黃芪甲苷對Wnt/β-catenin信號通路活化的人滑膜細胞和人軟骨細胞共培養體系MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的調控作用*

王德剛　許傳勇　姜玉祥　闞衛兵△　肖志鋒姚　麗劉　婉謝殿洪湯　豪　張玉婷（.上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海 0006；.山東省威海市威海衛人民醫院，山東 威海 6400）

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黃芪甲苷對Wnt/β-catenin信號通路活化的人滑膜細胞和人軟骨細胞共培養體系MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的調控作用*

王德剛1許傳勇2姜玉祥1闞衛兵1△肖志鋒1姚麗1劉婉1謝殿洪1湯豪1張玉婷1
（1.上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海 200062；2.山東省威海市威海衛人民醫院，山東 威海 264200）

目的 觀察黃芪甲苷對Wnt/β-catenin信號通路活化的人滑膜細胞和人軟骨細胞共培養體系基質金屬蛋白酶-7（MMP-7）、Ⅱ型膠原羧基端肽（CTX-Ⅱ）、軟骨寡聚基質蛋白（COMP）的調控作用，初步闡釋黃芪甲苷治療骨關節炎的分子作用機制。方法 通過β-catenin慢病毒載體轉染正常人滑膜細胞，激活其Wnt/βcatenin信號通路。Wnt/β-catenin信號通路活化的人滑膜細胞與正常人軟骨細胞置于Transwell小室中共培養。倒置顯微鏡觀察Wnt/β-catenin信號通路活化的人滑膜細胞對人軟骨細胞形態學變化的影響。黃芪甲苷混懸液干預共培養體系，采用Western bolt方法檢測黃芪甲苷對滑膜細胞β-catenin蛋白表達的影響；采用ELISA方法檢測黃芪甲苷對滑膜細胞、軟骨細胞培養上清液MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表達的影響。結果 βcatenin慢病毒載體轉染正常人滑膜細胞后成功激活Wnt信號通路并與軟骨細胞共培養。隨培養時間的延長，軟骨細胞生長逐漸受到抑制，軟骨細胞胞體邊緣與板壁接觸處發白，折光度增加，細胞貼壁強度降低。黃芪甲苷干預后，Western blot檢測發現滑膜細胞中β-catenin蛋白的表達明顯下調 （P＜0.01）；ELISA法檢測發現滑膜與軟骨細胞上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表達與正常對照相比明顯升高（P＜0.01）。結論 滑膜細胞Wnt/β-catenin信號通路的激活可以使軟骨細胞生長受到抑制。黃芪甲苷可以降低滑膜細胞β-catenin表達，且與干預時間長短相關。黃芪甲苷可以抑制滑膜細胞Wnt/β-catenin信號通路，下調MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表達。黃芪甲苷可能通過抑制OA滑膜Wnt/β-catenin信號通路，改善滑膜炎癥、調控滑膜-軟骨共同體系微環境、達到抑制軟骨降解，促進軟骨細胞功能恢復而治療骨關節炎。

黃芪甲苷Wnt信號通路細胞共培養MMP-7CTX-ⅡCOMP

【Abstract】Objective：To observe the effect of AstragalosideⅣon MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP of co-culture system of chondrocytes and human synovial cells mediated by Wnt/β-catenin signal pathway，and to clarify the molecular mechanism of Astragaloside IV in the treatment of OA.Methods：β-catenin over expressing lentivirus vector was constructed to transfect synovial cells of normal people.Synovial cells and chondrocytes were cultured in transwell chamber to simulate the joint system environment between synovium and cartilage.The influence of Wnt/β-catenin signal pathway in human synovial cells on human chondrocytes morphological changes was observed with inverted microscope.Astragaloside IV intervened co-cuture system.Western bolt Method was used to test the influence of Astragaloside IV on β-catenin protein expression of synovial cells.ELISA Method was used to test the influence of Astragaloside IV on MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP in the culture supernatant.Results：After transfected by lentivirus vector，fluorescent microscopy showed that most of the synovial cells arose fluorescence. Western bolt test showed that the expression of β-catenin in the cytoplasm and nucleus of synovial cells increasedsignificantly after transfected（P＜0.01）.ELISA results showed that AstragalosideⅣsignificantly regulated the level of MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP down in co-culture cells supernatant（P＜0.01）.Conclusion：The growth of chondrocytes can be affected by synovial cells which is mediated by Wnt/β-catenin signal pathway.β-catenin over expressing lentivirus can activate Wnt/β-catenin signaling pathway.The level of MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP in co-cuture system increase significantly after Wnt/β-catenin signal pathway has been activatied.Astragaloside IV can inhibit Wnt/β-catenin signaling pathway，regulate the expression level of MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP down，relieve harm of abnormal synovial cells contributing to chondrocytes and the degradation of cartilage matrix，and promote the restoration of OA.

