濃縮細胞生長因子在整形美容外科中的應用

王 昕, 陳小平, 林金德

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綜 述

濃縮細胞生長因子在整形美容外科中的應用

王 昕, 陳小平, 林金德

細胞生長因子； 面部年輕化； 骨缺損修復

濃縮細胞生長因子(concentrated growth factors, CGF)是通過專用特殊設備，將自體外周血經不間斷差速離心制備而成的富含多種高濃度生長因子的血液提取物[1-7]，其可促進組織修復和再生，在整形美容外科領域有廣闊的應用前景。筆者就CGF的發展簡史、制備方法、生物學功能、臨床應用和展望綜述如下。

1 CGF技術的發展歷史

20世紀80年代，學者們根據全血中各種成分沉降系數的不同，利用離心的方法從外周全血中分離出富含高濃度血小板、白細胞、纖維蛋白原和細胞生長因子的血液提取物，用于創傷修復和促進組織再生[8-9]。由于分離方法不同，所得到的血液提取物內含有的有效成分和數量也有所不同。1984年，RK Assoion等采集自體外周全血并加入抗凝劑后，通過恒速(后改為二次梯度)離心方法，首先提取了富含血小板(血小板數為外周血的4倍以上)的富血小板血漿(platelet-rich plasma， PRP)。當PRP與氯化鈣以及牛凝血酶混合后，各種生長因子即從血小板中的α顆粒中釋放出來。但是，牛凝血酶的使用往往伴隨著凝血因子Ⅴ、Ⅺ抗體的形成，存在著發生凝血功能紊亂的可能性。2001年，J Choukroun采用外周全血直接離心而不添加任何生物制劑的方法，獲取了富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)[10]；僅需抽取外周全血放入硅基玻璃離心管后，迅速將其低速離心即可獲得凝膠狀PRF，分子結構類似于天然血凝塊。由于離心分離制備過程中無抗凝劑，僅借助玻璃離心管中的硅元素，促成了血小板激活與纖維蛋白的生理性聚合，開啟了生理凝血過程的模式，收集到天然凝血塊和激活血小板胞吐α顆粒釋放出大量蘊含的重要細胞生長因子。在細胞生長因子的調節作用和纖維蛋白的支架作用下能促進組織修復和再生。與PRP比較，PRF制備時同樣采用自身血液通過恒速離心法提取，但無任何生物制劑的添加，對正常人體生理功能無干擾。2006年，L Sacco首先采用特殊的專用離心設備制備出CGF[2]，與PRF一樣，CGF是通過不抗凝的外周血分離制備而成。不過，兩項技術的離心速度和離心方法有所不同。PRF以400 g(3000 r/min)離心力恒速離心10 min而獲取，CGF則采用不間斷差速(2400～2700 r/min)離心13 min后獲得。CGF在制備的過程中，除了不添加任何生物制劑外，還需要利用專用設備及其特殊的高低轉速離心方式，使血小板受到撞擊后釋放出更多的細胞生長因子[1-7]，而纖維蛋白的拉伸強度及黏合度也均高于定速離心機所制備出來的PRF凝膠。這不僅提高了CGF促進組織細胞的遷移、增殖和分化能力，同時增強了修復組織與器官的再生能力。

