芍藥苷對血虛肝郁證大鼠海馬CA1區sGCβ1和5種PDE亞型蛋白表達的影響

王景霞　周恬恬　朱映黎　王成龍　吳麗　張建軍

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·論著·

芍藥苷對血虛肝郁證大鼠海馬CA1區sGCβ1和5種PDE亞型蛋白表達的影響

王景霞周恬恬朱映黎王成龍吳麗張建軍

100029北京中醫藥大學基礎醫學院中藥教研室[王景霞、周恬恬(碩士研究生)、朱映黎(博士研究生)、王成龍(碩士研究生)、吳麗(碩士研究生)、張建軍]

【摘要】目的研究芍藥苷對血虛肝郁證大鼠海馬環磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)含量及CA1區cGMP合成酶即可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclaseβ1，sGCβ1)和水解酶即磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)不同亞型(PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A)蛋白表達的干預作用。方法56只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、芍藥苷高劑量組、芍藥苷低劑量組，每組14只。采用輻射結合束縛法建立血虛肝郁證模型，空白組、模型組灌胃等量蒸餾水，給藥組分別灌以40 mg/kg、 20 mg/kg的芍藥苷，共造模21天。治療結束后，采用放射免疫法測定cGMP含量；免疫組化法檢測sGCβ1、PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A的蛋白表達。 結果與模型組相比，芍藥苷高劑量組可降低cGMP含量(P<0.01)，并下調PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A的蛋白表達(P<0.05)，且上調PDE10A的蛋白表達(P<0.05)。結論芍藥苷對于cGMP水解酶不同亞型存在雙向調控，與抑制合成酶發揮協同作用，降低cGMP的含量，下調NO/cGMP通路，從而改善血虛肝郁證引起的大腦功能損傷。

【關鍵詞】血虛肝郁證；芍藥苷；環磷酸鳥苷；磷酸二酯酶；可溶性鳥苷酸環化酶

白芍為毛茛科植物芍藥PaeoniaLactifloraPall. 的根，首載于《神農本草經》，苦酸微寒，歸肝脾經，功能養血斂陰，柔肝止痛，平抑肝陽，是臨床治療血虛肝郁證的常用藥物[1]。芍藥苷是白芍的主要有效成分，課題組前期研究表明其對血虛肝郁證候模型大腦功能損傷確有改善作用[2]，并發現其作用機制可能與調節環磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)的合成和水解有關[3-4]，但具體作用靶點尚不明確。由于影響cGMP水解的磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)存在多種亞型[5]，其中PDE1、PDE2、PDE10作為針對cGMP和cAMP兩種底物的水解酶類，又存在著對于cGMP含量調節的不一致[6]。故本實驗通過觀察芍藥苷對血虛肝郁模型大鼠海馬cGMP含量及CA1區cGMP合成酶即可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclase β1，sGCβ1)和水解酶即磷酸二酯酶各亞型PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A蛋白表達的干預作用，探討cGMP與血虛肝郁證的內在聯系，以及芍藥苷影響模型大鼠海馬cGMP動態平衡的高效靶點。

1材料與方法

1.1實驗動物

雄性SD大鼠56只，清潔級，體質量180～200 g，由斯貝福(北京)實驗動物技術有限公司提供，動物許可證編號：SCXK(京)2011-0004。

1.2實驗藥品

芍藥苷：自制，經白芍飲片提取分離精制而成，HPLC法測定純度高達96%；白芍飲片購自安徽亳州，由北京中醫藥大學基礎醫學院中藥教研室鑒定。

1.3試劑與儀器

鳥苷酸環化酶測試盒(北京華英生物技術研究所)；ab24824兔抗大鼠sGCβ1(批號：GR89594-9，購自Abcam公司)；ab14599兔抗大鼠PDE1A(批號：GR86777-8，購自Abcam公司)；ab125677兔抗大鼠PDE2A(批號：GR9115-4，購自Abcam公司)；ab14672兔抗大鼠PDE5A(批號：GR69387-5，購自Abcam公司)；ab125672兔抗大鼠PDE9A(批號：GR168578-1，購自Abcam公司)；ab177933兔抗大鼠PDE10(批號：GR141519-3，購自Abcam公司)；abSV0002-兔IgG兩步法免疫組化試劑盒(批號：08CD4A，購自武漢博士德公司生物工程有限公司)；DAB試劑盒(批號：1309170031，購自福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.4分組和給藥

