一例暴露因素不明的狂犬病病例的分子流行病學溯源

李幸樂, 李鳳麗, 李　懿, 孫建偉, 黃學勇,許汴利

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一例暴露因素不明的狂犬病病例的分子流行病學溯源

李幸樂, 李鳳麗, 李懿, 孫建偉, 黃學勇,許汴利

河南省疾病預防控制中心，河南省醫學病原生物學重點實驗室，鄭州450016

摘要：目的對一例暴露因素不明的人狂犬病病例進行實驗室確診，通過分子流行病學分析探索其可能的感染來源。方法通過對存活疑似人狂犬病病例的唾液、腦脊液、血清標本采用直接免疫熒光試驗、反轉錄-聚合酶鏈式反應和快速熒光灶抑制試驗進行實驗室確診；通過時空進化分析探索該病例可能的感染來源。結果病例唾液標本直接免疫熒光試驗結果呈陽性，病例血清標本經快速熒光灶抑制試驗檢測抗狂犬病病毒中和抗體呈陽性。病例唾液標本經反轉錄-聚合酶鏈式反應獲得狂犬病病毒核蛋白基因預期擴增片段，序列測定進一步證實為狂犬病病毒。該狂犬病病毒株與2011年安徽省一株犬源狂犬病病毒株核苷酸序列同源性最高，為98.4%。結論該疑似狂犬病病例可確診為狂犬病病例。其發病源于至少2011年以來的某次不自覺的狂犬病病毒感染。

關鍵詞：狂犬??；反轉錄-聚合酶鏈式反應；分子流行病學

狂犬病是由狂犬病病毒感染導致的急性致死性疾病，是一種人獸共患病?？袢《嘁娪谌?、狼、貓等食肉動物和蝙蝠，人類狂犬病絕大多數由病犬咬傷所致，潛伏期長短不一，與傷者年齡、傷口部位、傷口深淺、入侵病毒的數量和毒力等因素有關，多數潛伏期在3個月以內。本研究經過系統的實驗室診斷確診了1例臨床典型、暴露因素不明的狂犬病病例，并對該狂犬病病例可能的感染途徑進行了探索性分析?，F將結果報告如下。

1材料與方法

1.1個案信息及標本采集患者ZXQ, 男，漢族，48歲，農民，河南省新鄉市輝縣北云門鄉南桃固村人。2013年10月2日發病，表現為煩躁、怕風、吞咽困難、不能進水。病癥呈反復進行性加重。2013年10月12日因呼吸衰竭死亡?；颊呷朐簳r神志清醒，自述近期無狂犬病暴露史。查體未發現肉眼可見外傷。河南省疾病預防控制中心于2013年10月7日收集病人唾液混合液標本1份(每間隔3小時采集一次，采集3次)；腦脊液標本1份。于2013年10月8日收集血清標本1份。所有標本冷凍保存，備檢。

1.2病例標本的直接免疫熒光法檢測患者的唾液標本4 ℃ 2 000 r/min 離心20 min，取出上清，唾液沉渣采用PBS制成30%懸液，制片備用。取10 μL唾液沉渣制成的懸液推片，干燥后丙酮固定30 min，棄丙酮，室溫干燥5 min；加50 μL以PBS 1∶100稀釋的異硫氰酸熒光素標記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin, 含0.1%的1% EVAN's Blue)覆蓋玻片上的唾液沉渣，37 ℃濕盒孵育30 min；緩流沖洗棄熒光標記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體，PBS振洗2次，水洗1次；干燥后加10 μL 80% 甘油覆蓋唾液沉渣；熒光顯微鏡下觀察結果。同時以健康人唾液標本設立陰性對照。

1.3病例標本的反轉錄-聚合酶鏈式反應檢測采用Qiagen公司(Düsseldorf, NordrheinWestfalen, German)QIAamp Viral RNA Mini Kits病毒RNA提取試劑盒依據說明書操作提取患者唾液、腦脊液標本的病毒RNA。病毒RNA采用Invitrogen公司(Carlsbad, California, USA)SuperScript?III 1st Strand cDNA Synthesis Kits反轉錄試劑盒依據說明書操作反轉錄合成cDNA。采用Promega公司(Madison, Wisconsin, USA)GoTaqR Green Master Mix試劑進行巢式聚合酶鏈式反應，分別針對狂犬病病毒N蛋白進行目的基因片段擴增[1]，引物見表1。擴增N蛋白基因時，外引物為PN1-1和PN1-2，內引物為PN2-1和PN2-2。外引物反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。內引物反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR終產物長度約250 bp。

表1病例標本RT-PCR檢測用引物

Table.1Primers used in RT-PCR for the samples of patient

TargetgenesCodesSequencesofprimers(5'→3')PositionLengthofproduct/bpNN127ATGTAACACCTCTACAATGG55-741500N8mCAGTCTCYTCNGCCATCT1570-1587N577AAGATGTGYGCYAAYTGGAG644-663250N829GCCCTGGTTCGAACATTCT881-899

Note: Rabies virus vaccine strain PV2061 (GenBank ID: NC_001542) was used as the template to design primers by the Primer 5.0 software.

