通降和胃方對胃食管反流性咳嗽豚鼠呼吸道組織學形態的影響*

劉春芳　曹會杰　程艷梅　王宏偉　張秀蓮　朱生樑△（.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 00437；.上海中醫藥大學附屬普陀區中心醫院，上海 0000）

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通降和胃方對胃食管反流性咳嗽豚鼠呼吸道組織學形態的影響*

劉春芳1曹會杰2程艷梅1王宏偉1張秀蓮1朱生樑1△
（1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437；2.上海中醫藥大學附屬普陀區中心醫院，上海 200002）

目的 觀察通降和胃方對胃食管反流性咳嗽豚鼠模型呼吸道組織學形態的影響。方法 健康雄性豚鼠40只，隨機分為中藥組、西藥組、模型組和正常組。除正常組外，其余各組采用食管下端酸灌注法制作胃食管反流性咳嗽模型，并分別予相應藥物混懸液及等量生理鹽水處理，光鏡下觀察氣管、肺病理組織學改變，透射電子顯微鏡下觀察肺組織超微結構。結果 模型組氣管、肺組織炎癥積分較正常組明顯升高（P＜0.05），中藥組、西藥組與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；中藥組氣管、肺組織炎癥積分低于西藥組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 通降和胃方能夠有效抑制反流，降低氣道神經源性炎癥的發生，改善呼吸道炎癥反應，達到治療胃食管反流性咳嗽的目的。

胃食管反流性咳嗽食管氣道神經源性炎癥疏肝和胃方從胃治咳

【Abstract】Objective：To observe the effect of Tongjiang Hewei Decoction on histopathological characteristics of the airway in guinea pigs with gastroesophageal reflux induced cough.Methods：Forty healthy male guinea pigs were randomly divided into 4 groups：Tongjiang Hewei group，the control group，the model group and the normal group.GERC models were induced repeatedly by hydrochloric acid instillation with the corresponding intervention measures to each group，except the normal group.After two weeks，all animals were executed and the histological changes of the trachea and lung tissue were observed.Evans Blue-invasive method was used to determine pulmonary capillary permeability in guinea pigs.Ultrastructural changes of lung tissues were observed under transmission electron microscope.Results：The inflammation of the trachea and lung tissue in the model group was much more obviously than that of the normal group（P＜0.05）.There was a significant difference in improving the guinea pig trachea and lung tissue pathologic scores in Tongjiang Hewei group and the control group，compared with the model group.Comparing Tongjiang Hewei Decoction with omeprazole，there was a significant difference in improving the two scores（P＜0.05）.Conclusions：Tongjiang Hewei Decoction can effectively inhibit acid reflux，reduce airway neurogenic inflammation，thereby reduce the inflammatory exudate and cure cough.

【Key words】Gastroeso phageal reflux induced cough；Airway neurogenic inflammation；Tongjiang Hewei Decoction；Cure cough from stomach

胃食管反流性咳嗽（GERC）是以慢性咳嗽為主要臨床表現的胃食管反流病，屬于胃食反流病的一種特殊類型，目前臨床上認為慢性咳嗽、慢性喉炎及哮喘與胃食管反流病顯著相關［1］，慢性咳嗽反復發作，往往造成患者生活質量的顯著下降。通降和胃方是上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院胃食管反流病?？曝撠熑酥焐鷺沤淌谝罁秲冉洝贰按私跃塾谖?，關于肺”的論述，基于對本病病因病機的認識，以“從胃治咳”的思路出發創制而成，臨床應用多年，效果顯著［2］。本文觀察了通降和胃方對GERC豚鼠模型呼吸道組織學形態的影響，以探討其治療GERC的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物普通級雄性豚鼠共40只，2～3月齡，體質量（300±50）g，由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心提供，上海市斯萊實驗動物有限責任公司生產 ［動物合格證號SCXK（滬）2012-0002］。給予室內溫度（20±2）℃，濕度（50±10）%，標準飼料飼養。

1.2實驗藥物通降和胃方：旋覆梗12 g，代赭石15 g，柴胡9 g，枳殼12 g，焦山梔9 g，川楝子9 g，黃連3 g，吳茱萸3 g，太子參12 g，生姜4.5 g，甘草6 g。以上藥物均采用中藥顆粒劑（由本院藥劑科提供），使用前配成溶液。奧美拉唑膠囊20 mg（常州四藥制藥廠，生產批號20140602），使用前配成溶液。

