固本防哮飲對信號轉導及轉錄激活因子1及哮喘易感基因ORMDL3的影響*

董盈妹　王愛華　陸　遠　凌　昊　劉亞南　趙　霞△（1.南京中醫藥大學中醫兒科學研究所，江蘇 南京 21002；2.江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t藥）重點實驗室，江蘇 南京 21002；.江蘇省宜興市中醫醫院，江蘇 宜興 214200）

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固本防哮飲對信號轉導及轉錄激活因子1及哮喘易感基因ORMDL3的影響*

董盈妹1，2王愛華1，2陸遠1，2凌昊3劉亞南1，2趙霞1，2△
（1.南京中醫藥大學中醫兒科學研究所，江蘇 南京 210023；2.江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t藥）重點實驗室，江蘇 南京 210023；3.江蘇省宜興市中醫醫院，江蘇 宜興 214200）

目的 觀察固本防哮飲對信號轉導和轉錄因子1（STAT1）及哮喘易感基因血清類黏蛋白1樣蛋白3 （ORMDL3）的調控作用，分析其防治哮喘機制。方法 利用白介素-4誘導人支氣管上皮細胞建立哮喘細胞模型，固本防哮飲含藥血清對其進行干預，采用實時熒光定量-PCR（Real Time PCR）、免疫印跡法（Western blotting，WB）、免疫熒光法（IF）分別從基因、蛋白水平檢測細胞中ORMDL3和STAT1的表達及亞細胞定位。結果 與正常組比較，模型組ORMDL3、STAT1 mRNA含量升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），固本防哮飲可降低模型組細胞ORMDL3、STAT1 mRNA水平，差異無統計學意義（P＞0.05）；與正常組比較，模型組ORMDL3、STAT1蛋白表達顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），與模型組相比，固本防哮飲組ORMDL3及STAT1蛋白表達均顯著（P＜0.05）。結論 固本防哮飲對STAT1及ORMDL3的表達有一定的調控作用，可能為固本防哮飲防治哮喘的內在機制。

固本防哮飲哮喘易感基因血清類黏蛋白1樣蛋白3信號轉導和轉錄因子1

【Abstract】Objective：To investigate the effect of Guben Fangxiao Decoction on STAT1 and asthma susceptibility gene ORMDL3，and analyze its mechanism.Methods：16HBE cells were cultured in the presence of the Th2 cytokines IL-4 for 24 hours，and then treated with Guben Fangxiao Decoction.Expressions of ORMDL3 and STAT1 were assessed by quantitative real-time PCR，Western Bloting and Immunofluorescence.Results：The expressions of ORMDL3 and STAT1 mRNA were increased after IL-4 stimulation，compared with normal 16HBE，but the differences had no statistical significance（P＞0.05）.Compared with the model group，Guben Fangxiao Decoction could decrease the expressions of ORMDL3 and STAT1 mRNA；the differences had no statistical significance（P＞0.05）.Compared with the normal group，expressions of ORMDL3 and STAT1 protein of the model group were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with the model group，Guben Fangxiao Decoction significantly decrease cell constitution of ORMDL3 and STAT1 protein（P＜0.05）.Conclusion：The prevention of Guben Fangxiao Decoction against asthma may be associated with regulation of STAT1 and ORMDL3.

【Key words】Guben Fangxiao Decoction；Asthma；Susceptibility gene；ORMDL3；STAT1

支氣管哮喘是由遺傳因素和環境因素共同作用的異質性呼吸系統疾病。據估算全球大約有3億哮喘患者，且每年約有346000人死于哮喘［1］，第3次流行病學調查結果顯示，我國主要城區兒童哮喘總患病率約為3.02%，2年現患率達2.32%，累積患病率、現患病率均呈上升趨勢［2］，因此探索支氣管的有效防治有重要意義。2007年，Moffatt MF等［3］通過對994例哮喘患兒，1243例非哮喘兒童DNA中317000個SNPs進行分析發現，血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）與兒童哮喘密切相關，ORMDL3可被Th2型細胞因子 ［白介素（IL）-4或IL-13］激活并主要在氣道上皮細胞上表達［4］。信號轉導和轉錄因子1（STAT1）是哮喘的免疫調節中至關重要的調控因子。本研究應用IL-4刺激16HBE細胞模擬哮喘時細胞狀態，旨在通過體外實驗從基因、蛋白水平研究固本防哮飲對STAT1及哮喘易感基因ORMDL3的調控作用?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑人支氣管上皮細胞（16HBE），購自上海博古生物科技有限公司，采用第4～10代對數分裂期細胞。IL-4（美國R&D，批號：AG301307）；兔抗ORMDL3多克隆抗體、羊抗兔IgG HRP二抗 （美國abcam公司）；羊抗ORMDL3多克隆抗體、鼠抗β-actin多克隆抗體、兔抗STAT1多克隆抗體、羊抗鼠IgG HRP二抗（美國Santa Cruz公司）；驢抗羊IgG（美國invitrogen公司）；引物（具體序列見表1，上海生工生物工程公司）

