黃芪甲苷對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激的影響*

楊　龍　韓　冬（河北省滄州市中心醫院，河北 滄州 061001）

?

黃芪甲苷對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激的影響*

楊龍△韓冬
（河北省滄州市中心醫院，河北 滄州 061001）

目的 觀察黃芪甲苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠氧化應激損傷的影響并探討其可能的作用機制。方法 采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，隨機分為模型組、黃芪甲苷?。?0 mg/kg）、中（20 mg/ kg）、大劑量組（40 mg/kg）和銀杏葉提取物組（200 mg/kg），各20只，另取20只同齡大鼠作為假手術組；各治療組于再灌注30 min前腹腔注射給藥。再灌注24 h后，行神經功能評分，測定腦組織含水量和腦梗死體積；檢測腦組織中抗氧化酶［過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）］活性和丙二醛（MDA）含量，測定血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）含量，蘇木精-尹紅（HE）染色法觀察腦組織形態學變化；末端標記（TUNEL）法觀察神經細胞凋亡狀況并計算凋亡指數（AI），Western blotting法測定NF-κB蛋白表達。結果 與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組大鼠神經功能評分顯著降低，含水量和腦梗死體積顯著降低；腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，血清中CK、LDH含量顯著降低；黃芪甲苷各治療組大鼠腦組織病變和神經細胞凋亡狀況明顯好轉，均以大劑量組效果最為顯著，黃芪甲苷中、大劑量組AI顯著降低，腦組織中NF-κB蛋白表達顯著下調，差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論 黃芪甲苷具有抑制局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激損傷的作用，作用機制可能與黃芪甲苷能夠有效改善抗氧化酶活性、下調NF-κB蛋白表達、抑制神經細胞凋亡有關。

黃芪甲苷缺血再灌注氧化應激

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Astragalosides on oxidative stress in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：One hundred rat models with focal cerebral ischemic reperfusion made by suture method were randomly divided into five groups：the model control group，Astragalosides（10，20，40 mg/kg）treated groups and Ginkgo biloba extract（200 mg/kg）treated group，and another 20 same-aged rats were selected as the sham group.30 min before operation，the drugs were given by intraperitoneal injection.Twenty-four hours after reperfusion，the neurological deficits，ratio of infarct volume，water content of the brain were evaluated；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in brain tissue were determined；the content of CK，LDH in serum were determined；the histopathological changes and neurocyte apoptosis were observed，and the AI were determined；the expression of NF-κB protein was detected by Western blot and Semi-quantitative analysized.Results：Compared with the model control group，the neurological scores of Astragalosides（20，40 mg/kg）treated groups were significantly decreased，and the ratio of infarct volume and brain water content were significantly decreased；the activity of SOD，GSH-Px，CAT in brain tissue were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased，and the content of CK，LDH in serum were significantly decreased；the histopathological changes and neurocyte apoptosis of Astragalosides treated groups were significantly improved，and the AI of Astragalosides（20，40 mg/kg）treated groups were significantly decreased；the expression of NF-κB protein was significantly down-regulated；all of the difference above were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Astragalosides has inhibitive effects on the oxidative stress in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury，which is perhaps related to its pharmacological effects of enhancing the activity of antioxidant enzymes，regulatingthe expression of NF-κB protein and depressing neurocyte apoptosis.

【Key words】Astragalosides；Ischemic-reperfusion；Oxidative stress

缺血再灌注并發癥是影響急性腦?；颊呷芩ɑ蚪槿胧中g治療愈后的重要因素，其病理機制非常復雜，其中再灌注后隨著氧的大量涌入而引發的廣泛氧化應激損傷被認為是缺血再灌注損傷最重要的病理生理基礎之一［1］，這也為我們研發能夠緩解缺血再灌注損傷的新型藥物提供了新的思路。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分之一，具有抗炎、降血脂等多種藥理學活性［2-3］。近年來，李鐵成等［4］和馬小亮等［5］通過動物實驗研究發現，黃芪甲苷能夠通過改善抗氧化酶活性、提高氧自由基清除能力而表現出對肝組織缺血再灌注損傷大鼠和心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，但黃芪甲苷對腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激損傷是否具有抑制作用尚未見文獻報道。本研究將采用線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，研究黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注損傷后氧化應激的影響并探討其可能的作用機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑黃芪甲苷（成都錦泰和醫藥化學技術有限公司，批號：150308，純度≥98%）；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒，HE、TUNEL試劑盒購于北京博奧森生物工程有限公司；核因子κB（NF-κB）單克隆抗體購自碧云天生物技術有限公司。

