丹參多酚酸鹽保護家兔心肌缺血再灌注損傷的機制研究*

章春艷　曹　政　凡孝琴　李櫬香　戢艷瓊（湖北省十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000）

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丹參多酚酸鹽保護家兔心肌缺血再灌注損傷的機制研究*

章春艷曹政凡孝琴李櫬香戢艷瓊△
（湖北省十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000）

目的 觀察丹參多酚酸鹽對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護機制。方法 家兔24只，按隨機數字表法分為對照組、模型組、丹參多酚A、B組，采用絲線結扎家兔左冠狀動脈前降支30 min后復灌30 min，并反復3次缺血再灌注的方法造模，對照組不造模。造模后丹參多酚A、B兩組經耳緣靜脈注射丹參多酚酸鹽［按2 mg/（kg·d）、4 mg/（kg·d）］，模型組注射等量0.9%氯化鈉注射液。注射1周后檢測家兔心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性；家兔靜脈血清高敏C反應蛋白（hs-CRP）、血清肌鈣蛋白Ⅰ（cTnI）、乳酸脫氫酶（LDH）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌丙二醛（MDA）。結果 丹參多酚A、B組Ⅰ～Ⅳ及T-SOD、CK-MB等酶的活性明顯提高，hs-CRP、cTnI、LDH、MDA明顯降低，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。丹參多酚A、B組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 丹參多酚酸鹽能夠相對提高缺血心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ及T-SOD活性，減少氧自由基造成的脂質過化反應，改善缺血心肌能量代謝而實現對缺血再灌注損傷心肌的保護。

丹參多酚酸鹽缺血再灌注心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ酶

【Abstract】Objective：To study the protective effects of Salvia miltiorrhiza on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits.Methods：24 rabbits was randomly assigned for the control group，the model group，Salvia miltiorrhiza polyphenols in group A and B.They took ligation of coronary artery of rabbits anterior descending coronary artery for 30 min and then reperfusion for 30 min，and ischemic eperfusion modeling methods were repeated for three times，the control group without modeling.After modeling，Salvia miltiorrhiza polyphenols A and B groups took Radix Salviae Miltiorrhizae polyphenol acid salt by ear vein injection［2 mg/（kg·d），4 mg/（kg·d）for 1 week （W）.The model group was injected with physiological saline.After a week，the following data was measured：rabbit myocardial mitochondrial respiratory chain enzyme complexesⅠ～Ⅳactivity and serum high sensitivity C reactive protein（hs-CRP），troponinⅠ（cTnⅠ），lactate dehydrogenase（LDH），total superoxide dismutase enzyme （SOD），MB isoenzyme of creatine kinase（CK-MB）and myocardial malondialdehyde（MDA）.Results：Compared with the model group，the activities ofⅠ～Ⅳ，T-SOD and CK-MB in two groups were significantly increased；hs-CRP，cTnI，LDH，MDA were significantly lower；the difference was statistically significant（P＜0.05）.In the comparison of A and B group，there was no statistical significance（P＞0.05）.Conclusion：Salvianolate can relatively increase ischemic myocardial mitochondrial respiratory chain enzyme complexes I～IV and the activity of SOD，reduce the oxygen free radical induced lipid peroxidation reaction，and improve the energy metabolism of ischemic myocardium and realize of ischemia and reperfusion injury of myocardial protection.

【Key words】Salvia miltiorrhiza；Ischemia reperfusion；Myocardial mitochondrial respiratory chain complex IIV；Enzyme

丹參始載于 《神農本草經》，屬唇形科植物丹參（Salviamiltiorrhiza Bge．），藥用其干燥根莖，屬活血化瘀藥材，其味苦，性微寒，歸心肝二經。丹參的成分復雜，富含丹參素、原兒茶醛、丹參多酚、丹酚酸A、B等，其中丹參素、丹參多酚等具有較強的擴張冠狀動脈、防止心肌缺血、降低心肌耗氧量等作用［1］。本實驗中使用的丹參多酚酸鹽是丹參的提取單體制成的凍干粉針劑，丹參乙酸鎂、紫草酸鎂、紫草酸二鉀和迷迭香酸鈉等是其主要藥理成分［2］?，F代醫學證實其中的丹參素及丹參多酚酸鹽具有活血、化瘀、通脈、抗氧化、抗自由基、擴張心肌血管、增加缺血心肌組織血液流量，抑制缺血區組織細胞內鈣超載而發揮組織保護作用［3-4］。本課題用家兔急性心肌缺血/再灌注損傷動物模型來觀察丹參多酚酸鹽對心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性及抗脂質過氧的影響，研究丹參多酚酸鹽對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組家兔40只，兔齡100 d左右，體質量（1.8±0.2）kg，隨機分為對照組、模型組、丹參多酚A、B組，每組10只。由中國醫學科學院實驗動物中心提供實驗動物，合格證編號為SCXK（京）2005-0013。