【Key words】AstragalosideⅣ；Wnt signal pathway；Co-culture，MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP

膝關節骨性關節炎（KOA）為老年人常見、多發且比較難治的一種慢性進行性骨關節病，其特征是關節軟骨進行性降解，出現關節周邊骨贅形成、軟骨下骨板增厚、關節滑膜的病變。KOA不僅會引起膝關節疼痛，甚至可引起關節畸形，嚴重影響患者的生活質量。課題組前期研究發現，Wnt/β-catenin信號通路在OA動物模型滑膜組織和滑膜細胞中是激活的，其下游基因基質金屬蛋白酶-7（MMP7）的表達是升高的，補腎活血方對其具有調控作用［1-4］，對補腎活血方中中藥單體篩選發現，黃芪甲苷對滑膜細胞Wnt/β-catenin信號通路具有顯著調控作用。2015年1至6月，本研究觀察了黃芪甲苷對Wnt/β-catenin信號通路活化的人滑膜細胞和人軟骨細胞共培養體系相關因子的調控作用，現報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞與分組1）實驗細胞：（1）正常人滑膜細胞（HS）及人軟骨細胞（HC-a）購于北京裕恒豐科技有限公司，廠家：美國ScienCell公司。規格：＞5×105個細胞/mL，產品編號：（HS）-NO.4700，（HC-a）-NO.4650。（2）β-catenin慢病毒，β-catenin過表達慢病毒濃縮液由上海鴻立生物技術有限公司重組、測序、包裝、收獲、濃縮、純化后供給，病毒滴度為1×108TU/mL。2）細胞培養：（1）β-catenin慢病毒轉染人滑膜細胞。常規培養滑膜細胞至細胞生長密度達70%時，棄去舊的培養液，按預實驗所得10 moi（multiplicity of infection）加入稀釋的病毒液，24 h后棄去病毒液，加入完全培養基繼續培養48～72 h，熒光顯微鏡觀察轉染率，Western blot檢測滑膜細胞中β-catenin的表達水平，為下一步實驗做好準備。（2）Wnt/β-catenin信號通路活化的人滑膜細胞與人軟骨細胞共培養。人滑膜細胞與軟骨細胞分別接種于多聚賴氨酸處理的培養瓶，加入完全培養基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中常規培養；人滑膜細胞與軟骨細胞Transwell小室共培養時，按常規細胞共培養技術方法將人滑膜細胞與軟骨細胞分別接種于Transwell小室的上室和下室，再于細胞培養箱中常規培養。（3）黃芪甲苷混懸液干預共培養體系。黃芪甲苷混懸液制備：根據人和動物間體表面積折算的等效劑量比值計算稱取藥粉，溶解于生理鹽水內，制成藥液質量濃度為0.009 g/mL的混懸液備用。往滑膜細胞所在的上室內分別加入濃度5%、10%、15%的黃芪甲苷混懸液，分別為低、中、高劑量組［5］，孵育12 h（黃芪甲苷孵育12 h組）、24 h（黃芪甲苷孵育24 h組）、48 h（黃芪甲苷孵育48 h組）。黃芪甲苷處理滑膜細胞的同時，將軟骨細胞傳代至另外一個新的6孔板內培養。待滑膜細胞用黃芪甲苷處理的時間點到了以后，將滑膜細胞所在的上室里的培液棄盡，把上室轉移至已經接種有軟骨細胞的6孔板內進行共培養，6 h后分別收集上室有和下室的培液進行ELISA檢測。