1.3試劑與儀器胃蛋白酶（批號P7000）購自Sigma公司；戊巴比妥鈉 （批號18569802）、濃鹽酸 （批號80070590）購自國藥集團化學試劑有限公司；0.5%伊紅、蘇木素、二甲苯、梯度酒精由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院病理室提供；2%戊二醛、磷酸緩沖液、鋨酸固定液等由上海中醫藥大學科技實驗中心提供。組織脫水機（日本櫻花精機株式會社VIPE300F）、櫻花包埋機（日本櫻花精機株式會社4715）、切片機（德國MEDIS公司13/30RR型）、切片漂烘溫控儀 （安徽電子科學研究所QP-B）、OLYMPUS顯微鏡（BX51）、電子掃描鏡（荷蘭PHILIPS TECHAI-12）

1.4分組及造模將40只豚鼠采用隨機數字表法隨機分為正常組、模型組、中藥組和西藥組，每組10只。除正常組外，其余3組均參照文獻［3］報道，采用鹽酸灌注法制備GERC動物模型。

1.5給藥方法根據豚鼠和人體間等效劑量換算的折算倍數是5.5倍［4］，中藥組給予顆粒劑生藥量為0.866 g/100 g，西藥組給予奧美拉唑0.367 mg/100 g，每日灌胃兩次，每次1 mL/100 g體質量，連續灌胃14 d。正常組不給藥，模型組灌胃等量生理鹽水。

1.6標本采集與檢測

1.6.1氣管、肺組織光鏡病理切片的制備2周后，腹腔過量注射2%戊巴比妥鈉處死豚鼠，取出氣管近喉部0.5 cm組織、肺組織1 cm×1 cm，置10%甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，樹脂封片。光鏡下觀察氣管、肺組織的形態學表現。氣管炎癥病理積分參照何權灜等［5］制定的小氣道八項病理指標判分標準，依據血管和氣管周圍嗜酸性細胞、上皮損傷、水腫嚴重程度進行肺組織炎癥積分評定［6］。

1.6.2肺組織電鏡病理切片的制備在低溫下迅速取下肺組織0.5 cm×0.5 cm，保持低溫環境下2%戊二醛固定液固定2 h以上，0.1 mol/L磷酸緩沖液充分洗滌；1%鋨酸后固定2 h，磷酸緩沖液清洗0.5 h；梯度酒精脫水；環氧樹脂滲透包埋；超薄切片制作（80 nm）；透射電子顯微鏡下觀察肺組織微血管內皮細胞形態、基底膜形態、毛細血管壁電子密度等。

1.7統計學處理應用SPSS19.0統計軟件統計。符合正態分布以（±s）表示。符合正態分布采用方差分析進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1一般情況造模后7 d觀察，除正常組外，余3組實驗動物均有不同程度的飲食減少，體質量減輕。造模第11天后觀察，除正常組外，余3組實驗動物均有不同程度的噴嚏、嗆咳表現，少數動物有呼吸急促、喘息，甚則腹肌收縮、難于行走，甚至死亡。最終因麻醉意外死亡2只，因肺部嚴重感染死亡2只。剩余36只實驗豚鼠，各組體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2各組豚鼠氣管組織病理改變見圖1，表1。HE染色顯示正常組豚鼠氣管組織結構基本正常；模型組氣管組織可見纖毛柱狀上皮明顯增生，黏膜及黏膜下層充血、腫脹，炎性細胞浸潤；中藥組及西藥組氣管組織可見不同程度的上皮增生，炎性細胞浸潤較模型組減少。與正常組比較，模型組氣管炎癥積分明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥組、西藥組與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；中藥組氣管炎癥積分低于西藥組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　各組豚鼠氣管組織病理學改變（HE染色，200倍）

表1　各組豚鼠氣管、肺組織病理積分比較（分，±s）

表1　各組豚鼠氣管、肺組織病理積分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

組　別　n　氣管炎癥積分　肺組織炎癥積正常組　10　3.90±2.02*　5.00±0.52*模型組　8　6.50±0.36　13.38±1.41中藥組　9　3.44±1.81*△　7.77±2.86*△西藥組　9　4.96±0.71*　11.63±2.13

2.3各組豚鼠肺組織病理改變見圖2，表1。HE染色顯示正常組豚鼠肺組織結構無明顯損傷，肺泡結構完整，有少量炎性細胞浸潤。模型組肺組織肺泡結構破壞嚴重，見廣泛的彌漫性的充血水腫，肺泡萎縮、間隔增寬，肺實變，肺內見大量中性粒細胞浸潤。中藥組及西藥組肺泡結構見不同程度的破壞，肺間質水腫及炎性細胞浸潤，但較模型組輕微。模型組肺組織炎癥積分明顯高于正常組 （P＜0.05），西藥組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），中藥組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中藥組肺組織炎癥積分明顯低于西藥組（P＜0.05）。