1.2試藥與儀器注射用丹參多酚酸鹽［上海綠谷制藥有限公司，規格100mg（含丹參乙酸鎂80mg），批號Z20050248）；戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司，批號071222）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、丙二醛（MDA）等測試盒（上海江萊生物科技有限公司，批號KB13297）；BL-420F生物機能實驗系統（成都泰盟電子有限公司，型號BL-420F）；MRI磁共振小動物呼吸機（上海玉研科學儀器有限公司，型號MRI-1）。

1.3模型制備參照文獻［5］，用3%戊巴比妥鈉（10 mg/100 g）經腹腔注射麻醉家兔，麻醉后腹部向上固定于兔臺，剪去胸腹部兔毛并碘伏消毒，接MRI磁共振小動物呼吸機維持呼吸。胸骨5～7肋間開胸暴露心臟并剪開心包，將心臟向左上側擠壓，用8號小圓針自肺動脈圓錐進針自左心房邊緣處出針，結扎左冠狀動脈前降支30 min后復灌30 min，反復3次缺血再灌注造成急性心肌缺血再灌注損傷，接Ⅱ導聯心電圖導線，BL-420F生物信號采集系統記錄心電圖。Ⅱ導聯心電圖以出現明顯ST段抬高或倒置、T波高聳、期前收縮等即模型成功標準。對照組僅麻醉但不手術作為空白對照。本實驗全部動物均出現以上心電圖改變，造模成功率100%，且均存活。

1.4給藥方法造模成功后丹參多酚A、B兩組經耳緣靜脈注射丹參多酚酸鹽［按2 mg/（kg·d）、4 mg/（kg·d）］，對照組及模型組注射等量0.9%氯化鈉注射液，均注射1周。

1.5標本采集與檢測參照文獻［6］，4組家兔在治療1周后經耳緣靜脈取1 mL靜脈血，酶聯免疫吸附法檢驗血清高敏C反應蛋白（hs-CRP）、血清肌鈣蛋白I （cTnI）、乳酸脫氫酶（LDH）、T-SOD、CK-MB、MD。采用紫外分光光度儀檢測家兔心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性。

1.6統計學處理應用SPSS17.0軟件對各組家兔Ⅰ～Ⅳ、T-SOD、hs-CRP、cTnI、LDH、CK-MB、MD數據進行處理，數據以（±s）表示，各組指標的比較采用單因素方差分析，組間差異采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組家兔T-SOD、LDH、CK-MB、MDA活性比較見表1。治療1周后模型組血清LDH、MDA顯著增高，T-SOD、CK-MB水平顯著降低，與對照組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05），說明模型組家兔心肌損傷嚴重，造模成功。在使用丹參多酚治療1周后，丹參多酚A、B組T-SOD、CK-MB明顯增高，LDH、MDA明顯降低，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但TSOD、LDH、CK-MB、MDA仍未恢復到對照組水平，丹參多酚A、B組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1　各組家兔T-SOD、LDH、CK-MB、MDA酶活性比較（±s）

表1　各組家兔T-SOD、LDH、CK-MB、MDA酶活性比較（±s）

與對照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。下同。

組　別　n T-SOD（U/mL）LDH（nmol/mL）CK-MB（U/L）MDA（nmol/mg）對照組　10模型組　10丹參多酚A組　10 225.79±17.27　29.59±4.21　14.49±1.15　8.58±0.61 117.34±13.79△102.35±9.27△　5.17±0.43△　90.90±8.47△179.87±11.71▲　60.49±4.87▲　9.41±3.11▲　31.37±3.97▲丹參多酚B組　10183.73±12.67▲　62.12±4.23▲　10.09±2.97▲　33.58±4.21▲

2.2各組家兔血清hs-CRP、cTnI比較見表2，模型組血清hs-CRP、cTnI釋放明顯高于對照組，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），說明缺血再灌注是造成血清hs-CRP、cTnI升高的主要原因。丹參多酚A、B兩組治療1周血清hs-CRP、cTnI釋放明顯減少，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但仍未恢復到對照組水平，且丹參多酚A、B組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2　各組家兔血清hs-CRP、cTnI比較（μg/mL，±s）

表2　各組家兔血清hs-CRP、cTnI比較（μg/mL，±s）

組別　n hs-CRP　cTnI對照組　10模型組　10丹參多酚A組　10 5.79±0.27　21.59±4.21 17.34±1.79△　92.35±9.27△10.87±1.71▲　37.49±2.87▲丹參多酚B組　1011.73±1.67▲　32.12±2.23▲

2.3各組家兔心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性比較見表3。模型組家兔心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性較低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。在經過丹參多酚酸鹽治療1周后，丹參多酚A、B兩組復合體I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ表達均有不同程度提高，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。但復合體I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ仍未恢復到對照組水平，丹參多酚A、B組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3　各組家兔心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性比較（±s）