2 CGF制備的專用設備與方法

目前,CGF是通過Medifuge離心機(SILFRADENT，意大利)離心全血而獲得，其具備特定的CGF程序即變速離心技術，該程序具有以下特點：加速30 s，速度達到2700 r/min；旋轉2 min后，降到2400 r/min；旋轉4 min，加速到2700 r/min;旋轉4 min，加速到3300 r/min；旋轉3 min，減速至36 s停止[2]。該設備除具有特殊的加速、減速離心全自動程序化系統外，還有精確的溫控系統，可以保證提取CGF時的環境溫度。這種不間斷差速離心可以激活血小板，啟動生長因子的分泌，胞吐α顆粒釋放細胞生長因子，同時還可避免血液中的生長因子被破壞。而制備出的CGF纖維蛋白較定速離心機制備的PRP及PRF拉伸強度更高，黏結強度更強，所含血小板衍生生長因子(PDGF)、轉移生長因子-β(TGF-β)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)以及成纖維細胞生長因子(FGF)、骨形成蛋白(BMPs) 等生長因子含量更多。而且10 min內，細胞生長因子釋放就可以達70%，1 h之內接近100%；生長因子全部被釋放出來需要1周時間。CGF制備的具體操作：Vacuette負壓真空采集管(Medifuge離心機特殊匹配試管)抽取患者的自身靜脈血9 ml，立即置入Medifuge離心機；設定CGF制備程序，離心13 min后，可見試管中血液分為3層。血液在離心過程中，由于紅細胞沉降速度最快，離心后沉入試管底層；CGF、白細胞和血小板沉降速度相似，但慢于紅細胞，故沉積在中層；最上層淡黃色為貧血小板血漿(platelet-poor plasma， PPP)。制備結束后可立即得到液態CGF，并可用于面部皮膚注射，改善皮膚質地。放置后可獲得CGF凝膠。棄除上層血漿，用無菌剪刀自中間層及底層交界處剪開，并用各種專用工具將中間層CGF壓制成膜(創面覆蓋)，與自體骨顆粒復合(骨創腔填充)，修剪CGF膜至顆粒直徑1～3 mm與自體脂肪復合(脂肪填充移植)，用于各種特殊用途的組織修復。

3 CGF的生物學功能

CGF的主要成分為豐富的血小板、白細胞，外周血干細胞和高濃度的各類生長因子及纖維蛋白原所形成的纖維網狀支架。CGF 具有刺激多種細胞增殖和分化的生物功能，其作用的發揮除了有賴于其高濃度的各類生長因子及纖維蛋白原所形成的纖維網狀支架外，還依賴于富含的血小板、白細胞和外周血干細胞等。主要功能：⑴細胞生長因子的調節作用。在制備CGF過程中，特殊的變速離心使血小板被激活，血小板胞吐α顆粒釋放出各種生長因子，這些細胞生長因子通過與細胞膜上相應的受體相結合，激活下游信號通路，將信號傳至核內，促進細胞增殖、基質合成和血管生成。⑵纖維蛋白形成的支架結構。生物材料的生物學性能取決于材料的組成與空間結構。當自體全血的凝血機制被觸發后，纖維蛋白原轉化為纖維蛋白多聚體成為凝血塊的基質成分，并在離心過程中將接近全部的血小板、超過半數的白細胞、血循環中散在的小分子活性物質(細胞因子等)網羅于新形成的凝血塊中，纖維蛋白作為一種基質為細胞的附著、遷移以及分化提供了有利的場所。CGF在離心分離過程中，由于纖維蛋白原分子的聚合，纖維蛋白塊可組成三維聚合物。CGF纖維蛋白分子結構為三鍵式聯結，呈立體網狀結構，可有效地滯納血小板及各種循環分子(如細胞因子)。而纖維網狀支架又能支持生長因子所誘導生成的新生組織，使修復細胞、紅細胞、白細胞、血小板及抗體易于遷移和增殖。⑶炎癥調節。纖維蛋白聚合形成的網狀結構內有大量白細胞、免疫細胞和免疫調節因子，如白細胞介素(IL-1β，IL-6，IL-4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等存在，使CGF具有一定的免疫防御與局部抗炎功效，能減輕創傷后的炎癥反應，促進組織修復。⑷引導循環血中干細胞的遷移、增殖和分化。纖維蛋白網狀結構是CGF的基質支架，有趨化作用，可募集血循環中的干細胞；支持細胞遷移，促進細胞黏附。在CGF內有大量CD34陽性細胞[2]，表明其基質內有外周血造血干細胞存在，可促進組織再生和分化。⑸止血。血小板具有凝血和止血的重要功能，它參與生理性止血的全過程。當血管壁受損時，它能迅速在血管受損部位形成止血栓，迅即發生變形，使表面黏度增大，凝聚成團。一般通過黏附、釋放、聚集、收縮、吸附等步驟來完成其止血的生理功能?？梢?，其在機體的出凝血和炎癥反應過程中具有重要作用。