1.4核酸序列測定與分析擴增產物送南京金斯瑞生物技術有限公司測序。采用BioEdit 5.0.6版本軟件進行序列拼接，采用Clustal X 2.1軟件進行序列排列，采用MEGA 4.1軟件進行系統進化分析，所有操作按照軟件使用說明進行。

1.5病例標本的快速熒光灶抑制試驗以96孔細胞培養板作為檢測板，每行對應一份樣本。按照預先設計的方案于相應行每孔加入100 μL含10% FBS 的DMEM培養液，取病例血清、病例腦脊液、國家標準品(21.4 IU/mL)、陰性血清(0.0 IU/mL)各50 μL分別加入相應行第一孔內，連續進行1∶3倍比稀釋，每行最后一孔棄去50 μL混合液，同時設立細胞對照和CVS-11病毒對照；除細胞和病毒對照孔以外每孔加入稀釋至80%細胞感染量的CVS-11毒種50 μL，37 ℃中和作用1 h；中和作用結束后每孔加入1×106/mL的BSR細胞懸液50 μL，37 ℃ 5% CO2孵箱培養24 h。然后進行常規的FAT檢測，在倒置熒光顯微鏡下觀察檢測結果，在記錄表中詳細記錄各樣品50%分界點前后孔內熒光染色細胞百分比，代入計算公式內求取各樣品中和抗體效價值，單位為IU/mL。

2結果

2.1直接免疫熒光檢測結果病例唾液標本檢測結果如圖1。病例唾液標本和健康人唾液標本區分明顯。健康人唾液標本僅見伊文思藍底染紅色正常上皮細胞，無特異性蘋果綠染。病例唾液標本除可見伊文思藍底染以外，幾乎在所有視野中都觀察到大小、形狀不一的特異性性的呈蘋果綠色的狂犬病病毒抗原抗體結合物。

1：DFA production of healthy control；2：DFA production of rabies case；3：DFA production of rabies case.圖1　狂犬病病例DFA檢測結果Fig.1　DFA production of rabies case

2.2反轉錄-聚合酶鏈式反應檢測結果病例標本檢測結果如圖2。病例唾液標本經RT-PCR擴增N蛋白，在預期位置獲得特異性條帶，唾液標本呈陽性反應。

M：DL2000 Marker; 1：RT-PCR production of healthy control；2：RT-PCR production of rabies case.圖2　狂犬病病例RT-PCR檢測結果Fig.2　RT-PCR production of rabies case

2.3狂犬病病毒N基因系統進化分析及同源性比較病例唾液標本RT-PCR產物經核苷酸序列測定獲得狂犬病病毒N蛋白部分核苷酸序列，共250 bp。經NCBI網站BLAST比對顯示與2011年安徽省犬源狂犬病病毒株11AF60(GenBank序列號：JQ798953)核苷酸同源性最為接近，為98.4%。在NCBI網站篩選背景清晰的、具有代表性的狂犬病病毒N蛋白基因序列共同進行系統進化分析(如圖3)。進化分析結果顯示：狂犬病病毒株存在時間、空間和物種聚集性。來自浙江省和江蘇省的人源和犬源狂犬病病毒株形成一個相對獨立的分支；浙江省和江西省的鼬獾源的狂犬病病毒形成一個相對獨立的分支；河南省狂犬病病毒株形成兩個相對獨立的分支，河南省人源狂犬病病毒株和部分犬源狂犬病病毒株與安徽省犬源狂犬病病毒株親緣關系接近，河南省部分犬源狂犬病病毒株也形成一個獨立分支。

圖3　狂犬病病毒N蛋白基因時空進化分析Fig.3　Phylogenetic analysis of N protein genes of rabies viruses

2.4病例抗狂犬病病毒中和抗體檢測結果病例腦脊液標本為發病后第6 d腦脊液標本，抗狂犬病病毒中和抗體效價為0.0 IU/mL(<0.05 IU/mL)，為陰性。病例血清標本為發病后第7 d的血清標本，抗狂犬病病毒中和抗體效價為0.85 IU/mL(≥0.05 IU/mL)，為陽性。

3討論

該狂犬病病例臨床癥狀典型。實驗室檢測抗原、核酸均為陽性；病例沒有確切的狂犬病暴露史，因此也沒有進行狂犬病暴露后免疫，病例血清中的抗狂犬病病毒中和抗體為陽性。所有這些證據均表明該病例為狂犬病病例。該狂犬病病例的特殊性在于沒有確切的狂犬病暴露史。病例在病程初期自述近期無狂犬病暴露史。流行病學調查顯示病例發病半年前家中開始養犬，拴養，家犬至病例發病一直存活，無異常表現。根據國際社會公認的十日觀察法判斷，可以排除家犬作為感染來源的可能。病例家屬及同村村民因此堅持認為病例的發病源于20多年前一次未經處理的嚴重犬傷。

