基于TGF-β-MAPK信號通路探討狼瘡定對SLE的治療作用*

徐晨婷　李海昌　謝志軍　溫成平（浙江中醫藥大學，杭州 浙江 310053）

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基于TGF-β-MAPK信號通路探討狼瘡定對SLE的治療作用*

徐晨婷李海昌謝志軍溫成平△
（浙江中醫藥大學，杭州 浙江 310053）

目的 觀察狼瘡定對MRL/lpr狼瘡模型鼠的轉化生長因子β（TGF-β）-MAPK信號通路上的蛋白含量變化的影響。探討狼瘡定治療SLE的內在機制，為治療SLE提供理論依據。方法 制備MRL/lpr狼瘡模型鼠，取小鼠脾臟組織，提取其淋巴細胞總蛋白，再對提取總蛋白行濃度測試，然后根據蛋白濃度上樣，進行蛋白免疫印跡實驗，蛋白表達情況，進行結果分析。結果 Western blot法對小鼠各組脾臟淋巴細胞TGF-β2蛋白進行電泳實驗結果示，正常組TGF-β2表達極少，而模型組表達明顯升高，而中藥組表達明顯下降。正常組小鼠脾臟淋巴細胞JNK表達含量很少，而中藥組表達很高，但中藥組表達比模型組明顯下降。正常組Erk表達很高，狼瘡小鼠模型組表達下降，中藥組用藥后，Erk表達仍較少，與模型組區別度不明顯。結論 以TGF-β-MAPK信號通路為基礎，根據蛋白免疫印跡法實驗發現，狼瘡定影響MRL/lpr狼瘡模型鼠脾臟淋巴細胞總蛋白的表達，可能是狼瘡定治療SLE的機制。

TGF-β-MAPK信號通路MRL/lprWestern blot

【Abstract】Objective：To observe the effect of Langchuangding on the change of protein content in TGF-β-MAPK signaling pathway of a given MRL/lpr mouse with lupus，and investigate the inherent mechanism of treatment on SLE to provide a theoretical basis.Methods：MRL/LPR mice model with Lupus was fed and given medicine.Spleen tissues were taken and the lymphocyte of total protein was extracted，and then the extraction of total protein concentration was tested.According to the protein concentration of the sample，protein immunoblot experiments，protein expression were analyzed.Results：According to the protein immunoblot experiment，Langchuangding Decoction had a certain influence on protein expression of spleen lymphocytes in MRL/Lpr mice with lupus.Conclusion：On the basis of TGF-beta-MAPK signaling pathways，according to the protein immunoblot experiment，Langchuangding Decoction has a certain influence on protein expression of spleen lymphocytes in MRL/Lpr mice with lupus.Therefore，Langchuangding Decoction has an influence on MRL/Lpr mice with lupus，which suggests that Langchuangding Decoction has an effect on SLE.

【Key words】TGF-β-MAPK signaling pathway；MRL/lpr；Western blot

系統性紅斑狼瘡（SLE）是累及全身多個系統的自身免疫疾病，主要表現為發熱、皮疹、關節炎、腎炎、溶血性貧血、血小板減少及中樞神經系統損害等［1］。以年輕女性多見，臨床表現為面部蝶形紅斑，多臟器受累，疾病反復發作。它與其他自身免疫疾病一樣，免疫系統攻擊自身細胞和組織，對皮膚黏膜，關節，腎臟，心臟，腦，神經等都有不同程度的損害［2］，對人類的危害極大。

SLE目前無法治愈，西醫沒有較好的治療方法，一般采用激素或免疫抑制劑治療，但其副作用大，如長期服用激素會造成高血壓、消化道潰瘍出血、內分泌紊亂、骨質疏松，免疫抑制劑會導致骨髓抑制，肝功能損害［3-6］，同時治療效果也不突出。因此，研究人員開始研究中藥湯劑對SLE的治療影響。中醫認為，SLE與肝腎陰虛、外感熱毒、內生毒邪及血瘀內阻的病機關系密切，范永升教授提出解毒祛瘀滋陰法是SLE的基本治法［7］，并提煉出基本方狼瘡定。中醫治療SLE，對患者副作用小，同時對西藥副作用具有調理作用。本實驗觀察狼瘡定對 MRL/lpr狼瘡鼠的轉化生長因子 β （TGF-β）-MAPK信號通路上的蛋白含量變化的影響，探討狼瘡定治療SLE的內在機制，為治療SLE提供理論依據?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1動物實驗動物由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，SPF級8周齡C57BL/6J雌性小鼠10只，體質量（21.8±2.1）g，SPF級8周齡MRL/lpr雌性小鼠20只，體質量（30.5±2.1）g，生產許可證號：SCXK（滬）2012-002。

