葡萄糖苷酶，其主要作用是將纖維二糖水解為葡萄糖。五種食用真菌生成纖維素βG酶的活性差異顯著，但各食用真菌的纖維素βG酶隨發酵時間延長的變化趨勢極其相似(表7)?？梢?，香菇和珍珠菇的纖維素βG酶較高，又以珍珠菇最高；杏鮑菇、平菇和秀珍菇纖維素βG酶活性較低。

表7　發酵過程中食用菌纖維素βG酶活性　單位：mU/mL

注：同列小寫子母不同表示差異顯著(P< 0.05)。

2.4發酵過程中主要成分變化

2.4.1可溶性蛋白含量變化

大豆中蛋白質含量高達35 g/100 g，加工后的豆渣中蛋白質含量仍高達17.28 g/100 g(見表1)，其中部分為可溶性蛋白。在食用真菌發酵作用下，蛋白質被水解為多肽、氨基酸等供菌體生長利用。五種食用真菌在發酵過程中培養基中可溶性蛋白質含量變化存在顯著差異(圖1)。香菇及珍珠菇對可溶性蛋白質利用能力最強，經發酵后培養基中可溶性蛋白含量最低；杏鮑菇和平菇次之；秀珍菇最弱。蛋白質作為主要氮源被真菌利用有利于菌絲體生長，并且蛋白質水解有利于提高膳食纖維品質。

圖1　發酵過程中可溶性蛋白含量變化Fig.1　Change of soluble protein content during fermentation

2.4.2游離氨基酸含量變化

培養基中的游離氨基酸主要來源于豆渣蛋白質水解，其含量處于蛋白水解生成和被微生物利用的動態變化中(圖2)。發酵初期，在菌體蛋白酶作用下氨基酸開始生成，含量顯著增加；隨著菌體的快速生長，游離氨基酸被菌體利用，其含量趨于平緩；其中，以平菇發酵第4天游離氨基酸含量最高，香菇最低；發酵結束后，游離氨基酸含量由高至低依次為：平菇、秀珍菇和珍珠菇、香菇及杏鮑菇。

圖2　發酵過程中游離氨基酸含量變化Fig. 2　Change of free amino acids content during fermentation

2.4.3還原糖含量變化

培養基中的還原糖主要來源于豆渣中纖維素，同樣處于水解生成和被微生物利用的動態變化中(圖3)。隨著菌絲體的生長，還原糖開始生成，其中，珍珠菇在發酵第2～6 天水解生成大量還原糖，第6 天達到最大值；香菇、平菇和杏鮑菇發酵過程中還原糖含量呈現緩慢增加趨勢；秀珍菇在發酵初期還原糖增加，2 天后開始下降并趨于平緩；發酵結束后，還原糖含量由高至低依次為：珍珠菇、香菇、平菇、杏鮑菇和秀珍菇。

圖3　發酵過程中還原糖含量變化Fig.3　Change of reducing sugar content during fermentation

2.5發酵后膳食纖維含量

如表8所示，經食用菌發酵后的豆渣培養基中膳食纖維含量發生顯著變化。其中IDF含量經發酵后都顯著低于未發酵樣品(IDF含量為45.50 g/100 g，見表1)，SDF含量均顯著高于未發酵豆渣(SDF含量為4.67 g/100 g，見表1)。其中，以平菇發酵后培養基中SDF含量最高，為豆渣原料中的4.39倍。食用菌生長過程中會生成復雜的纖維素酶系包括纖維素C1酶、Cx酶、βG酶等，在這些酶的作用下，IDF被分解利用，生成單糖、寡糖等小分子糖類供菌體生長所需，在該過程中SDF含量有所增加；并且單糖等小分子糖類被微生物利用后同樣會生產菌體多糖，進一步提高了SDF的含量。

表8　發酵后膳食纖維含量

3討論

食用菌生長過程中會產生復雜的酶系統，包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等，用以降解淀粉、蛋白質和纖維素等營養物質，為自身生長等生理活動提供底物。周健等[19]研究得出，靈芝等4種食用菌瓶在以玉米粉、黃豆粉為主要原料的培養基中搖瓶培養5～10 d后，培養基中總糖含量降低，還原糖呈現先上升后降低趨勢，游離氨基酸含量升高，同時菌絲干重呈現上升趨勢。隨著菌絲生長，培養基中淀粉、蛋白質等主要營養物質被菌體產生的酶系統水解，供自身生長所需。本實驗結果表明，平菇等食用菌發酵過程中，培養基中可溶性蛋白含量呈下降趨勢、游離氨基酸及還原糖含量呈上升趨勢，且差異顯著。莊慶利等[20]對三個平菇品種培養過程中胞外酶活性變化進行了研究，結果表明，平菇培養過程中羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、淀粉酶等胞外酶活性與菌絲體生長速度具有顯著正相關，與其他研究者對姬松茸(Agaricusblazei)、金頂側耳(Pleurotuscitrinopileatus)、香菇(Lentinusedodes)等食用菌的胞外酶活性研究結果相似[21]。

食用菌生長過程中最關鍵的酶系統為纖維素酶系。普遍認為，纖維素轉化為葡萄糖是纖維素酶各組分協同作用的結果。關于纖維素酶各組分之間的協同作用，一種觀點認為，首先由C酶在纖維素分子內部的無定形區進行酶切產生新的末端，然后由C1酶以纖維二糖為單位由末端進行水解，每次切下1 個纖維二糖分子，最后由βG酶將纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖水解為葡萄糖；另一種觀點則認為，首先是由C1酶水解不溶性纖維素生成可溶性的纖維糊精和纖維二糖，然后由C酶作用于纖維糊精生成纖維二糖，再由βG酶將纖維二糖分解成2個葡萄糖[22]。這種協同作用方式也決定了纖維素酶表達調控的復雜性。掌握纖維素酶各組分間協同作用機理對于菌種篩選具有指導性的意義。

4結論

豆渣經杏鮑菇、平菇、香菇、珍珠菇和秀珍菇液態發酵后，DF均得到一定程度的水解，SDF含量提高，其中，以平菇發酵后培養基中SDF含量最高，香菇和秀珍菇次于平菇，這與發酵過程中平菇具有較高的C1酶活性和較低的C酶及βG酶活性有關。因此，平菇是豆渣DF改性的理想食用真菌。

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Enzymes produced by liquid state fermentation of edible fungi and their effects on the main nutrients of soybean okara

ZHAO Zhe，YANG Run-qiang，GU Zhen-xin*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

ABSTRACTThe enzymes produced by liquid state fermentation of edible fungi and their effects on the main nutrients of soybean okara were studied. Results showed that there were statistically significant differences in the growth speeds and enzyme properties among different edible fungis. Pleurotus ostreatus had fast growth rate and high protein availability, as well as higher activity of exo-1,4-β-D- glucanase, lower activity of endo-1,4-β-D- glucanase and β -1, 4-D-glucosidase. The content of SDF reached 20.49%, which was 4.39 times higher than that in soybean okara and significantly higher than those from the other four kinds of edible fungis.

Key wordsedible fungi; liquid state fermentation; soybean okara; dietary fibre

收稿日期：2015-09-25，改回日期：2015-11-09

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602019

第一作者：碩士研究生(顧振新教授為通訊作者，E-mail:guzx@njau.edu.cn)。