1.2動物清潔級雄性SD大鼠（7周齡，260～300 g），購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。動物合格證號：1505009。

1.3主要儀器BS380型生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；UV-1800型紫外分光光度計 （日本島津公司）；RMI255石蠟切片機 （德國Leica公司）；RT-PCR儀 （武漢新未來儀器技術有限公司）；DYY-11型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽（北京六一儀器廠）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4造模與分組參照Longa EZ等報道的方法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型：腹腔注射水合氯醛實施麻醉后仰位固定，維持肛溫（38.0±0.5）℃，沿頸正中切口、暴露頸總動脈（CCA）及頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）［6］。夾閉CCA和ICA并結扎ECA，在ECA殘端開一小口，插入浸過肝素的拴線至大腦前動脈止，同時松開夾閉CCA和ICA的動脈夾。拴線插入后在ECA插口近端用線結扎，逐層縫合；2 h后，將拴線輕輕拔出，恢復血流再灌注。取100只模型大鼠隨機分為模型組、黃芪甲苷小劑量組（10 mg/kg）、黃芪甲苷中劑量組（20 mg/kg）、黃芪甲苷大劑量組（40 mg/kg）和銀杏葉提取物（200 mg/kg）組，每組20只。另取20只同齡大鼠作為假手術組，假手術組行手術通路，除不插入栓線外，其余操作同手術組。各治療組均于再灌注前30 min通過腹腔注射給藥，假手術組和模型組均給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.5觀察方法1）神經功能評分。參照Bederson等報道的方法進行盲法評分：置地上，向缺血對側轉圈，計1分；提鼠尾，對側前肢出現腕屈曲、肘屈曲、肩內旋，分別計1、2、3分；對側推動時阻力下降，根據下降程度計1～3分；置金屬網上，根據對側肌張力下降程度計1～3分［7］。2）腦組織含水量的測定。腹腔注射烏拉坦實施麻醉后斷頭取腦并剝取腦組織，去除嗅球、小腦和低位腦干后稱質量，為濕質量（W）；置于110℃恒溫干燥箱中烘烤48 h后稱質量，為干質量（D），計算腦組織含水量：腦含水量（%）=［（W-D）/W］×100%。3）腦梗死體積的測定。沿冠狀做5個切片，置于2%TTC染色液中，于37℃環境中恒溫避光孵育30 min，紅色區域為正常腦組織、蒼白色為梗死區，然后通過圖像分析軟件Imagepro Plus 6.0分析梗死體積百分比。4）腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的檢測。剪碎后加入適量冷裂解液行研磨勻漿，3000 r/min離心10min后取上清液，然后通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。5）血清中CK、LDH含量的檢測。斷頭取腦前，開腹經腹主動脈取血，1500 r/min離心10 min后取血清，然后通過全自動生化檢測儀測定血清中CK、LDH含量。6）腦組織形態學改變的觀察。大腦組織置于4%多聚甲醛溶液中進行組織固定，經石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）和展片處理后，行常規HE染色，然后通過光學顯微鏡觀察腦組織形態學變化并照相保存。7）細胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數（AI）的計算。取腦組織石蠟切片，經常規脫蠟水化處理后，按照試劑盒操作步驟行TUNEL染色（細胞核黃褐色為陽性著色），然后通過光學顯微鏡觀察神經細胞凋亡狀況。AI的計算：每張染色切片隨機選取6個視野，分別計數視野內細胞總數和凋亡細胞數，各組分別取平均值，然后計算各組大鼠凋亡指數：AI=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。8）細胞中NF-κB蛋白表達的檢測。制備腦組織勻漿液，經12000 r/min低溫（4℃）離心10 min后取上清液，經BCA法蛋白定量后，行變性、上樣、電泳、轉膜、春紅溶液染色、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗（NF-κB，β-actin）4℃過夜、洗膜、二抗室溫孵育1 h后經ECL顯色，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

1.6統計學處理應用SPSS15.0統計軟件分析。實驗數據均以（±s）表示；組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有極顯著性。

2　結　果

2.1各組大鼠神經功能評分、腦組織含水量和腦梗死體積比較見表1。與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分較顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠神經功能評分顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）；與假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量和腦梗死體積均顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷大、中劑量組、銀杏葉提取物組大鼠腦組織含水量和腦梗死體積均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表1　各組大鼠神經癥狀評分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