1.2藥物青蒿12 g，炙鱉甲12 g，升麻9 g，白花蛇舌草15 g，積雪草15 g，干地黃15 g，赤芍12 g，炒薏苡仁15 g，佛手片9 g，生甘草6 g。由浙江中醫藥大學制成濃縮液，濃煎為80 mL（質量濃度1.5 g生藥/mL）。

1.3主要儀器電熱恒溫水浴鍋 （型號：DK-S12，上海森信實驗儀器有限公司）；垂直板電泳裝置 （型號：R179，BIO-RAD American），轉膜裝置 （BIO-RAD American），電泳儀（型號：042BR08121，BIO-RAD American）；微量移液器（Eppendorf，Germany）；臺式高速冷凍離心機 （型號：5407XKO26772，Eppendorf Germany）；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號：DGG-9123，上海森信實驗儀器有限公司）；BIO-RAD凝膠圖像分析系統（型號：720BR101492，BIO-RAD American）。

1.4主要試劑上樣緩沖液（4×）：2 mL Tris-HCl （0.5 M，pH 6.8），3.2 mL SDS，0.8 mL β-巰基乙醇，1.6 mL甘油，0.4mL溴酚藍。10%SDS：稱取10 g SDS，加ddH2O定容至100 mL。電泳緩沖液（10×）：30.25 g Tris+ 144.1 g甘氨酸+2 g SDS用 ddH2O定容至1000 mL 4℃保存。轉移緩沖液（1×）：先配轉移緩沖液（4×）：12 g Tris+57.6 g甘氨酸+4 g SDS，定容至800 mL，使用時取200 mL轉移緩沖液 （4×）+600 mL ddH2O+200 mL甲醇，定容至1000 mL。TBS（10×）：750 mL ddH2O，12.12 g Tris，88 g NaCl，調pH8.0，定容至1000 mL。TBST（1×）：50 mL TBS（10×）+0.5 mL Tween-20，ddH2O定容至500 mL。封閉液：5 g脫脂奶粉，溶于100 mL 1×TBST緩沖液，溶解后4℃保存。

1.5動物分組及給藥正常組10只C57BL/6J小鼠；模型組10只MRL/lpr小鼠；中藥組10只MRL/lpr小鼠。適應性喂養1周后開始灌胃給藥。正常組和模型組：灌胃生理鹽水，每日1次；中藥組：灌胃狼瘡定濃縮液，灌胃量為每10 g體質量1mL（給藥劑量為15 g生藥/kg，為臨床劑量的7.5倍），每日1次；連續飼養用藥8周后處死。