圖2　各組豚鼠肺組織病理學改變（HE染色，200倍）

2.4各組豚鼠肺組織電鏡下觀察見圖3。正常組豚鼠微血管內皮細胞及基底膜形態結構基本正常：層次清晰分明，內皮細胞無水腫充血，基底膜連續完整，未見明顯損壞。模型組內皮細胞損傷廣泛，可見毛細血管內皮充血、腫脹或增厚，細胞內吞飲小體增多；基底膜缺損、疏松、不規則；毛細血管-肺泡膜受損，內皮細胞及基膜之間水腫，個別標本肺泡腔內可見淋巴細胞。西藥組可見微血管內皮細胞腫脹、充血，毛細血管壁電子密度降低；基底膜欠清晰、不完整，甚則可見基底膜纖維化；內皮細胞內吞飲小體增多；毛細血管-肺泡膜受損，內皮細胞及基膜之間水腫。中藥組微血管內皮細胞略腫脹，但基底膜連續完整，層次尚清晰，毛細血管-肺泡膜未見明顯受損，毛細血管壁電子密度未見明顯降低，

圖3　各組豚鼠肺組織超微結構變化（TEM，11500倍）

3　討　論

GERC當屬中醫學“內傷咳嗽”范疇，中醫學為咳嗽的論述奠定了深厚的理論基礎，如《內經》云“五臟六腑皆令人咳，非獨肺也”“此皆聚于胃，關于肺”等均為肺胃相關理論提供了堅實的依據。肺與胃位置相近，經絡相連，肺屬金，胃屬土，二者可謂為子母之臟腑，生理上相互依賴，相輔相成。任何致病因素引起胃失和降都可影響肺之肅降，導致肺氣上逆而發為咳。由胃而咳，勢必先影響中焦之氣機，而中焦氣機又與肝密切相關，因此GERC主要涉及肺、胃、肝。GERC病理基礎在于氣機升降失調，基本病機為肝失疏泄，胃失和降，肺失肅降。鑒于以上認識，朱生樑教授以“從胃治咳”為治療思路，以疏肝泄熱，和胃降逆為具體治則，并結合多年臨證用藥經驗，總結出了治療GERC驗方——通降和胃方。方中諸藥合用，降胃為主，輔以疏肝健脾。胃氣得降，自不能上犯華蓋而壅塞肺絡；肝熱得清，便不得上灼肺金而肺失清肅。胃氣通降，肺氣清肅，胃和而咳止。前期研究顯示該方可明顯提高食管下括約肌環形肌張力［7］，減少胃內容物反流，同時還可調節胃電節律，促進胃排空［8-9］，從而發揮其多層次、多靶點的治療作用。

食管-氣道神經源性炎癥是GERC發病的主要機制之一［10］。氣管與食管共同起源于胚胎時期的前腸，兩者具有共同的神經通路，都由迷走神經支配。調節咳嗽的重要通路是分布于氣道和肺內的迷走感覺神經，但調節咳嗽反射的另一組重要的迷走傳入通路是分布于食管的感覺神經［11］。食管內感覺神經受刺激可以直接導致咳嗽或經由中樞神經導致咳嗽興奮性升高［12］。當反流入食管的胃內容物（胃酸、胃蛋白酶等）刺激食管下段黏膜酸敏感辣椒素受體，沿迷走傳入神經傳至延髓迷走孤束核和迷走運動背核，引起中樞神經遞質釋放，沿迷走傳出神經傳出至氣道，引起氣道感覺神經肽SP、NKA、NKB和CGRP等表達和釋放增加，在氣道內發揮其生物活性，導致支氣管收縮，氣道血管通透性增高，血漿滲出增加，從而產生氣道神經源性炎癥，引發GERC［13-14］。

食管下段酸灌注法是目前國內外公認的制備GERC動物模型的方法［15］，該模型證明了食管-氣道神經源性炎癥的存在。本次實驗通過復制GERC動物模型，觀察到在模擬胃酸、胃蛋白酶的作用下，反流液對豚鼠氣道的損傷主要表現在纖毛柱狀上皮的增生及炎性細胞的浸潤，肺組織的損傷主要表現在毛細血管-肺泡膜損傷，肺泡結構破壞及炎性細胞浸潤。同時通降和胃方組肺組織間質水腫及炎性細胞浸潤較模型組明顯輕微，且毛細血管-肺泡膜未見明顯受損。這提示通降和胃方能夠減少反流物對食管下端的反復刺激，降低氣道神經源性炎癥的發生，從而發揮治療GERC的作用。

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（收謝日期2015-11-09）

Effect of Tongjiang Hewei Decoction on Histopathological Characteristics of the Airway in Guinea Pigs with Gastroesophageal Reflux Induced Cough

LIU Chunfang，CAO Huijie，CHENG Yanmei，et al.Yueyang Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0788-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.011

國家中醫藥管理局“十二五”重點?？祈椖浚?9JIX1L206B118）；上海市科委科技支撐項目（13401902800）
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