狂犬病病毒是一種高度保守的病毒，尤其以狂犬病病毒基因組中的N蛋白核苷酸序列最為保守，大多數毒株N蛋白基因核苷酸序列的同源性大于98%[2]。這種情況下采用分子生物學手段對狂犬病病毒進行溯源似乎并不樂觀。中國人狂犬病感染途徑單一，狂犬病病毒基因型穩定[3]，這種情況則使分子流行病學溯源具有一定的可能性。研究篩選時間、空間和物種等背景清晰的、具有代表性的狂犬病病毒N蛋白基因序列進行時空進化分析。進化分析顯示：中國的狂犬病病毒株存在物種聚集性、時間和空間聚集性。這種聚集性是由于同種野生物種在同一時間和空間接觸機會多，相互感染導致的結果。犬源狂犬病病毒株除體現一定的物種聚集性以外，與同一時間和空間的其他物種(尤其是人)的親緣關系存在一定交叉。這恰好證實了在中國，犬是狂犬病感染的幾乎唯一來源。經過NCBI網站BLAST比對發現該病例感染的狂犬病病毒株與2011年安徽省犬源狂犬病病毒株11AF60核苷酸同源性最為接近。綜合考慮以上兩點，我們有理由認為該病例的發病源于至少2011年以來的某次不自覺的狂犬病病毒感染。這也意味著該病例的最長潛伏期不超過兩年，與二十多年前的犬傷并無關聯?？紤]到病例來自犬只管理相對混亂的農村地區[4]，因此犬作為感染來源的可能性非常大。

研究在一定程度上解釋了病例可能的感染來源和感染時間，但是并沒有直接證據。在目前階段，即使是暴露史明確的狂犬病病例，未必能獲得完整的證據鏈。這在一定程度上是由于狂犬病監測數據的缺失導致的。這種缺失與狂犬病的特殊性以及現階段公眾對狂犬病的認識相關：多數狂犬病病例臨床癥狀典型，無須實驗室確診。同時，實驗室診斷只有在病程中晚期才能介入，此時已經失去了狂犬病暴露后預防的最后機會，而且幾乎沒有治愈的希望。實驗室診斷對狂犬病病例似乎沒有意義可言。事實上，狂犬病病例的實驗室診斷有助于指導犬的免疫和人的免疫[5-6]?？袢嶒炇以\斷更為長遠的意義在于，通過實驗室診斷不斷提高狂犬病實驗室診斷的能力和水平，完善狂犬病實驗室診斷數據。尤其是分子水平的數據。使實驗室診斷在狂犬病的預防和治療中發揮更加重要的作用。由中國科學家研發的重組狂犬病病毒可以阻止狂犬病病毒野毒株感染小鼠的病情進一步發展惡化[7-8]?？袢〉闹委熣谄D難而積極的推進。中國政府已經認識到狂犬病實驗室診斷的重要性，將在新的全國狂犬病監測方案中對狂犬病病例的實驗室診斷提出要求。力求從各個方面包括實驗室診斷方面提高狂犬病的防治水平。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.011

通訊作者：許汴利，Email：bianlixu@163.com

中圖分類號：R373.9

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-473-04

Corresponding author:XU Bian-li, Email：bianlixu@163.com

收稿日期：2015-11-26修回日期：2016-02-17

Molecular epidemiology analysis of a unknown exposure human rabies

LI Xing-le，LI Feng-li, LI Yi, SUN Jian-wei, HUANG Xue-yong，XU Bian-li

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanCentersforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

Abstract:Direct immunofluorescence assay (DFA), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) were used to detect the samples of saliva, cerebrospinal fluid (CSF), serum of a living patient for rabies laboratory diagnosis. The infection source of the unknown exposure of human was analyzed with molecular epidemiology method rabies. Results showed that the rabies virus antigen of the saliva samples of patient was positive. The predicted segments of the nucleoprotein (N) genes of rabies virus was amplified from the saliva samples of patient. Rabies virus neutralizing antibody (RVNP) was proved positive in the serum sample of patient. The rabies virus had the highest nucleotide homology with 11AF60(98.4%).In clusion the suspected human rabies case was diagnosed in laboratory as defined rabies case,and have been infected by rabies virus since 2011.

Key words:rabies; reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR); molecular epidemiology analysis This study was supported by the Science and Technology Research Programs in Henan Province-Provincial Program(No. 42102310389)

河南省科技攻關項目(No.42102310389)資助