化痰活血方對實驗性高脂血癥大鼠的研究

朱志剛　姚映芷

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·論著·

化痰活血方對實驗性高脂血癥大鼠的研究

朱志剛姚映芷

210023南京中醫藥大學基礎醫學院中藥學教研室[朱志剛(碩士研究生)、姚映芷]

【摘要】目的研究化痰活血方對實驗性高脂血癥大鼠的影響。方法通過建立高脂血癥大鼠模型，灌胃給予化痰活血方(荷葉、海藻、決明子、三七、丹參、姜黃)2659.5 mg/(kg·d)，給藥4周，測定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)，計算動脈粥樣硬化指數(AI)和TC/HDL-C，并做肝組織病理切片。結果化痰活血方能降低血清TC、TG、LDL-C的含量及CRP、AI指數、TC/HDL-C比值、AST、ALT。結論化痰活血方對高脂血癥大鼠血脂水平具有一定的調節作用，對高脂血癥引起的肝功能損傷具有改善作用，且較阿托伐他汀不會引起肝功能損害。

【關鍵詞】化痰活血方；高脂血癥；大鼠實驗

隨著現代生活水平的提高，心血管疾病的發病率和死亡率一直呈上升趨勢，而高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)是導致動脈粥樣硬化及心血管疾病的最危險因素之一，嚴重威脅著人類的健康[1-2]。高脂血癥是指血清中總膽固醇、甘油三脂或低密度脂蛋白過高或高密度脂蛋白過低的一種常見而多發的全身代謝性疾病[3]。通過長期的跟蹤治療，雖然西藥降脂藥功效顯著，但無論是煙酸類、貝特類、膽酸螯合類，還是現在主流的他汀類降脂藥，都存在著患者耐受性差、個體差異明顯以及長期服用可能會發生腹瀉、便秘、脫皮、皮疹、血栓性血小板減少性紫癜，并可引起血清轉氨酶升高，甚者可發生橫紋肌溶解等方面的不足，限制其不能長期使用[4-7]。而經過大量的研究，已證實中藥可以很好地調節血脂，且與西藥相比毒副作用相對要小[8-11]。因此，在中醫理論指導下，尋找安全、療效明確的調脂中藥受到眾多中醫藥學者的重視?；谀暇┲嗅t藥大學與德國埃爾朗根大學醫學院的合作項目，本實驗對臨床“化痰活血方”治療高脂血癥進行驗證，并對其藥效進行比較，為進一步研發安全性較高的降脂中藥提供客觀依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料雄性SD大鼠48只，清潔級，體質量180～220 g(蘇州昭衍新藥研究中心有限公司提供，許可證號：201511643)；化痰活血方免煎沖劑(荷葉顆粒劑1.5 g、海藻顆粒劑6 g、決明子顆粒劑2.5 g、三七粉10 g、丹參顆粒劑8.75 g、姜黃顆粒劑0.8 g，顆粒劑購于江陰天江藥業有限公司，產品批號：1510111)；阿托伐他汀鈣片(商品名：立普妥，輝瑞制藥有限公司提供，產品批號：L36728)。參照《藥理實驗方法學》[12]進行劑量換算，采用雙蒸餾水溶解藥物，4℃冰箱保存備用。高脂飼料(基礎飼料76%、膽固醇1.5%、蛋黃粉10%、豬油7%、膽鹽0.3%、丙基硫氧嘧啶0.2%、黃豆5%)委托青龍山動物繁殖場加工，送檢江蘇省理化測試中心檢測合格，合格報告編號：2015XC-0527。高脂飲食組每天上午10～11點給予高脂飼料(20 g/只/天)。

1.1.2試劑總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(批號：A20022)、甘油三酯(triglyceride，TG)(批號：A20061)購于Autec Diagnostica公司；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(批號：080301A)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒(批號：101001A)購于Prodia Diagnostics公司；谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(批號：101001A)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)試劑盒(批號：101001A)均購于北京萊幫生物技術有限公司；C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)試劑盒(批號：A362)購于Beckman Coulter公司。