4 CGF的臨床應用

4.1 傷口愈合 創面愈合是生物體與生具有的自然生物學屬性，是一個復雜而有序的生物學過程，主要包括炎性介質反應、細胞增殖/結締組織形成、創面收縮和創面重塑幾個階段。創面愈合的復雜病理、生理過程涉及炎細胞、修復細胞、細胞外基質和細胞因子等諸多環節的相互作用，任一環節受抑，都會影響愈合的速度和質量。難愈創面的出現是自然修復過程的停滯甚至惡化，其特點為：⑴常有血運不良的深部組織外露，如骨組織、肌腱或腱膜組織。⑵常有異物、壞死組織殘留或潛腔形成。⑶創面周圍組織血流循環不良、缺血缺氧或瘢痕形成。⑷常伴有病原菌感染，特別是耐藥菌感染。近年來在難愈性創面的臨床治療中，隨著對創面修復機制的深入研究，局部細胞生長因子數量減少，活性降低或多種生長因子網絡調節失控也是創面難愈的原因之一，因此，細胞生長因子在促進創面愈合中的應用也越來越多[11-13]。過去用細胞生長因子在難愈創面的治療中使用單一因子治療的比較廣泛，也取得了比較好的效果。但研究證實，在創面愈合的不同階段，各類生長因子的產生量、受體活性和作用并不是完全同步的，各因子之間具有協同作用。PRP、PRF和CGF都含有高濃度各種生長因子。這些細胞生長因子對創面的愈合起著非常重要的作用，因各生長因子的比例與體內正常比例相似，并具有最佳的協同作用，在一定程度上彌補了單一生長因子治療的缺點。PRP、PRF和CGF是治療慢性潰瘍最有前途的治療方法。這類治療已被應用于具有各種基礎疾病(糖尿病、外周動脈疾病、皮膚結節性多動脈炎)患者的慢性足部潰瘍[14]、常規治療失敗的胸外科手術裂開傷口[15]、硬腭創口不能直接關閉的創面并獲得成功[16]，尚未發現局部或全身的并發癥?；诖?，對慢性潰瘍患者的治療進入了一個新時代。

4.2 面部年輕化 面部老化表現為皮膚質量下降、皮下軟組織萎縮以及面部組織松弛和移位等。面部年輕化的治療主要有面部除皺、面部皮膚抗老化、脂肪及生物材料填充等。研究表明，老化的皮膚厚度變薄、彈性降低、失去光澤、出現皺紋及色斑等。CGF在皮膚抗衰老中的作用主要是：多種高濃度生長因子被激活后，可引起衰老受損皮膚組織產生一系列抗衰老反應，如抵抗DNA合成抑制因子，促發相應的基因表達而起作用。另外，CGF成分中含有的纖維素纖粘連蛋白及親玻粘連蛋白，將血小板釋放的生長因子聚集在局部而發揮作用，還能作為新生細胞和組織支架促進衰老皮膚的修復。應用細胞生長因子可誘導皮膚膠原沉積，使血管再生和脂肪形成，增加皮膚光澤、恢復皮膚彈性及飽滿度[17-20]。Sclafani[20]將富含細胞生長因子的PRF注射于患者鼻唇溝的皮下組織，術后2周，可出現明顯的嫩膚治療效果；隨訪3個月，患者的面部皮膚彈性及飽滿度仍保持良好。自體顆粒脂肪移植也用于改善面部輪廓的老化，但是，移植脂肪不可能全部存活，術后有部分移植脂肪出現吸收，其遠期效果的不確定性成為脂肪移植的最大缺陷。一般來說，脂肪移植后吸收率為20%～90%(RA Ersek, 1991年)。脂肪移植的成活與多種因素有關，如供區因素、受區因素、脂肪抽吸方法的選擇和輔助用藥等。要提高移植脂肪的成活率，首先要促進移植脂肪細胞與受區建立血供，其次是抑制脂肪細胞分解，促進前脂肪細胞的增殖分化，促進移植體內纖維組織的增生，因此，才能保證移植體的最終體積，起到脂肪移植填充組織的作用。Liu等[21]發現，PRF以其富含具有調節組織修復能力的血小板及其活化后釋放的多種細胞因子的特點，可有效地促進移植脂肪血管化，延緩或抑制移植脂肪細胞的凋亡，提高移植脂肪成活率。富含生長因子的PRP、PRF與自體顆粒脂肪混合移植，能夠提高移植脂肪的存活，明顯減少淤斑和脂肪吸收[22-23]。細胞生長因子可加速移植脂肪早期的血管重建并抑制脂肪細胞凋亡壞死，從而達到移植脂肪成活率的提高。2007年，F Braccini和DM Dohan將PRF與顆粒脂肪復合用于32例面部脂肪移植，由于脂肪吸收很少，1次治療后，患者對療效非常滿意，未出現因脂肪吸收而需要2次再注射脂肪的情況。 Keyhan等[24]采用自身對比的方法，對PRF與PRP混合顆粒脂肪注射填充面頰部和顴頰部進行了比較，結果表明PRF比PRP更適合與顆粒脂肪復合用于面部脂肪移植，因為PRF比PRP作用更穩定和持久，一旦聚合形成，其硬度如人類完整皮膚一般，其支架結構能夠抵抗生理壓力，留存更長久。Rodella等[2]檢測發現，CGF內除了有大量細胞生長因子外，還含有CD34陽性細胞，這意味著CGF中有外周血干細胞的存在，能促進前脂肪細胞向脂肪細胞轉換。