表3　各組家兔心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性比較（±s）

組　別　n 復合體Ⅰ　復合體Ⅱ　復合體Ⅲ　復合體Ⅳ對照組　10模型組　10丹參多酚A組　10 25.79±2.27　19.59±2.01　14.49±1.75　28.58±2.61 7.34±0.49△　5.35±0.27△　5.10±0.39△　7.90±0.49△19.87±1.71▲14.49±1.87▲　9.49±0.91▲11.37±1.07▲丹參多酚B組　1018.73±1.67▲12.12±4.23▲10.29±1.92▲13.08±1.24▲

3　討　論

心肌缺血再灌注損傷多發生在急性心肌梗死、冠脈搭橋術、冠脈溶栓術、心肌梗死再通術等治療過程中［7］，其病理基礎是冠狀動脈病變導致血供急劇減少或中斷，使缺血區心肌嚴重而持久地發生急性缺血，嚴重者造成患者死亡［8］。因此，如何減輕心肌缺血再灌注損傷是治療此類疾病的關鍵，有大量實驗及臨床經驗證實丹參多酚可以減輕心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷。丹參多酚酸鹽可提高線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性，抗氧化、抗自由基，并可抑制缺血區組織細胞內鈣超載，預防和治療血管再狹窄及抗心肌缺血等作用［9］。

本觀察發現，與模型組比較，丹參多酚A、B兩組Ⅰ～Ⅳ及T-SOD、CK-MB等酶的活性明顯提高，hs-CRP、cTnI、LDH、MDA明顯降低。由于復合體Ⅰ～Ⅳ是細胞線粒體呼吸鏈的細胞器，這種電子傳遞結構是真核生物能量代謝的中心，它的活性能直接或間接反映細胞線粒體的呼吸功能。線粒體也是細胞產生氧自由基場所，當機體因缺血缺氧時，呼吸鏈處于高度還原狀態，復合體Ⅰ～Ⅳ活性降低，細胞產生的氧自由基會導致線粒體受損造成線粒體呼吸功能障礙功能，進而造成缺血再灌注心肌細胞損害［10］。在本實驗中，丹參多酚A、B兩組心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ較模型組高，說明丹參多酚鹽可以提高Ⅰ～Ⅳ活性，抑制細胞線粒體內產生氧自由基，恢復細胞線粒體呼吸鏈的代謝功能?，F代醫學證實，在正常生理代謝狀態下，機體中氧自由基生成與清除均維持著動態平衡，當機體發生病理改變如心肌組織缺血再灌注時，自由基清除酶活性急劇下降而造成大量氧自由基生成，產生嚴重的脂質過氧化反應造成血管內皮細胞嚴重損傷，此時心肌酶譜明顯異常，如血清T-SOD、CK-MB水平降低，MDA、LDH異常增高。MDA、LDH主要存在于心肌細胞的胞質中，當心肌細胞因缺血再灌注嚴重受損時會大量被釋放入，這與本實驗模型組中結果一致，說明在缺血再灌注是造成心肌損傷的主要因素。而丹參多酚A、B兩組T-SOD、CK-MB等酶的活性明顯提高，MD、LDH等酶的釋放明顯降低，提示丹參多酚鹽確有心肌保護作用，這與大多數學者研究結果一致［11］。其作用機制應與降低細胞內H-ATP酶水解活性、同時增加H-ATP酶合成活性，阻止黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶的轉變，以調節細胞內能量代謝，減少自由基的產生有關［12］。觀察還發現，丹參多酚A、B兩組治療1周后hs-CRP、cTnI明顯降低，這可能與丹參多酚酸鹽的鈣拮抗作用有關，丹參多酚鹽可能通過促進恢復細胞內Ca2+-ATP酶活性而達到減少細胞內鈣超載的作用［13］。也有可能通過Na+-K+-ATP酶來調節Na+-H交換，抑制細胞Na+-Ca2+鈣交換，阻止組織間液C2+內流造成的心肌細胞內鈣超載，改善心肌細胞的能量代謝［14］。丹參多酚酸鹽還可活血、化瘀、通脈而改善缺血心肌微循環，增加冠脈灌注和心肌供氧，進而改善心肌缺血再灌注損傷而起到保護作用［15-16］?？傊?，家兔在造成心肌缺血再灌注損傷時，機體出現嚴重的脂質過氧化反應，缺血心肌細胞產生的氧自由基會導致線粒體受損，最終造成線粒體呼吸功能障礙。在經丹參多酚酸鹽治療后，丹參多酚酸鹽能夠相對增加缺血心肌線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅳ的活性，提高T-SOD活力，減少氧自由基造成的脂質過化反應，改善缺血心肌能量代謝而實現對損傷心肌的保護作用。

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Study on the Mechanism of Salvia Miltiorrhiza in Protecting Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Rabbits

ZHANG Chunyan，CAO Zheng，FAN Xiaoqin，et al.The Affiliated Hospital of Hubei Medical College，Shiyan Taihe Hospital，Hubei，Shiyan 442000，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0804-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.015

湖北省自然科學基金（2013CFB470）
△

（電子郵箱：zhangzcyzcy@163.com）

2016-01-10）