表1　Real time-PCR引物序列

1.2儀器蛋白印跡-多功能成像系統、半干式轉膜儀、Western Blot電泳儀（美國Bio-Rad公司）；多功能酶標儀（Infinite M200PRO，瑞士TECAN公司）；蛋白核酸分析儀、PCR逆轉錄儀（德國eppendorf公司）；熒光定量PCR儀（型號：Quantstudio 7Flex，美國Life technologies公司）；激光共聚焦顯微鏡系統TCS SP5（德國Leica公司）。

1.3含藥血清制備按9 g/kg固本防哮飲生藥量、孟魯司特鈉1.0 mg/kg及等體積0.9%氯化鈉注射液對家兔進行灌胃，每日2次，連續給藥3 d。末次給藥1 h后對家兔進行耳尖靜脈麻醉后頸動脈采血，無菌離心取血清，過濾后-20℃保存備用［5］。

1.4細胞培養及造模16HBE細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640的T75培養瓶，置于37℃、5% CO2培養箱中。待生長狀態良好的細胞接近鋪滿單層時以0.2%的胰酶消化傳代，稀釋細胞濃度至5×105/mL傳入6孔板中 （免疫熒光時提前在6孔板中加入潔凈蓋玻片），待細胞長至60%（免疫熒光長至50%），換用含0.2%BSA的RPMI1640無血清同步化8 h。實驗分組：正常對照組；模型組（0.1 g/L IL-4刺激24 h）［6］；固本防哮飲組、孟魯司特鈉組造模后分別予10%固本防哮飲、孟魯司特鈉含藥血清干預24 h。

1.5免疫熒光檢測PBS漂洗3次后，予預冷的4%多聚甲醛（PFA）固定30 min，0.1%Triton處理10 min，200 μL/孔含1%BSA封閉1 h，1%BSA稀釋的目的蛋白一抗（1∶200）4℃冰箱過夜，PBS漂洗后加入含熒光標記的二抗（1∶1000）于避光濕盒中孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI染色3 min，漂洗后予熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6Western blotting法檢測RIPA∶PMSF=100∶1配制裂解液，200 μL/孔。4℃13000 r/min 30 min離心取上清，BCA法蛋白定量，30μg/孔進行凝膠電泳 （80 V 30 min；110 V 1 h），ORMDL3（5%積層膠，12%分離膠），STAT1（5%積層膠，8%分離膠），將SDS-PAGE凝膠蛋白轉移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h、一抗（ORMDL3/STAT1 1∶500稀釋、β-actin 1∶1000稀釋）4℃孵育過夜、二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育2 h，過程中均以1×TBST漂洗3次，每次10 min。加ECL化學發光法顯影，蛋白印跡-多功能成像系統、Image Lab軟件拍照并掃描各條帶的灰度值，結果分析以ORMDL3或STAT1與內參β-actin灰度值比值表示。

1.7Real-time PCR法檢測1 mL Trizol/孔提取各組細胞總RNA，按TAKARA逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA，按20 μL體系（SYBR 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ROXⅡ0.4 μL，DEPC 6μL）加入96孔板內，2步法進行Real-time PCR檢測，反應條件為，第1步：95℃ 30 s，第2步：95℃5 s，60℃30～34 s；重復40個循環。Real-time PCR結果以內參基因β-actin進行校準，以2-ΔΔCT表示。

1.8統計學處理應用SPSS19.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，當方差不齊時，采用T檢驗進行配對比較檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1固本防哮飲對哮喘易感基因ORMDL3的影響

2.1.1免疫熒光結果見圖1，表2。ORMDL3蛋白主要表達于細胞質中，與正常組比較，模型組細胞ORMDL3調控的蛋白熒光強度顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，固本防哮飲及孟魯司特鈉含藥血清干預后，細胞內ORMDL3蛋白熒光強度顯著減弱 （P＜0.05或P＜0.01）。