表1　96孔板試劑加樣量

1.6觀察指標1）脾臟淋巴細胞總蛋白。取MRL/lpr狼瘡鼠脾臟，加入紅細胞裂解液，用玻璃勻漿器充分研磨，將研磨液于離心管中，10000～14000 g離心5 min，取上清，上清即為淋巴細胞總蛋白。2）總蛋白濃度檢測。（1）檢測步驟：取1.2 mL蛋白標準配置液加入到一管蛋白標準中，充分溶解后配置成25 mg/mL的蛋白標準溶液；取適量25 mg/mL蛋白標準，稀釋至終質量濃度為0.5 mg/mL蛋白標準，加入980 μL稀釋液即可配置成0.5 mg/mL蛋白標準。根據樣品數量，按體積比50∶1取BCA試劑A、BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混合（BCA工作液室溫24 h內穩定）。將標準品按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標準品中，加標準品稀釋液補足到20 μL；加適當體積樣品，一般為1 μL，到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置20～30 min。（2）標準曲線的制作：見表1。上述試劑加完后，準確吸取20 μL樣品溶液于96孔板中，加入BCA試劑200 μL，輕搖，于37℃保溫30～60 min，冷卻至室溫后，以空白為對照，在多功能酶標儀上590 nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線空白為對照，根據樣品的吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質含量。3）蛋白免疫印跡法。（1）SDS-PAGE：檢漏；按表2、3配膠；樣品與樣品處理液（2×）1∶1混勻，于100℃沸水浴煮沸3～5 min，使蛋白質變性，與SDS-蛋白質復合物帶上大量負電荷，消除樣品電荷的影響；上樣量為15～20 μL，用微量進樣器加樣；樣品在濃縮膠時為60 V，到達分離膠后調至80 V，當條帶跑至分離膠底部1 cm處，停止電泳。（2）轉膜準備：電泳結束前30 min，將海綿、濾紙12張、NC膜浸泡到轉移緩沖液中；將凝膠置于轉移緩沖液中漂洗，以洗去SDS，使蛋白變性。（3）轉膜（-）海綿+4層濾紙+凝膠+NC膜+4層濾紙+海綿（+）：凝膠與NC膜之間不留氣泡，NC膜一旦與凝膠接觸覆蓋，則不可移動，NC膜靠正板；80 V，2 h，時間長短根據需轉移的蛋白相對分子質量大小而定，相對分子質量大時間長，相對分子質量小時間短，在轉移的過程中，將電泳槽置于冰水中。（4）封閉：5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，使NC膜上多余的蛋白結合位點完全與之結合。（5）免疫檢測：一抗孵育：加入一抗溶液，置于4℃冰柜搖床上，溫和振蕩過夜；TBST漂洗5 min，重復3次；二抗反應：將二抗稀釋2000倍后與膜室溫下溫和避光振蕩2 h；TBST漂洗5 min，重復3次；用紅外成像系統進行掃膜檢測。

表2　配膠方法

2　結　果

2.1狼瘡定用藥后對狼瘡模型小鼠脾臟淋巴細胞TGF-β2的表達情況見圖1。Western blot法對各組的淋巴細胞TGF-β2蛋白進行電泳實驗。結果示，正常組TGF-β2表達極少，而模型組表達明顯升高，而中藥組表達明顯下降。

圖1　小鼠脾臟淋巴細胞總蛋白TGF-β2及其β-actin免疫印跡圖

2.2狼瘡定用藥后對狼瘡模型小鼠脾臟淋巴細胞JNK的表達情況見圖2。Western blot方法對各組的淋巴細胞JNK蛋白進行電泳實驗。結果示，正常組小鼠脾臟淋巴細胞JNK表達含量很少，而中藥組表達很高，但中藥組表達比模型組明顯下降。

圖2　小鼠脾臟淋巴細胞總蛋白JNK及其β-actin免疫印跡圖

2.3狼瘡定用藥后對狼瘡模型小鼠脾臟淋巴細胞Erk的表達情況見圖3。Western blot方法對各組的淋巴細胞Erk蛋白進行電泳實驗。結果示，正常組Erk表達很高，狼瘡小鼠模型組表達下降，中藥組用藥后，Erk表達仍較少，與模型組區別度不明顯。

3　討　論

SLE是累及全身多個系統，以年輕女性多見，臨床表現為面部蝶形紅斑，多臟器受累，疾病反復發作，對皮膚黏膜、關節、腎臟、心臟、腦、神經等都有不同程度損害，對人類危害極大。SLE目前尚無法治愈，西醫治療一般采用激素或免疫抑制劑治療，但其副作用大，同時治療效果也不突出。因此，研究人員開始研究中藥湯劑對SLE的治療影響。中醫認為，SLE與肝腎陰虛、外感熱毒、內生毒邪及血瘀內阻的病機關系密切，范永升教授提出解毒祛瘀滋陰法是SLE的基本治法［7］，并提煉出基本方狼瘡定。