4.4 皮片與皮瓣移植 皮膚移植術主要包括皮片移植和皮瓣移植，是整形美容外科修復創面的基本術式。移植皮片的存活有3個關鍵步驟：⑴可靠的固定。皮片易滑動移位以至無營養來源而壞死。⑵皮片與受植床的適宜結合。皮片與受植床基底部應密切接觸，貼合不緊可影響皮片成活；壓力過大則血管向皮片生長受阻礙，也會造成皮片壞死。⑶成熟(有效的血供建立)。在一個單中心隨機對照持續9個月的前瞻性研究中，Waiker 等將200例創傷植皮患者分為兩組。實驗組將自體富含細胞生長因子的PRP應用于移植床黏合皮片，對照組則采用常規方法縫合固定皮膚移植皮片于創面[27]。其結果：PRP組的移植區血腫、受區腫脹、敷料更換次數和住院時間等都低于對照組，而且還能減輕植皮供區疼痛[28]。細胞生長因子可促進植皮創面血管生成和Ⅰ型膠原的沉積[14]，如果用于皮瓣受區，能促進皮瓣的血管化，提高皮瓣的成活率[29]。

4.5 脫發與發移植 脫發從古至今一直存在治療上無理想方法。隨著細胞生長因子的應用，使得部分生發無望的患者在脫發區長出新頭發，可見，細胞生長因子具有誘導毛乳頭細胞增殖的生發作用[30-32]。Singh[30]將PRP注入慢性斑禿的頭皮病損區，間隔4周再注射，共治療6個療程。結果20例患者都有新發生長，除1例復發外，無任何不良反應。Gkini等[31]用PRP對20例脂溢性斑禿患者進行沖擊治療，脫發減少，3個月內達到正常水平，其頭發密度在3個月時達到高峰；6個月和1年時，相對于治療前頭發明顯增加，無明顯的不良反應，患者滿意。盡管還沒有看到細胞生長因子在植發上的應用，但相信CGF技術一定會推動毛發移植技術的不斷革新。