1.1.3儀器SHZ-82水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市新航儀器廠生產；低速常溫離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司生產；電子分析天平，美國雙杰集團有限公司生產；LED型電子秤，上海大川電子衡器有限公司生產；奧林巴斯AU2700大型全自動生化、免疫分析儀，日本OLYMPUS光學株式會社生產。

1.2動物造模、分組給藥及取材

大鼠實驗環境由南京中醫藥大學動物實驗中心提供，標準號：SYXK(蘇)2002-0123。將大鼠適應性飼養觀察3天后，隨機選取12只為空白對照組，飼以普通飼料，其余大鼠飼以高脂飼料，控制飼養溫度為20℃左右，濕度50%～70%，自然光照，自由飲水。每周一及周四更換飲水及墊料,保持動物生活環境通風及清潔衛生。在實驗過程中每周測一次體質量，并觀察大鼠狀態的變化。4周后，于前一夜禁食12小時后眼底叢靜脈取血，檢測血脂四項，采用分層區組隨機化的方法，按TC和體質量分為3組，每組12只，分別為模型組、阿托伐他汀陽性藥對照組和化痰活血方組。其中，陽性對照組灌胃給予阿托伐他汀1.8 mg/(kg·d)；化痰活血方組給予荷葉、海藻、決明子、三七、丹參、姜黃混合制劑2659.5 mg/(kg·d)；空白對照組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。分別在給藥2、4周后禁食12小時，眼底叢靜脈采血，測定各組大鼠血脂指標TC、TG、HDL-C、LDL-C及C-反應蛋白的含量。同時給藥4周后，測定肝功能指標AST、ALT。從第29天起，禁食24小時，自由飲水，眼底靜脈叢采血2.5 mL，在正常溫度下3000 rpm離心10分鐘，分離血清備用。同時取大鼠新鮮肝臟稱重，取肝左葉組織，切成4～5 mm3小塊，10%中性福爾馬林固定、脫水，常規石蠟包埋、切片，進行HE染色，光鏡觀察。

1.3生化指標的測定

TC采用膽固醇氧化酶法測定；TG采用酶GPO-POD紫外法測定；HDL-C采用直接一步法法測定；LDL-C采用免疫化學比色法測定；AST，ALT采用速率法測定；C-反應蛋白(CRP)采用速率散射比濁法測定。計算動脈硬化指數(AI)，AI=TC-HDL-C/HDL-C。

1.4統計學處理

2結果

2.1大鼠體質量

各組大鼠的初始體質量在各組間分配均衡，無顯著性差異(P>0.05)。從造模后到給藥4周，模型組大鼠(飼喂高脂飼料)體質量均顯著低于空白組(飼喂基礎飼料)，可能與長時間飼喂高脂飼料而導致大鼠厭食有關，導致體質量下降。給藥2、4周后，大鼠的體質量在化痰活血方組、阿托伐他汀組與模型組間比較，均無顯著性差異(P>0.05)，即所給藥物對大鼠體質量無明顯影響。見表1。

2.2化痰活血方對TC、TG、HDL-C、LDL-C、TC/HDL-C及AI的影響

造模后，模型組大鼠血清的TC、TG含量均高于空白組(均P<0.01)，提示造模成功；給藥組與高脂模型組相比，無顯著性差異(P>0.05)，提示分組合理。與模型組相比，給藥2、4周后，化痰活血方能顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG含量?；祷钛綄嶒炐愿咧Y大鼠血清TC、TG值，具有顯著降低作用。見表2。

造模后，高脂模型組及兩給藥組大鼠血清LDL-C含量與空白組相比具有極顯著性差異(P<0.01)，HDL-C含量與空白組相比無顯著性差異(P>0.05)，表明本實驗造模方式對高脂血癥大鼠血清HDL-C無影響，但是可以升高血清LDL-C含量。給藥2、4周后，化痰活血方組高脂血癥大鼠LDL-C含量顯著降低，與模型組比較，具有極顯著性差異(P<0.01)?；祷钛綄嶒炐愿咧Y大鼠血清LDL-C值，具有顯著降低作用，對血清HDL-C含量無影響。見表2。