1.2儀器與試劑熒光倒置顯微鏡 （日本OLMYPUS公司）；細胞CO2培養箱（英國RSBiotech公司）；SC2-4A1ESCO生物安全柜（新加坡ESCO公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）；電泳儀（BIO-RAD POWER/ PAC 200）；低溫離心機 （Centrifuge5810R）（德國Eppendorf公司）；BP-Ⅱ天平（上海光正公司）；恒溫鼓風干燥箱（上海精宏公司）；-80℃低溫冰箱（海爾公司）；搖床（TS-8）（上海精密儀器制造公司）；酶標儀（Multisken MK3 Thermo）；超純水系統（德國Sartorious Stedim Biotech公司）；磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司，95-I）；電熱恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司，UK-S22）。黃芪甲苷標準品，編號：110781，規格20 mg，由上海東方藥品科技實業有限公司生產和質量控制?；ぜ毎?、軟骨細胞培養基（美國Scien Cell公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（上海凌峰化學試劑公司）；胞漿蛋白及核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE電泳液、Western轉膜液 （碧云天生物技術公司）；蛋白電泳分子量標準（Pierce）；β-catenin抗體（CST）；山羊抗鼠HRP二抗 （Abcam）；HRP-ECL發光檢測試劑盒（Pierce）；MMP-7 ELISA試劑盒、COMP ELISA試劑盒、CTX-ⅡELISA試劑盒、（Cloud-clone）。

1.3觀察指標1）Western blot檢測慢病毒轉染后人滑膜細胞胞核和胞漿蛋白β-catenin的表達。共培養系統分為5組觀察，正?；ぜ毎麨檎φ战M，Wnt信號通路激活的滑膜細胞為通路激活組，12 h低、中、高劑量黃芪甲苷組，24 h低、中、高劑量黃芪甲苷組，48 h低、中、高劑量黃芪甲苷組。正常對照組和通路激活組給予0.9%氯化鈉溶液干預，12、24、48 h的低、中、高劑量黃芪甲苷組分別給予5%、10%、15%3種濃度的黃芪甲苷混懸液干預12、24、48 h［5］，干預完成后提取各組滑膜細胞胞核蛋白，Western blot檢測滑膜細胞β-catenin蛋白的表達情況。（1）胞漿蛋白與胞核蛋白的抽提：取出細胞，棄去培養液，預冷的PBS輕輕洗滌2～3遍，小心刮下細胞，收集細胞懸液，離心，吸棄上清，向每20 μL細胞沉淀加入200 μL預冷的細胞裂解液，劇烈振蕩15 s，冰上裂解10～15 min，低溫高速離心后所獲上清即為胞漿蛋白。向離心沉淀物 （含胞核蛋白）加入胞核洗滌液500 μL，洗滌1～2次；加入胞核裂解液150 μL震蕩混勻，冰上裂解10 min，低溫高速離心獲得上清即為胞核蛋白。（2）蛋白定量：根據碧云天BCA蛋白定量試劑盒（增強型）說明對獲得的蛋白樣品進行蛋白定量。（3）電泳：根據碧云天SDSPAGE電泳的試劑盒說明進行配膠，上樣，電泳，以溴酚藍剛出膠底部時結束電泳。（4）轉膜：使用碧云天蛋白轉膜液45 V半干轉膜1.5 h。（5）封閉：膜放置于5%的脫脂奶粉或5%BSA封閉液的平皿中，室溫下搖床封閉1～2 h。（6）一抗孵育：5%BSA封閉液稀釋一抗至適當濃度（β-catenin 1∶500，Tublin 1∶2000），采用膜倒貼法進行抗體的孵育，搖床上室溫孵育1～2 h或4℃過夜。（7）洗膜：用TBST搖床上洗滌 3～4次，每次10 min。（8）二抗孵育：加入適量HRP標記的二抗，搖床上室溫孵育0.5～1 h，洗膜同前，每次10 min。（9）顯影：暗室內，根據ECL化學發光試劑盒（Pierce）操作方法進行膜的化學發光檢測，觀察到熒光后進行X光片壓片、顯影、定影。2）ELISA法檢測共培養人滑膜細胞與軟骨細胞上清液MMP-7、Ⅱ型膠原羧基端肽（CTX-Ⅱ）、軟骨寡聚基質蛋白（COMP）的表達。正常對照組、通路激活組給予生理鹽水，黃芪甲苷組給予10%黃芪甲苷混懸液，干預通路激活的人滑膜細胞48 h后與正常人軟骨細胞共培養2 h，分別收集共培養的人滑膜細胞與軟骨細胞培養上清液。（1）標準品的制備：將標準品倍比稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 ng/mL 7個濃度。（2）加樣：酶標板上分別設定所需的待測樣品蛋白孔，7個標準蛋白孔及1～2個空白對照孔，各孔加入100 μL對應液體，每個樣品設3個復孔，37℃溫育2 h，吸棄殘液。（3）每孔加入檢測溶液A工作液（一抗）100 μL，蓋好覆膜，37℃溫育1 h，每孔加入300 μL洗滌液洗滌，重復4～5次。（4）每孔加入100 μL的B檢測（二抗）工作液，覆膜封好，37℃溫箱內溫育30 min，洗板同前。（5）顯色：每個板孔內加顯色底物90 μL，避光條件下37℃孵育顯色，孵育時間一般為15～30 min，標準品觀察到梯度顏色時加入終止液，于酶標儀450 nm波長檢測各孔的吸光度（OD值）。（6）檢測計算：建立坐標系，縱坐標為標準品的濃度，橫坐標為OD值。繪出標準曲線，根據樣品OD值計算樣品蛋白含量。