5 展望

CGF與RPR和PRF一樣在本質上都是富含血小板、白細胞、纖維蛋白原和細胞生長因子的血液提取物。CGF的制作原理和PRF 相同，但是，CGF通過特定的程序來改變離心轉速，從而更好地富集生長因子和蛋白纖維。與PRF比較，CGF 能獲取更致密的纖維凝膠及濃度更高的生長因子[1-7]。其優點：⑴CGF是自源性的，這從根本上避免了外源性生長因子引起免疫排斥、傳播疾病以及異種重組基因產品，可能改變人類遺傳結構的擔憂。另外，在制備過程中不添加任何生物化學制劑，安全可靠。⑵CGF含有大量的纖維蛋白，可以黏合骨折塊和填充骨腔，為修復細胞提供良好的支架。⑶CGF制備成膠狀覆蓋創面，不僅提供了濕潤的環境，有利于傷口愈合生長，還可以使生長因子長時間局限作用于傷口處，避免了目前廣泛應用于臨床的液態重組生長因子試劑在傷口易流失、易蒸發的缺點。⑷CGF中還含有大量高濃度的白細胞，可以防止感染發生。⑸CGF可減輕術后出血及疼痛，減少術后并發癥。⑹CGF制作簡單，對患者創傷??；約15 min即可完成。

鑒于CGF具有的多種細胞增殖和分化作用以及促進組織再生與修復的獨特優勢，其生物學功能正在被人們逐步認識，在抗衰老與面部年輕化、創傷修復(慢性潰瘍、大面積撕脫傷，組織缺損、骨移植等)、皮片移植和皮瓣成活、生發和植發等整形美容外科領域有望出現重大突破。

[2] Rodella LF, Favero G, Boninsegna R, et al. Growth factors, CD34 positive cells, and fibrin network analysis in concentrated growth factors fraction[J]. Microsc Res Tech, 2011,74(8):772-777.

[3] Yu B, Wang Z. Effect of concentrated growth factors on beagle periodontal ligament stem cells in vitro[J]. Mol Med Rep, 2014,9(1):235-242.

[4] Kim JM, Sohn DS, Bae MS, et al. Flapless transcrestal sinus augmentation using hydrodynamic piezoelectric internal sinus elevation with autologous concentrated growth factors alone[J]. Implant Dent, 2014,23(2):168-174.

[5] Sohn DS, Heo JU, Kwak DH, et al. Bone regeneration in the maxillary sinus using an autologous fibrin-rich block with concentrated growth factors alone[J]. Implant Dent, 2011,20(5):389-395.

[7] Kim TH, Kim SH, Sándor GK, et al. Comparison of platelet-rich plasma(PRP), platelet-rich fibrin (PRF), and concentrated growth factor (CGF) in rabbit-skull defect healing[J]. Arch Oral Biol, 2014,59(5):550-558.

[8] Kawase T. Platelet-rich plasma and its derivatives as promising bioactive materials for regenerative medicine: basic principles and concepts underlying recent advances[J]. Odontology, 2015,103(2):126-135.

[9] Pal US, Mohammad S, Singh RK, et al. Platelet-rich growth factor in oral and maxillofacial surgery[J]. Natl J Maxillofac Surg, 2012,3(2):118-123.

[10] Agarwal B, Gagnani S, Roychoudhury A, et al. Optimum use of platelet-rich fibrin:technical note[J]. Br J Oral Maxillofac Surg, 2015,53(7):664-645.

[11] Reksodiputro M, Widodo D, Bashiruddin J, et al. PRFM enhance wound healing process in skin graft[J]. Facial Plast Surg, 2014,30(6):670-675.

[12] Naik B, Karunakar P, Jayadev M, et al. Role of Platelet rich fibrin in wound healing: A critical review[J]. J Conserv Dent, 2013,16(4):284-293.

[13] Ramos-Torrecillas J, De Luna-Bertos E, García-Martínez O, et al. Clinical utility of growth factors and platelet-rich plasma in tissue regeneration: a review[J]. Wounds, 2014,26(7):207-213.

[14] Yotsu RR, Hagiwara S, Okochi H, et al. Case series of patients with chronic foot ulcers treated with autologous platelet-rich plasma[J].J Dermatol, 2015,42(3):288-295.

[15] Tashnizi MA, Alamdari DH, Khayami ME, et al. Treatment of non-healing sternum wound after open-heart surgery with allogenic platelet-rich plasma and fibrin glue-preliminary outcomes[J]. Indian J Plast Surg, 2013,46(3):538-542.