圖1　免疫熒光檢測各組細胞ORMDL3表達水平

2.1.2Western blotting檢測結果見圖2，表3。結果顯示，與正常組比較，模型組細胞中ORMDL3蛋白的表達顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，固本防哮飲、孟魯司特鈉含藥血清干預后ORMDL3蛋白表達量減少（P＜0.05或者P＜0.01），提示固本防哮飲能夠下調模型組細胞ORMDL3蛋白的高表達狀態。

表2　各組細胞ORMDL3蛋白熒光值比較（±s）

表2　各組細胞ORMDL3蛋白熒光值比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別　n ORMDL3熒光值正常組　3模型組　3固本防哮飲組　3 4.3500±1.04130**30.6600±2.01487 16.5033±3.88402**孟魯司特鈉組　311.1133±3.05197**

圖2　各組細胞ORMDL3蛋白表達

表3　各組細胞ORMDL3蛋白灰度比值比較（±s）

表3　各組細胞ORMDL3蛋白灰度比值比較（±s）

組別　n ORMDL3/β-actin比值正常組　3模型組　3固本防哮飲組　3 1.0110±0.22407*1.5277±0.22547 1.0001±0.09545*孟魯司特鈉組　30.9253±0.21231**

2.1.3Real-time PCR檢測結果見表4。模型組細胞ORMDL3 mRNA較正常組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），固本防哮飲、孟魯司特鈉組細胞ORMDL3 mRNA水平較模型組降低，無顯著意義（P＞0.05），提示固本防哮飲可能對ORMDL3 mRNA高表達狀態有調控作用。

表4　各組細胞ORMDL3 mRNA轉錄水平比較（±s）

表4　各組細胞ORMDL3 mRNA轉錄水平比較（±s）

組別　n 2-△△CT正常組　3模型組　3固本防哮飲組　3 1.2153±0.23247 1.2493±0.25064 1.0617±0.23953孟魯司特鈉組　30.8607±0.06401

2.2固本防哮飲對STAT1的影響

2.2.1免疫熒光結果見圖3，表5。圖片顯示，STAT1蛋白可在細胞質及細胞核內表達，IL-4刺激后STAT1胞核內表達增加，與正常組比較，模型組細胞內STAT1蛋白熒光表達顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，固本防哮飲組及孟魯司特鈉組細胞內STAT1蛋白熒光水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示固本防哮飲能夠下調模型組細胞ORMDL3蛋白的高表達狀態。

圖3　免疫熒光檢測各組細胞STAT1表達水平

表5　各組細胞STAT1熒光值比較（±s）

表5　各組細胞STAT1熒光值比較（±s）

組別　n ORMDL3熒光值正常組　3模型組　3固本防哮飲組　3 4.7200±1.63789 23.8567±3.08455△14.3233±0.97577*孟魯司特鈉組　317.7100±1.29626*

2.2.2Western blotting檢測結果見圖4，表6。與正常組比較，模型組細胞STAT1蛋白水平顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，固本防哮飲組、孟魯司特鈉組較模型組STAT1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），提示固本防哮飲可下調16HBE細胞STAT1蛋白的高表達狀態。

圖4　各組細胞STAT1蛋白表達

表6　各組細胞STAT1蛋白灰度比值比較（±s）

表6　各組細胞STAT1蛋白灰度比值比較（±s）

組別　n ORMDL3/β-actin比值正常組　3模型組　3固本防哮飲組　3 1.2898±0.14065**1.9300±0.14591 1.3943±0.31701*孟魯司特鈉組　31.4715±0.13450*

2.2.3Real-time PCR檢測結果見表7。模型組細胞STAT1 mRNA較正常組升高，但無顯著差異（P＞0.05），固本防哮飲、孟魯司特鈉組能夠降低模型組細胞STAT1mRNA水平，但無顯著差異（P＞0.05），提示固本防哮飲可能對STAT1 mRNA高表達狀態有調控作用。

表7　各組細胞STAT1 mRNA轉錄水平比較（±s）

表7　各組細胞STAT1 mRNA轉錄水平比較（±s）

組別　n 2-ΔΔCT正常組　3模型組　3固本防哮飲組　3 1.4960±0.60880 1.7583±0.80276 1.5670±0.75196孟魯司特鈉組　31.0037±0.11433