表1　各組大鼠神經癥狀評分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　腦含水量（%）假手術組　20　77.8±1.4模型組　20　85.8±1.9**黃芪甲苷小劑量組　20　84.3±2.2神經功能評分（分）　腦梗死體積（%）0.0±0.0　0.0±0.0 8.5±0.9**　28.4±2.3**7.8±1.2　25.1±2.9黃芪甲苷中劑量組　20　79.9±1.7△△6.3±0.6△△　21.7±2.6△黃芪甲苷大劑量組　20　4.8±0.5△△　17.4±2.0△△　78.1±1.8△△銀杏葉提取物組　20　6.5±0.7△△　22.4±2.8△　81.3±1.8△

2.2各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較見表2。與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較（±s）

表2　各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較（±s）

組別　n假手術組　20模型組　20黃芪甲苷小劑量組　20 SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）16.2±3.7　17.5±3.8 7.9±2.2**　9.4±2.1**8.6±2.9　10.1±2.3黃芪甲苷中劑量組　20　10.3±2.7△　11.3±2.8△黃芪甲苷大劑量組　20　12.5±3.4△△　13.6±3.5△△銀杏葉提取物組　20　9.7±2.5△　11.7±2.6△CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）4.9±1.3　4.6±1.2 2.5±0.6**　9.3±1.7**2.8±0.9　8.1±2.3 3.6±1.2△　6.5±1.8△△4.3±1.5△△　5.2±1.6△△3.0±0.8　6.1±1.4△△

2.3各組大鼠血清中CK、LDH含量比較見表3。與假手術組比較，模型組大鼠血清中CK、LDH含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組CK、LDH含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

表3　各組大鼠血清中CK、LDH含量比較（U/L，±s）

表3　各組大鼠血清中CK、LDH含量比較（U/L，±s）

組別　n假手術組　20模型組　20黃芪甲苷小劑量組　20 CK　LDH 161.5±13.7　178.4±15.1 346.8±24.1**　360.5±27.3**310.4±26.9　341.9±32.7黃芪甲苷中劑量組　20　257.0±23.5△△　268.1±28.4△黃芪甲苷大劑量組　20　221.8±19.3△△　227.5±23.0△△銀杏葉提取物組　20　273.2±21.9△　263.8±25.1△

2.4各組大鼠腦組織結構形態學變化見圖1。經HE染色后通過光學顯微鏡觀察發現，假手術組大鼠腦組織結構未見異常；模型組大鼠腦組織呈現明顯的病理性形態學變化，神經細胞水腫變性、呈空泡狀，胞漿疏松、胞質染色不均，胞核深染，神經元數量明顯減少等；而與模型組比較，黃芪甲苷各治療組大鼠缺血區域腦組織病變出現不同程度的改善，其中以黃芪甲苷大劑量組效果最為顯著。

圖1　各組大鼠腦組織結構形態學（HE染色，200倍）

2.5各組大鼠神經細胞凋亡狀況及AI經TUNEL染色后通過顯微鏡觀察發現，模型組大鼠神經細胞凋亡數量較假手術組顯著增多，經黃芪甲苷治療后局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞凋亡狀況明顯較輕，其中以黃芪甲苷大劑量組效果最為顯著，見圖2。計算AI發現：模型組大鼠神經細胞AI較假手術組顯著升高（P＜0.01）；而與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠神經細胞AI顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見表4。

2.6各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達狀況見圖3，表4。與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中NF-κB蛋白表達量顯著上調（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達量均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2　各組大鼠神經細胞凋亡狀況（TUNEL染色，200倍）

表4　各組大鼠神經元AI、腦組織NF-κB蛋白表達比較（±s）

表4　各組大鼠神經元AI、腦組織NF-κB蛋白表達比較（±s）

組別　n假手術組　20模型組　20黃芪甲苷小劑量組　20 AI（%）　NF-κB/β-actin 3.4±1.2　0.13±0.05 41.5±6.3**　0.42±0.13**36.2±5.7　0.37±0.12黃芪甲苷中劑量組　20　28.0±5.1△　0.34±0.08△黃芪甲苷大劑量組　20　19.3±4.2△△　0.21±0.07△△銀杏葉提取物組　20　30.8±4.7△　0.28±0.11△