雄性SD大鼠56只，隨機分為空白組、模型組、芍藥苷低劑量組(20 mg/kg)和芍藥苷高劑量組(40 mg/kg)分別相當于白芍飲片的1 g/kg、2 g/kg，每組14只。從造模第1天開始給藥，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，其余各組灌胃相應藥物，共造模21天。

1.5造模方法

不難看出, 有限差分近似式(3)引入了兩類數值誤差. 數值色散修正的是波的相速度, 即c*(ξ)=; 數值耗散修正的是波的振幅, 記作e-λt, 衰減率對應于一種特征衰減時間尺度的倒數, 該時間尺度僅當時才有意義.

大鼠常規單籠飼養適應數天后稱重。除正常組外，其余各組每天不定時束縛3小時，于束縛第7天，釆用60Co-γ放射源全身輻照1次，劑量為3.5 Gy，劑量率為191.55 cGy/min，輻照距離4 m。輻照后，各組大鼠繼續單籠飼養，模型組每天不定時束縛3小時，連續14天[7]。

1.6放射免疫法檢測cGMP含量

于造模結束后第2天，動物斷頭取海馬組織，勻漿后加入2 mL無水乙醇離心，取上清；用75%乙醇洗沉淀，勻漿后再離心；去上清，于60℃烤箱烘干備用。按試劑盒操作，測定大鼠海馬組織中cGMP含量。以全自動放射免疫-γ-計數器測定沉淀組織中每分鐘的放射性脈沖數，并采用Log-Logic數學模型擬合標準曲線，由計算機讀出測定值。

1.7免疫組化法測定芍藥苷對血虛肝郁證大鼠sGCβ1及5種PDE亞型蛋白表達的影響

于造模結束后第2天，各組取7只大鼠，用生理鹽水和多聚甲醛進行心臟灌流固定；取大鼠腦組織置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定24小時后，石蠟包埋切片。經常規脫蠟處理后，置于3%H2O210分鐘滅活內源性酶，浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液熱修復10分鐘；滴加5% BSA封閉液，37℃滴加一抗，4℃過夜，滴加聚合HRP標記抗兔IgG(SV-0002)。以上各步之間除5%BSA封閉液外均用0.1 mol/L PBS洗3次，每次3分鐘。使用DAB顯色試劑盒室溫顯色，蒸餾水充分洗滌，蘇木精復染；脫水封片。用Nikon 4500數碼相機和Nikon E200型顯微鏡組合拍攝圖像，Image pro Plus 6.0圖像分析系統進行圖像分析。每組隨機測試5張切片，每張切片測試一個視野，測定光密度(intergralopt density，IOD)。

1.8統計學處理

2結果

經過21天的復合造模，模型組大鼠大腦中第二信使發生了較大改變。與空白組相比，海馬組織cGMP含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，給予高劑量芍藥苷能降低cGMP含量，差異顯著(P<0.01)。見表1。

2.2芍藥苷對海馬CA1區sGCβ1及5種PDE亞型蛋白表達的影響

經過21天的復合造模，模型組大鼠海馬中cGMP合成酶與水解酶都發生了變化，其中sGCβ1蛋白表達較空白組有所升高，但差異無統計學意義；與空白組相比，PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A蛋白表達顯著升高(P<0.05)，PDE10A蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