[16] Kulkarni MR, Thomas BS, Varghese JM, et al. Platelet-rich?fibrin as an adjunct to palatal wound healing after harvesting a free gingivalgraft: A case series[J]. J Indian Soc Periodontol, 2014,18(3):399.

[17] Sclafani AP, Azzi J. Platelet Preparations for Use in Facial Rejuvenation and Wound Healing: A Critical Review of Current Literature[J]. Aesthetic Plast Surg, 2015,39(4):495-505.

[18] Fabi S, Sundaram H. The potential of topical and injectable growth factors and cytokines for skin rejuvenation[J]. Facial Plast Surg, 2014,30(2):157-171.

[19] Sclafani AP, McCormick SA. Induction of dermal collagenesis, angiogenesis, and adipogenesis in human skin by injection of platelet-rich fibrin matrix[J]. Arch Facial Plast Surg, 2012,14(2):132-136.

[20] Sclafani AP. Platelet-rich fibrin matrix for improvement of deep nasolabial folds[J]. J Cosmet Dermatol, 2010,9(1):66-71.

[21] Liu B, Tan XY, Liu YP, et al. The adjuvant use of stromal vascular fraction and platelet-rich fibrin for autologous adipose tissue transplantation[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2013,19(1):1-14.

[22] Liao HT, Marra KG, Rubin JP. Application of platelet-rich plasma and platelet-rich fibrin in fat grafting: basic science and literature review[J].Tissue Eng Part B Rev, 2014,20(4):267-276.

[23] Serra-Mestre JM, Serra-Renom JM, Martinez L, et al. Platelet-rich plasma mixed-fat grafting: a reasonable prosurvival strategy for fat grafts?[J]. Aesthetic Plast Surg, 2014,38(5):1041-1049.

[24] Keyhan SO, Hemmat S, Badri AA, et al. Use of platelet-rich fibrin and platelet-rich plasma in combination with fat graft: which is more effective during facial lipostructure?[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2013,71(3):610-621.

[25] Yoon JS, Lee SH, Yoon HJ. The influence of platelet-rich fibrin on angiogenesis in guided bone regeneration using xenogenic bone substitutes: a study of rabbit cranial defects[J]. J Craniomaxillofac Surg, 2014,42(7):1071-1077.

[26] Mathur A, Bains VK, Gupta V, et al. Evaluation of intrabony defects treated with platelet-rich fibrin or autogenous bone graft: a comparative analysis[J]. Eur J Dent, 2015,9(1):100-108.

[27] P Waiker V, Shivalingappa S. Comparison between Conventional Mechanical Fixation and Use of Autologous Platelet Rich Plasma (PRP) in Wound Beds Prior to Resurfacing with Split Thickness Skin Graft[J]. World J Plast Surg, 2015,4(1):50-59.

[28] Miller JD, Rankin TM, Hua NT, et al. Reduction of pain via platelet-rich plasma in split-thickness skin graft donor sites: a series of matched pairs[J]. Diabet Foot Ankle, 2015,22(6):24972.

[29] Findikcioglu F, Findikcioglu K, Yavuzer R, et al. Effect of preoperative subcutaneous platelet-rich plasma and fibrin glue application on skin flap survival[J]. Aesthetic Plast Surg, 2012,36(5):1246-1253.

[30] Singh S. Role of platelet-rich plasma in chronic alopecia areata: Our centre experience[J]. Indian J Plast Surg, 2015,48(1):57-59.

[31] Gkini MA, Kouskoukis AE, Tripsianis G, et al. Study of platelet-rich plasma injections in the treatment of androgenetic alopecia through an one-year period[J]. J Cutan Aesthet Surg, 2014,7(4):213-219.

[32] Sclafani AP. Platelet-rich fibrin matrix (PRFM) for androgenetic alopecia[J]. Facial Plast Surg, 2014,30(2):219-224.

210029 江蘇 南京，南京醫科大學附屬友誼整形外科醫院 整形美容科

王 昕(1974-)，女，黑龍江哈爾濱人，副主任醫師.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.05.020

2015-11-28)