圖3　小鼠脾臟淋巴細胞總蛋白Erk及其β-actin免疫印跡圖

TGF-β是由2個結構相同或相似的亞單位借二硫鍵連接的雙體。TGF-β廣泛存在于各種細胞中，具有調節細胞分化、生長的功能。TGF-β能夠激活Smads的信號轉導通路，該通路的活化引起細胞生長抑制，誘導其凋亡［8］。同時TGF-β活化了多條絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路［9］。MAPKs是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號轉導通路存在于大部分細胞內，將細胞外刺激信號傳導到細胞及核內，并引發細胞生物學反應，如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等，在這個過程中，具有至關重要的作用。在哺乳動物中已經發現了3條并行的MAPKs信號通路：ERK信號通路，JNK/SAPK通路，p38/MAPK通路［10］。在多種細胞型中，TGF-β均可使ERK、JNK活化。研究證明，TGF-β可通過MAPK通路介導細胞凋亡。綜上所述，TGF-β激活的MAPK級聯轉導途徑在細胞凋亡中具有重要作用。SLE患者的TGF-β-MAPK信號通路相當活躍，介導了大量自身細胞凋亡。凋亡細胞來不及被清除，會作為自身抗原，引起自身免疫應答，導致免疫系統攻擊自身組織和器官，包括了腎臟損害，這也是SLE致死的主要原因。

狼瘡定全方以青蒿透邪外出、炙鱉甲補陰益腎入絡搜邪為君，干地黃清熱涼血益陰，白花蛇舌草、升麻清熱解毒消斑，赤芍、積雪草活血散血俱為臣，炒薏苡仁、佛手片健脾理氣化濕為佐，生甘草解毒并調和諸藥為佐使。諸藥合用，共奏清熱解毒，活血化瘀，益腎養陰之功，達到標本兼治的目的。其中，青蒿中青蒿素及雙氫青蒿素具有明顯的免疫抑制作用，能抑制BXSB狼瘡樣小鼠血清ds-DNA抗體的生成，對BXSM小鼠LN有明顯的改善作用［11-13］。實驗研究表明狼瘡定能夠減少細胞凋亡，減輕自身免疫應答。

免疫檢測中，一抗作用是特異結合底物，二抗作用是可以和一抗結合，并帶有可以被檢測出的標記，作用是檢測一抗。當一抗結合到底物上，就可以通過二抗檢測出來。Western blot結果圖中雜帶很多可能是一抗的濃度太高對雜帶有影響，也可能是封閉不好，有非特異結合。另外上樣量也對實驗結果有一定的影響，所以筆者比較了50 μg和100 μg上樣量，用一抗actin孵育，結果顯示，100 μg上樣量結果更清晰明亮，所以筆者選擇了100 μg的上樣量，避免對實驗結果影響。

本研究正常組為正常小鼠，模型組為狼瘡患病小鼠，中藥組為狼瘡定用藥患病小鼠。若中藥組結果趨于正常組，與模型組有一定的區別，說明狼瘡定影響此通路，具有治療作用；反之，則說明狼瘡定對該通路無明顯影響，無明顯治療作用。TGF-β2和JNK的電泳圖顯示中藥組條帶比較淺，明顯區別于模型組，趨向于正常組，說明狼瘡定影響TGF-β-MAPK信號通路中的蛋白TGF-β2和JNK的分泌，使其含量趨于正常值。本實驗用Western blot法來研究狼瘡定對在TGF-β-MAPK信號通路上的各個蛋白，主要為TGF-β2、JNK、Erk表達情況的影響，實驗結果顯示狼瘡定對某些關鍵蛋白有顯著影響，如：TGF-β2和JNK。在哺乳動物中，TGF-β激活的MAPK級聯轉導途徑有3條，其中包括了JNK/SAPK通路和ERK信號通路。綜上所述，狼瘡定影響JNK/SAPK信號通路上蛋白表達，即狼瘡定通過影響TGF-β2表達，減少細胞大量凋亡。另外，通過減少JNK表達，影響JNK/SAPK信號通路的傳導來控制炎癥因子的產生，也正因為如此，SLE患者病情得到控制。因此，狼瘡定是通過影響TGF-β-MAPK信號通路，對SLE有一定的治療作用。本實驗用狼瘡定對MRL/lpr狼瘡小鼠進行藥物干預［14-15］，檢測TGF-β-MAPK信號通路蛋白的表達情況，探討狼瘡定對SLE小鼠的內在治療機制，從而為狼瘡定治療SLE提供了理論依據。

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Discussion on the Therapeutic Effect of Langchuangding Decoction on SLE Based on TGF-beta-MAPK Signaling Pathway

XU Chenting，LI Haichang，XIE Zhijun，et al.College of Basic Medicine，Zhejiang University of Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China.

R593.24+1

A

1004-745X（2016）05-0769-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.006

國家自然科學基金課題（81173249）；2015年度中醫藥行業科研專項（201507001-4）
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（電子郵箱：wengcp@163.com）

2015-12-11）