表1　各組大鼠海馬組織cGMP的含量

注： 與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

與模型組相比，給予低劑量芍藥苷有降低sGCβ1和PDE1A蛋白表達的趨勢，但無統計學差異；并能顯著降低PDE2A、PDE5A、PDE9A蛋白的表達(P<0.05)，升高PDE10A蛋白的表達(P<0.05)。

與模型組相比，給予高劑量芍藥苷可以降低sGCβ1蛋白的表達，并能夠降低PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A蛋白表達(P<0.05)，升高PDE10A蛋白的表達(P<0.05)。見表2，圖1～6。

表2　各組大鼠海馬組織sGCβ1、PDE1A、 PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A積分光密度

注： 與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01。

A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組

圖1各組大鼠海馬 CA1 區 sGCβ1表達的影響(IHC ×200)

A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組

圖2各組大鼠海馬 CA1 區 PDE1表達的影響(IHC ×200)

A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組

圖3各組大鼠海馬 CA1 區 PDE2表達的影響(IHC ×200)

A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組

圖4各組大鼠海馬 CA1 區 PDE5表達的影響(IHC ×200)

A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組

圖5各組大鼠海馬 CA1 區 PDE9表達的影響(IHC ×200)

A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組

圖6各組大鼠海馬 CA1 區 PDE10表達的影響(IHC ×200)

3討論

血虛肝郁證常見于現代醫學的慢性心理應激引起的多種疾病[8]。而“肝主疏泄”和“肝主藏血”的功能可維持和促進全身氣血的正常運行，調適各臟器對應激的反應。由于肝體陰而用陽，喜柔而惡剛，所以治療當養血柔肝，以柔制剛，順應肝的條達之性[9]。因此，養血柔肝也是中醫抗慢性應激常采用的治療法則。輻照結合束縛應激建立的血虛肝郁證候模型，形成了強烈的刺激，使得模型大鼠處于持續應激狀態，必將導致大腦功能結構的異常。

慢性應激中信號通路失調，抗應激作用與腦中功能異常的NO/cGMP信號通路的正?；嘘P[10]。而cGMP作為新的信使分子，通過激活下游效應分子cGMP依賴性蛋白激酶、環核苷酸門控離子通道和磷酸二酯酶的合成來發揮多種生物效應，影響絲氨酸/蘇氨酸磷酸化[11]，影響信號轉導[12]，以及細胞內Ca2+濃度，介導細胞效應[13]。前期研究結果表明[3]，芍藥苷可以對抗應激產生的海馬區谷氨酸(glutamic acid，Glu)和NO含量的升高，從而下調NO/cGMP信號通路，本實驗通過測定海馬組織cGMP含量，也驗證了芍藥苷對cGMP水平的下調作用。

現代研究表明，sGC作為NO的受體及cGMP合成酶，sGC的活化、失活以及脫敏對于NO信號通路非常重要[14]。NO與sGC結合后會激活sGC的催化活性, 即催化GTP轉化為cGMP。因此，以sGC為靶標的疾病治療手段可以消除過多NO細胞毒性及NO耐受性的缺陷[15]，sGC抑制劑ODQ可下調NO/cGMP通路，增強4 mg/kg(亞有效劑量)芍藥苷的作用[16]。本實驗結果表明，芍藥苷能顯著減少sGCβ1的蛋白表達，說明芍藥苷能通過發揮sGC抑制劑樣作用，直接影響合成酶活性，導致cGMP生成減少。而由于cGMP參與調解抑郁焦慮與學習障礙等中樞神經系統疾病，它的含量是由合成酶和水解酶共同調控的，磷酸二酯酶PDE5、PDE9特異性水解cGMP， PDE1、PDE2、PDE10能同時水解環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)和cGMP[17]。研究表明，PDE5和PDE9的抑制劑被認為是改善記憶和增加神經發生的候選藥，并且二者表達和活性的增強影響cGMP濃度的下降[18-19]。而PDE1和PDE2作為雙重底物酶，對cGMP和cAMP含量的影響并不一致；PDE2抑制劑可以選擇性提高興奮性突觸cGMP水平，并提高突出可塑性和記憶功能[20]。本實驗結果顯示，給予芍藥苷后能顯著下調PDE5、PDE9的表達，降低PDE1和PDE2的表達，升高PDE10的表達。另一方面，由于PDE2抑制劑具有增加NO活性、反饋調節NO/cGMP通路、增加cGMP含量的作用[21]，而芍藥苷所引起的PDE10的上調又對抗了由于PDE抑制劑樣作用反饋引起的cGMP的合成，所以推測芍藥苷是通過作用于多個靶點，相互影響，從而發揮最終的調節效應。