1.4統計學處理應用PASW Statistics 20.0軟件包對實驗所得數據進行整理和統計分析。結果以（±s）的形式表示，組間差別采用重復測量資料的方差分析，滿足球對稱時，無需校正，不滿足球對稱時采用ε校正系數校正后的結果，干預因素間無交互作用時分析其主效應，有交互作用時分析其單獨效應。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1Wnt/β-catenin信號通路激活的人滑膜細胞對軟骨細胞形態學影響見圖1。Wnt/β-catenin信號通路激活的人滑膜細胞與正常人軟骨細胞共培養后，光鏡下觀察軟骨細胞形態改變不明顯，但是隨培養時間的延長，軟骨細胞生長逐漸受到抑制，軟骨細胞胞體邊緣與板壁接觸處發白，折光度增加，細胞貼壁強度降低，可能與細胞基質降解有關。

圖1　Wnt信號通路激活的人滑膜細胞對軟骨細胞形態的影響（200倍）

2.2各濃度黃芪甲苷混懸液不同時間干預后對Wnt/ β-catenin信號通路激活的人滑膜細胞胞核和胞漿蛋白β-catenin的影響見表1和圖2。正常人滑膜細胞胞核中未能明顯觀察到β-catenin蛋白表達，而通路激活組滑膜細胞胞核內β-catenin蛋白表達與正常人滑膜細胞相比顯著增強（P＜0.01）。黃芪甲苷干預后滑膜細胞β-catenin表達與通路激活組比較均顯著降低，且β-catenin表達的降低程度與干預時間有一定關系，在48 h時表達最低，而中、高劑量間β-catenin表達無明顯差異（P＞0.05）。

2.3黃芪甲苷對共培養人滑膜細胞與軟骨細胞上清液中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ表達的影響見表2～表4。通路激活組滑膜細胞、軟骨細胞培養上清液中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ蛋白濃度與正常對照組比較均明顯上調（P＜0.01）；與通路激活組相比均明顯下調（P＜0.01）。

表1　黃芪甲苷對共培養滑膜細胞核內β-catenin表達的影響（±s）

表1　黃芪甲苷對共培養滑膜細胞核內β-catenin表達的影響（±s）

與正常對照組比較，△△P＜0.01；與通路激活組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與48 h低劑量組比較，▲▲P＜0.01。下同。

組　別　n　β-catenin灰度值　倍數正常對照組　3　206.57±14.62　0.11±0.0076通路激活組　3　1917.46±80.28△△　1.00±0.0419 12 h低劑量組　3　2125.65±138.74　1.11±0.0724 12 h中劑量組　3　1815.06±101.03　0.95±0.0527 12 h高劑量組　3　1696.72±59.74　0.88±0.0312 24 h低劑量組　3　1791.19±177.52　0.93±0.0926 24 h中劑量組　3　1409.09±47.33**　0.73±0.0247 24 h高劑量組　3　1335.11±77.97**　0.70±0.0407 48 h低劑量組　3　2072.03±252.51*　1.08±0.1316 48 h中劑量組　3　821.83±75.16*▲▲　0.43±0.0392 48 h高劑量組　3　893.77±61.35*▲▲　0.46±0.0320

圖2　黃芪甲苷對共培養人滑膜細胞核內β-catenin蛋白的表達的影響

表2　共培養體系中滑膜細胞與軟骨細胞培養上清液中MMP-7的表達（±s）

表2　共培養體系中滑膜細胞與軟骨細胞培養上清液中MMP-7的表達（±s）

組正常對別　n　滑膜細胞上清液　軟骨細胞上照組　3　0.2582±0.0146　0.1326±0.0通路激活組　3　0.4582±0.0410△△　0.3360±0.0黃芪甲苷組　3　0.2920±0.0431**　0.1626±0.0清液224 163△△239**