造模后，高脂模型組大鼠TC/HDL-C比值及動脈硬化指數AI，與空白組相比具有極顯著性差異(均P<0.01)?；祷钛浇M大鼠給藥2周后，血清TC/HDL-C及動脈硬化指數AI降低，與模型組比較均有顯著性差異(均P<0.05)；給藥4周后，化痰活血方組TC/HDL-C值降低(P<0.05)?；祷钛娇梢越档蛯嶒炐愿咧Y大鼠血清TC/HDL-C比值，在給藥2周后，可以降低AI值，給藥4周后，AI值降低不明顯。見表2。

表1　化痰活血方對高脂大鼠體質量的影響±s，g)

注： 與空白組相比，aP<0.05。

表2　化痰活血方對高脂大鼠血清TC、TG的影響±s)

注： 與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.3化痰活血方對高脂血癥大鼠肝功能指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝功能指標AST、ALT顯著升高，差異有統計學意義(均P<0.01)，與模型組比較，阿托伐他汀組不能顯著降低ALT水平，而化痰活血方可以降低AST、ALT水平(均P<0.05)。提示化痰活血方對高脂血癥引起的肝功能損傷具有一定的改善作用，且治療高脂血癥時較阿托伐他汀不會引起肝功能損害。見表3。

表3　化痰活血方對高脂大鼠肝功能指標的影響±s)

注： 與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4化痰活血方對高脂血癥大鼠C反應蛋白的影響

造模后，模型組大鼠CRP指數與空白組相比，無顯著性差異。給藥4周后，與模型組間比較，化痰活血方組高脂血癥大鼠CRP指數降低(P<0.05)，說明化痰活血方可以降低高脂血癥大鼠CRP的表達。見表4。

表4　化痰活血方對高脂大鼠CRP的影響±s)

注： 與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.5各組大鼠肝組織病理學檢查的比較

正常組：肝細胞排列成單板結構，互相連接吻合。肝細胞內無脂肪沉積。模型組：肝細胞單板結構不清，肝細胞變大，肝細胞內大量脂質(溶解呈空泡狀)，部分肝細胞核被推向一側，胞漿內脂滴大小不一，有輕度的細胞水樣變性和細胞壞死，炎癥反應劇烈。模型組與空白對照組比較，脂肪變性明顯。阿托伐他汀組：脂肪變性為主，肝內脂肪滴減少，散在分布，炎癥細胞浸潤減輕，偶見細胞壞死和水樣變性?；祷钛浇M：肝臟脂肪變性有不同程度的改善，輕度脂肪變為主，肝內脂肪滴減少，散在分布，炎癥細胞浸潤較少，個別細胞壞死和水樣變性?；祷钛浇M與模型組相比較肝細胞脂肪變性均有不同程度的緩解。見圖1。

注：A：空白組；B：模型組；C：阿托伐他汀組；D：化痰活血方組

圖1各組大鼠實驗8周后肝組織結構變化(×400)

3討論

3.1大鼠高脂血癥模型的建立

高脂飲食誘導大鼠高脂血癥模型是目前研究高脂血癥及其并發癥的理想動物模型。經研究報道，其可能的機制是：血中游離脂肪酸(nonestesterified fatty acid，FFA)增多，肝臟中的FFA也增多，肝臟合成及釋放TG增多；脂蛋白脂酶活性下降，使極低密度脂蛋白(very low densitylipoprotein，VLDL)及TG清除率下降；HDL水平下降的原因可能與載脂蛋白向VLDL轉移以及HDL與VLDL交換有關[13-15]。本實驗利用高脂飼料造模后發現，大鼠血清TG、TC、LDL-C含量均明顯升高，提示造模成功。