綜上，芍藥苷對于血虛肝郁證的干預作用可能是參與了NO/cGMP通路中影響cGMP含量的多個環節，不僅通過降低sGC含量進一步下調NO，還對PDE不同亞型存在雙向調節的功能，綜合抵抗機體應激引起的cGMP的升高，發揮神經保護作用。芍藥苷針對sGC和PDE10等高效靶標的調控作用，有可能就是揭示白芍養血柔肝解郁的作用特點和優勢的重要環節。但是，作為共同參與情志調節，影響神經細胞興奮性的cAMP，也能被PDE水解，芍藥苷對PDE不同亞型的影響是否同時參與了cAMP含量的調節，cAMP與cGMP是否存在動態平衡，兩條通路間是否存在共同的高效靶點，還需要進一步深入的研究。

參考文獻

[1]高學敏,鐘贛生. 臨床中藥學[M].石家莊：河北科學技術出版社, 2006:906.[2]李艷霞,張建軍,王景霞,等. 芍藥苷對血虛肝郁證大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸和單胺類神經遞質的影響[J]. 中華中醫藥雜志,2014,29(8):2591-2595.

[3]王景霞,張建軍,屈勝勝,等. 芍藥苷對血虛肝郁證候模型大鼠海馬CA3區組織形態及一氧化氮通路的影響[J]. 北京中醫藥大學學報,2015,38(2):85-88，145.

[4]朱映黎,張建軍,王景霞,等. 芍藥苷對血虛肝郁證模型大鼠海馬cGMP含量及其合成與水解酶的影響[J]. 中華中醫藥雜志,2015,30(3):818-820.

[5]陳玲,徐英,潘建春. 磷酸二酯酶參與認知與情緒調節的研究進展[J]. 中國藥理學與毒理學雜志,2012,26(3):357-362.

[6]楊菊. 磷酸二酯酶及其抑制劑的研究現狀[J]. 中國廠礦醫學,2009,22(2):216-218.

[7]張建軍,李艷霞,王景霞,等. 輻照結合束縛應激致血虛肝郁大鼠證候模型的建立[J]. 中華中醫藥雜志,2014,29(7):2176-2179.

[8]賴永德,金紅波. 探討血虛肝郁與抑郁癥的發生[J]. 四川中醫,2009，(2):30-31.

[9]李峰,楊維益,梁嶸,等. 從中醫學看肝臟調節應激反應的作用[J]. 北京中醫藥大學學報,1998,21(1):20-22，72.

[10]Reierson GW, Mastronardi XA, Licinio J, et al. Repeated antidepressant therapy increase cyclic GMP signaling in rat hippocampus[J]. Neurosci Lett, 2009, 466(3):149-153.

[11]Revelli A, Ghigo D,Moffa F, et al. Guanylate cyclase activity and sperm function[J]. Endocr Rev, 2002, 23(4):484-494.

[12]Schlossmann J, Feil R, Hofmann F. Insights into cGMP signalling derived from cGMP kinase knockout mice[J]. Front Biosci, 2005, 21(10):1279-1289.

[13]Bender AT, Beavo JA. Cyclic nucleotide phosphodiesterases: molecular regulation to clinical use[J]. Pharmacol Rev, 2006, 58(3):488-520.