3　討　論

《王旭高醫案》云“痰戀不化，氣機阻滯，一觸風寒，喘即舉發”。中醫理論認為，肺為儲痰之器，脾為生痰之源，小兒臟腑嬌嫩、正氣未充或因先天稟賦不足，膠痼之痰伏于肺中，外邪引動，哮喘隨之發作。固本防哮飲為國家名老中醫江育仁先生的經驗方，具補肺固表，健脾化痰的功效。通過調理哮喘緩解期患兒臟腑功能，消除內伏“風痰夙根”，可達治病求本的功效。一項隨機對照臨床試驗［7］表明固本防哮飲聯合穴位敷貼可顯著減少患兒哮喘發作次數，較普米克都保吸入更能顯著減輕哮喘發作的嚴重程度。

ORMDL3基因位于17q21位點，國內一項大規模Meta分析［8］顯示ORMDL3基因rs72l6389多態性是中國人成人和兒童哮喘發病的危險因素。其他研究表明ORMDL 3與EB病毒及人鼻病毒（HRV）等呼吸道感染有關［3，9］。其可能機制為以下2個方面。1）通過抑制內質網鈣泵（SERCA），ORMDL3加重內質網未折疊蛋白反應，修飾T細胞活化的關鍵步驟，為哮喘發生的內源性誘因［3］。如有文獻［10］表明，以ER誘導物引起UPR在ORMDL3基因敲除細胞及正常細胞中表達并沒有顯著差異。2）ORMDL3蛋白與絲氨酸棕櫚轉移酶（SPT）形成穩定復合物抑制鞘類脂質代謝，病理情況下，ORMDL 3蛋白磷酸化減少復合物的形成，下調ORMDL 3對鞘類脂質合成的抑制作用。然而Kiefer K等實驗證明ORMDLs確實可抑制SPT的活化，但單個ORMDLs的表達增加并沒有減少細胞內神經酰胺的含量，這與ORMDL3 SNPs與合成途徑完全抑制所致的細胞鞘脂類含量有關的觀點相沖突［11］。因此鞘脂類代謝可能參與ORMDL3誘發哮喘機制，但是二者關系較為復雜，需進一步探索。STAT1是連接多種細胞膜受體與選擇性效應器之間信號轉導的主要蛋白質，細胞因子 IL-4、IFN-γ等可通過 JAK/STAT途徑激活STAT1而誘導目的基因表達。Tetsuya Homma等利用病毒產物dsRNA及炎癥因子協同刺激氣道上皮細胞研究表明TNF-α、IFN-γ及dsRNA在哮喘中的作用均可能依賴STAT1而產生［12］。此外，O′Connell D等研究顯示，IFN-γ可通過JAK/STAT信號通路降低呼吸道上皮細胞對糖皮質激素的敏感性，同時siRNA-STAT1轉染可恢復細胞內類固醇的應答反應，提示通過抑制STAT1作用可提高吸入性糖皮質激素對嚴重型哮喘的治療效果［13］。由此可見STAT1及易感基因ORMDL3均與哮喘關系密切，但目前尚無二者相關的國內外文獻依據。

前期體內實驗研究表明固本防哮飲可顯著改善哮喘小鼠氣道炎癥，下調哮喘模型小鼠肺組織STAT1及ORMDL3的表達［14-15］。本體外實驗結果顯示，固本防哮飲組STAT1及ORMDL3 mRNA及蛋白表達均較模型組降低，盡管mRNA差異無顯著統計學意義，其可能原因與在基因的轉錄、翻譯及翻譯后修飾過程中存在多種調控機制以及實驗誤差有關。由此推斷固本防哮飲對STAT1及ORMDL3的表達有一定的調控作用，可能為固本防哮飲防治哮喘的內在機制，但STAT1與ORMDL3的表達是否相關仍需要進行通路阻滯等實驗進一步驗證。本課題組接下來將通過構建ORMDL3質粒，通過質粒轉染的方法進一步探索固本防哮飲對易感基因的調控機制，為中藥復方防治哮喘的臨床應用及推廣提供科學依據。

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Influence of Guben Fangxiao Decoction on Expressions of STAT1 and Asthma Susceptibility Gene ORMDL3 in Vitro

DONG Yingmei，WANG Aihua，LU Yuan，et al.Institute of Pediatrics of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China.

R256.12

A

1004-745X（2016）05-0762-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.004

國家自然科學基金項目（81173299；81473723）
△

（電子郵箱：zhaoxiahy@126.com）

2015-12-29）