3.2化痰活血方對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響

脂代謝紊亂是誘發高脂血癥的關鍵原因，血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量可在一定程度反映機體脂肪代謝狀況，是監測血脂變化的重要指標[16-18]。大量的動物實驗、臨床試驗及預防治療試驗結果證實TC與動脈粥樣硬化的發生、心血管病的發病率及死亡率有直接的關系，而降低TC可使動脈粥樣硬化斑塊穩定化[19-20]。流行病學研究也證實，高甘油三酯是冠心病獨立的危險因子，LDL-C是血漿中膽固醇的主要載體，CRP參與了血栓形成和動脈硬化的病理過程，是腦卒中的危險因素之一[21-22]。一般認為，脂代謝紊亂是造成肝細胞脂肪變性的初始環節，它既能使體內增多的FFA直接損害肝細胞，又能使甘油三酯在肝臟內堆積[23]。因此，降低血脂、清除肝臟中累積的脂肪是治療脂肪肝的重要方法[24]。近年來，中醫藥治療高脂血癥的方法頗多，運用化痰活血法治療高脂血癥的理論和臨床研究，也取得了一定的成果，中醫藥治療高脂血癥效果明確，且毒副作用較小，可長期使用又可作為高脂血癥的一級預防用藥[25]。

本實驗研究顯示，化痰活血方(荷葉、海藻、決明子、三七、丹參、姜黃)能顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C、AI水平及TC/HDL-C值，提示化痰活血方具有調節血脂、脂蛋白——膽固醇代謝的作用。肝功能指標顯示，化痰活血方可以降低AST、ALT指標的值至正常水平，說明化痰活血方可對高脂血癥引起的肝功能損傷具有改善作用，且治療高脂血癥時較阿托伐他汀不會引起肝功能損害。同時，肝臟病理檢測顯示，化痰活血方可減輕高脂血癥大鼠肝臟病理損傷程度，可使脂變肝細胞數量明顯減少，脂變面積明顯減小，脂變程度明顯減輕。CRP結果表明，化痰活血方可以降低感染性炎癥反應的敏感指標CRP含量。整方的藥效學研究表明，化痰活血方具有改善血脂紊亂、減輕肝臟脂肪性病變的作用，能夠預防和治療高脂血癥及動脈粥樣硬化、脂肪肝等高脂血癥相關疾病。

本研究對化痰活血方的調脂作用及機理進行了初步地研究和探討，在后續的研究中，將進一步從動物急性毒性試驗和長期毒性試驗兩方面，考察化痰活血方的安全性，并就化痰活血方的作用機理及最佳劑量等展開深入研究，以研制開發出適宜血脂異?；颊呤褂玫男滦驼{脂藥物，滿足臨床和市場需求。

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(本文編輯： 董歷華)

Research ofHuatanHuoxueformula on experimental hyperlipidemia rats

ZHUZhi-gang，YAOYing-zhi.

NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing,Jiangsuprovince, 210023，ChinaCorrespondingauthor：YAOYing-zhi，E-mail： 13851894784 @163.com

【Abstract】ObjectiveTo research the effects ofHuatanHuoxueformula on experimental hyperlipidemia rats. MethodsHyperlipidemia rats model was established and theHuatanHuoxueformula group was given the administration dosage of 2659.5 mg/(kg·d) by gavage for 4 weeks. The serum contents of TC, TG, HDL-C, LDL-C, AST, ALT, CRP were detected and the AI and TC/HDL-C content was figured out. Liver tissue pathological slices was observed. ResultsHuatanHuoxueformula could effectively reduce the contents of TC, TG, LDL-C, AI, AST, ALT figures, CRP and TC/HDL-C percent. ConclusionsHuatanHuoxueformula has a certain regulating effect on blood lipid level in hyperlipidemia rats, and can improve the liver function injury induced by hyperlipidemia, and does not cause liver function damage.

【Key words】HuatanHuoxueformula；Hyperlipidemia；Rat experiment

基金項目：南京中醫藥大學與德國埃爾朗根大學醫學院合作項目(015009022001)

作者簡介：朱志剛(1990- )，2013級在讀碩士研究生。研究方向：心血管系統疾病中藥配伍研究。E-mail：709804125@qq.com 通訊作者： 姚映芷(1958- )，女，本科，副教授，副主任醫師。研究方向：心血管系統疾病中藥配伍研究。E-mail：13851894784@163.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.003

(收稿日期：2016-03-11)