[14]陳堯,黃東暉. GC/cGMP信號轉導途徑在雄性生殖作用的研究進展[J]. 生殖與避孕,2013,33(12):842-848.

[15]潘潔,鐘方芳,王紅艷,等. 可溶性鳥苷酸環化酶介導NO信號轉導的結構基礎及其分子機制研究[J]. 中國科學:化學,2014,44(4):572-585.

[16]王景霞,張建軍,李偉,等. 芍藥苷抗抑郁作用與NO/cGMP通路相關性研究[J]. 中藥與臨床,2012,3(1):27-28,37.

[17]陳昌亮,黃爽. 磷酸二酯酶及其抑制劑的研究進展[J]. 中國藥理學通報,2014,30(2):283-286.

[18]Puzzo D, Staniszewski A, Deng SX, et al. Phosphodiesterase 5 inhibition improves synaptic function, memory, and amylaid-beta load in an Alzheimer’s disease mouse model[J]. J Neurosci, 2009, 29(25):8075-8086.

[19]李杰,陳浩,陳國良. 磷酸二酯酶9及其抑制劑的研究進展[J]. 沈陽藥科大學學報,2009,26(5):409-414.

[20]陳玲,徐英,潘建春. 磷酸二酯酶參與認知與情緒調節的研究進展[J]. 中國藥理學與毒理學雜志,2012,26(3):357-362.

[21]Boess FG, Hendrix M, Van derStaay FJ,et al.Inhibition of phosphodiesterase 2 increases neuronal cGMP synaptic plasticity and memory performance[J]. Nenuropharmacology, 2004，47(7):1081-1092.

(本文編輯： 韓虹娟)

Effects of paeoniflorin on the expression of SGCβ1, different subtypes of PDE in the hippocampus CA1 Zone of rats with blood deficiency and liver depression syndrome

WANGJing-xia,ZHOUTian-tian,ZHUYing-li,etal.

SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,ChinaCorrespondingauthor:ZHANGJian-jun,E-mail：zhangjianjun@bucm.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo observe the influence of paeoniflorin on the content of cGMP and the protein expressions of cGMP synthase namely SGCβ1 and hydrolases PDE1A, PDE2A, PDE5A, PDE9A, PDE10A in the hippocampus CA1 zone of rats with blood deficiency and liver depression syndrome. MethodsThe rat model was established by chronic restraint stress combined with irradiation. From the 1st day of modeling, the normal and model group was treated with same amount of distill water, the treatment group were given corresponding medicines. On the 21th day of modeling, the brain tissue and hippocampus were removed. The content of cGMP was detected by RIA. IHC was used to observe the protein expressions of sGCβ1, PDE1A, PDE2A, PDE5A, PDE9A and PDE10A. ResultsCompared with the model group, the content of cGMP in the dose of 40mg/kg Paeoniflorin was reduced (P<0.01) and the protein expressions of PDE1, PDE2A, PDE5A, PDE9A were reduced (P<0.05), and the protein expressions of PDE10A were increased significantly (P<0.05). ConclusionsPaeoniflorin could play a role of dual-directional regulation effects on the activities of different subtypes of hydrolases, which give play to synergistic effect with the inhibition of synthase, and comprehensively reduce the content of cGMP to relieve the brain damage of the blood deficiency and liver depression syndrome.

【Key words】Blood deficiency and liver depression syndrome；Paeoniflorin；Cyclic guanosinc monophosphate；Phosphodiesterase；Soluble guanylyl cyclase β1

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81173569)

作者簡介：王景霞(1976- )，女，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：中藥藥性基本理論。E-mail: wjx117@sohu.com 通訊作者： 張建軍(1965- )，博士，研究員，博士生導師。研究方向：基于中藥基本理論的藥效機理及物質基礎研究。E-mail: zhangjianjun@bucm.edu.cn

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.004

(收稿日期：2015-10-21)