表3　共培養體系中滑膜細胞與軟骨細胞培養上清液中COMP的水平（±s）

表3　共培養體系中滑膜細胞與軟骨細胞培養上清液中COMP的水平（±s）

組　別　n　滑膜細胞上清液　軟骨細胞上清液正常對照組　3　36.7553±2.0480　25.0720±3.0126通路激活組　3　71.8471±5.7680△　58.6446±0.9168△黃芪甲苷組　3　42.6342±2.7346**　33.5444±2.3082**

表4　共培養體系中滑膜細胞與軟骨細胞培養上清液中CTX-Ⅱ的水平（±s）

表4　共培養體系中滑膜細胞與軟骨細胞培養上清液中CTX-Ⅱ的水平（±s）

組　別　n　滑膜細胞上清液　軟骨細胞上清液正常對照組　3　2472.49±125.09　1342.20±131.33通路激活組　3　4544.73±352.31△　4053.71±69.996△黃芪甲苷組　3　2060.05±200.56**　1865.38±42.565**

3　討　論

KOA是一種退化性關節疾病，滑膜炎癥在KOA的發展機制中，是必不可少的重要因素之一，而且滑膜炎嚴重程度與KOA進展之間存在相關性［6］。Wnt/βcatenin信號通路激活與骨關節滑膜炎形成密切相關［7］。國外研究顯示通過調控Wnt/β-catenin信號通路可以誘導成骨細胞分化［8］，國內研究證明通過調控Wnt/βcatenin信號通路可以干擾OA軟骨細胞代謝［9］，起到保護軟骨細胞作用［10-12］?；ぱ装Y時可分泌MMPs、ADAMTS、IL-1、NO、TNF等酶和炎癥因子直接造成軟骨損傷［13］，無論是骨關節炎的早期還是晚期均存在明顯的滑膜炎癥，且與骨關節疼痛密切相關而反映關節退化程度［14］。軟骨基質的降解嚴重影響關節的功能，關節組織和滑液中高水平的MMPs是造成軟骨基質降解的重要因素［15］，而通過對MMPs的特異性強效抑制將會成為治療骨關節炎的重要靶點［16］。COMP和CTX-Ⅱ是軟骨基質分解的產物，一些研究發現骨關節炎患者滑液中CTX-Ⅱ水平在軟骨退變的早期階段顯著升高［17］，而即使在放射影像學正常的早期KOA中，血清COMP水平升高且與膝關節疼痛等臨床癥狀相關［18］，這可能是骨關節炎的滑膜炎造成的［19］。

本研究發現，10%的中劑量黃芪甲苷干預48 h對人滑膜細胞作用最為顯著，與既往研究實驗結果一致［5］。結果表明黃芪甲苷能較好的降低通路激活的人滑膜細胞核內β-catenin蛋白的表達水平，且作用與藥物濃度與干預時間有關，其能在一定程度上抑制Wnt/βcatenin信號通路的激活，這可能是它抑制滑膜炎癥，調控關節微環境，抑制軟骨破壞而治療骨關節炎的機制。黃芪甲苷能夠明顯降低滑膜細胞胞核中β-catenin水平且降低共培養體系異?；ぜ毎?軟骨細胞體系的MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ含量，這可能是黃芪甲苷通過抑制滑膜細胞Wnt/β-catenin信號通路，減輕滑膜炎癥，改善滑膜-軟骨微環境，抑制軟骨降解的分子機制。

綜上所述，本實驗利用細胞共培養方法研究滑膜在骨關節炎發病中的作用，發現Wnt/β-catenin信號通路激活的滑膜細胞能直接造成軟骨基質的分解代謝，并可能引起軟骨細胞代謝的異常，黃芪甲苷能夠較好的抑制滑膜細胞Wnt/β-catenin信號通路，降低滑膜-軟骨微環境中MMP-7、COMP、CTX-Ⅱ等表達，這可能是黃芪甲苷抑制滑膜炎癥、阻止軟骨基質降解，促進軟骨細胞功能恢復而治療膝骨關節炎的重要機制之一。但滑膜炎促進骨關節炎發生、發展更多的內在機制尚需深入研究。

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Effect of AstragalosideⅣon MMP-7，CTX-Ⅱ，COMP of Co-culture System of Chondrocytes and Human Synovial Cells Mediated by Wnt/β-catenin Signal Pathway

WANG Degang，XU Chuanyong，JIANG Yuxiang，et al.Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China.

R289.9

A

1004-745X（2016）05-0795-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.013

上海中醫藥大學預算內科研項目（2014YSN64）；上海市教委創新課題（14YZ058）
△

（電子郵箱：kanwb@126.com）

2015-12-29）