圖3　各組細胞NF-κB蛋白表達

3　討　論

正常生理狀態下，體內生成的氧自由基（ROS）能夠在SOD的催化作用下還原生成H2O2，并在GSH-Px 或CAT催化作用下進一步還原生成對人無害的H2O 和O2［8-9］，從而維持體內氧自由基的動態平衡，因此SOD、GSH-Px、CAT共同構成了機體的抗氧化防御系統，它們的活性能夠直接反映機體抗氧化能力；而血清中脂質過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映細胞損傷程度。神經細胞膜受氧自由基攻擊而發生脂質過氧化損傷后，細胞內CK和LDH將迅速釋放入血，致使血清中二者含量陡然增高，能夠敏感而準確地反映神經細胞受氧自由基損傷程度。

細胞凋亡是一種繼發行為，氧化應激損傷是其非常重要的誘發因素之一［10］，NF-κB為多效能核轉錄因子，被稱為連接氧化應激損傷和細胞凋亡的“橋梁”［11］。Zhang Q等研究發現，受ROS攻擊而活化的NF-κB能夠促進巨噬細胞活化和浸潤，誘導促凋亡信號釋放而導致細胞凋亡［12］；并且被活化的NF-κB進入細胞核后能夠與DNA的相應位點結合，參與調控下游相關靶基因的轉錄表達［13］，證實NF-κB激活與氧化應激誘導的心肌細胞凋亡密切相關。

本實驗通過線栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型進行研究發現，與模型組比較，經黃芪甲苷（20、40 mg/kg）治療能夠顯著改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能癥狀、顯著降低腦梗死體積和腦組織含水量、明顯改善腦組織病變；進一步研究發現，與模型組比較，黃芪甲苷（20、40 mg/kg）治療治療組腦組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性顯著升高、MDA含量顯著降低、血清中CK和LDH含量顯著降低，腦組織中NF-κB蛋白表達，神經細胞凋亡狀況顯著改善；提示黃芪甲苷具有降低局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激損傷的作用，其作用機制可能與黃芪甲苷能夠有效改善抗氧化酶活性、提高機體清除自由基能力以及下調NF-κB蛋白表達、抑制神經細胞凋亡有關。

［1］Zhang HF，Li TB，Liu B，et al.Inhibition of myosin light chain kinase reduces NADPH oxidase-mediated oxidative injury in rat brain followxing cerebral ischemia/reperfusion［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2015，388（9）：953-963.

［2］Yang J，Li J，Lu J，et al.Synergistic protective effect of astragalosideⅣ-tetramethylpyrazine against cerebral ischemicreperfusion injury induced by transient focal ischemia［J］.J Ethnopharmacol，2012，140（1）：64-72.

［3］曲麗君，曲曉峰.大豆異黃酮對大鼠血脂和抗氧化作用的研究［J］.中國醫藥導報，2013，15（12）：2090-2091.

［4］李鐵成，馬寶豐，李德生，等.黃芪甲苷對大鼠肝缺血/再灌注損傷的保護作用［J］.天津中醫藥，2014，31（10）：621-623.

［5］馬小亮，王桂敏.黃芪甲苷灌胃預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中國老年學雜志，2015，35（17）：4795-4796.

［6］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in the rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［7］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［8］Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase：the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme［J］.J Virol，2014，2588（14）：254-261.

［9］Syed SN，Rizvi W，Kumar AA，et al.In vitro antioxidant and in vivo hepatoprotective activity of leave extract of raphanus sativus in rats using CCL4 model［J］.Afr J Tradit Complement Altern Med，2014，11（3）：102-106.

［10］陳良金，石孟瓊，賀海波，等.珠子參總皂苷對H2O2誘導新生大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用［J］.中國臨床藥理學與治療學，2012，17（8）：860-867.

［11］楊帆，王永青，彭余江，等.NF-κB在顱腦損傷后繼發氧化應激及細胞凋亡之間的關系研究［J］.浙江創傷外科，2014，19（6）：899-902.

［12］Zhang Q，Huang WD，Lv XY，et al.Ghrelin pro tects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling［J］.Eur J Pharmacol，2011，654（2）：142-149.

［13］Li Q，Xu LS.Mechanism of destruction of islet cells by exogenous nitric oxide［J］.Med J Natl Def Force Northwest China，2002，23（5）：361-363.

（收入日期2015-12-28）

The Effects of Astragalosides on Oxidative Stress in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

YANG Long，HAN Dong.Cangzhou Central Hospital，Hebei，Cangzhou 061001，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0799-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.014

河北省衛生廳重點科技研究計劃項目（20130359）
△

（電子郵箱：zhangshiqin2015@163.com）