食源性致病菌快速檢測的前增菌培養的研究進展

錢紅玫,胡文忠,馮　可,薩仁高娃,邵文俊

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116600;2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

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食源性致病菌快速檢測的前增菌培養的研究進展

錢紅玫1,胡文忠2,*,馮可3,薩仁高娃3,邵文俊2

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116600;2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

近年來,由食源性致病菌污染食物導致中毒或死亡事件在全球頻發,嚴重危害人類健康,食源性微生物引起的疾病已成為危害人類健康的頭號殺手。目前,食源性致病菌快速檢測技術研究已成為國際學者關注的熱點,研究的焦點主要集中在快速檢測技術。但是,在快速檢測中,尤其是分子生物學檢測技術需要增菌過程,如何縮短前增菌時間和提高增菌效果,是快速檢測研發解決的難題。本文對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌的爆發案例進行了簡述,重點綜述了前四種菌的前增菌的研究現狀,以便了解到現有的快速檢測的前增菌培養的研究情況,在更短時間檢測出食源性致病菌。

食源性致病菌,增菌培養,快速檢測

食源性致病,是食品安全性問題重要的關注點,也是食品安全研究的一個重要方向。據統計,世界因食品污染而致病的人數已達數億人,其中由生物性污染造成的人數占首位[1],是一個十分嚴重的安全問題。近幾年來,隨著科技的發展,工業食品也隨之增加,伴隨著對工業食品的大量食用,食源性致病菌污染食品而引起的中毒爆發事件在全球時有發生,據統計,40%的中毒爆發事件是因為餐館或生產機構生產時食物被污染[2]。食源性感染往往會大量的感染人群,會在學校,工廠、餐廳等許多機構迅速的發生,病原體的快速檢測和鑒定是控制食源性疾病爆發的關鍵問題[3]。面對如此大的致病率,食源性致病菌的快速檢測問題也得到了普遍的關注。在致病微生物中,沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌等幾種菌是常見的因污染果蔬、肉類、海產品而引發致病的菌種。目前,利用傳統的檢測方法檢測食源性致病菌仍存在著檢測時間長、操作方法復雜、檢驗結果不準確等問題,因此,如何能快速增菌,是實現快速檢測的前提。雖然現有的分子生物學檢測技術已經相對成熟,但將前增菌與檢測技術相結合的研究仍然是一個盲點,有待進一步的改進。本文對近幾年食源性致病菌的爆發情況和現有的前增菌培養的研究進展進行了綜述,以期對未來的快速檢測研究有一定的參考價值。

1　常見的食源性致病菌的爆發

食源性致病菌一直是食品安全問題的一個隱患,在全球,每年都會有大量的人群被食源性致病菌威脅到生命安全,表1對近幾年來幾種常見的食源性致病菌的爆發案例進行了列舉。

表1　幾種常見的食源性致病菌的爆發案例

從上表1可以看出,近3年來,在世界各地,因餐廳或工廠的衛生問題而導致食物被食源性致病菌感染,進而引發的食源性疾病的爆發情況仍然存在,其爆發情況一般是小面積大量爆發,因沒有及時的應對措施,常常會引起人群的恐慌,并讓大家對食品安全性問題產生質疑。面對如此嚴峻的形勢,食源性致病菌快速檢測的問題也隨之變得尤為重要。

2　食源性致病菌單菌的增菌培養的研究

2.1沙門氏菌前增菌培養的研究

雖然分子生物學方法[14]和免疫學方法[15]能快速檢測沙門氏菌污染樣品的狀況,但通過前增菌培養使菌體達到檢測量也十分的重要。根據沙門氏菌的國家檢測標準[16],沙門氏菌的檢出時間大約在3～4 d,時間十分漫長。索標[17]等人結合熒光PCR檢測技術,對熱損傷沙門氏菌檢測前的選擇性增菌進行了研究,其對已有的SEL培養基進行了優化,向其中添加了0.01 g/L的吖啶黃、0.05 g/L的環己酰亞胺、0.05 g/L的磷霉素以及0.002 g/L的萘啶酸,最終得到的培養基作為損傷沙門氏菌的修復劑以達到增菌的效果。實驗結果表明,SEL可以在20 h內可以使各種接種量的菌體修復至109CUF/mL。郭闖[18]等人也結合了PCR技術對快速檢測的前增菌進行了研究,其選用了氯化鎂孔雀綠增菌液(MM)和緩沖蛋白胨水(BPW)兩種增菌液進行了研究,并將兩種增菌液的增菌效果進行了比較,研究結果表明,短時間內,BPW的增菌效果明顯優于MM,增菌24 h后兩種增菌液的增菌效果基本相同;對BPW不同增菌時間的增菌效果進行比較,發現8 h的增菌效果是最佳效果。范媛媛[19]等人對一種新推出的SX2液體培養基進行了驗證,SX2液體培養是應用于前增菌的一種新型培養基,這種培養基可以省去劃平板和觀察菌落特征的時間,且得出結果準確,是實驗室快速檢測沙門氏菌的一種選擇。

2.2金黃色葡萄球菌前增菌培養的研究

金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中,到目前為止,已經發現了20種以上的金黃色葡萄球菌和類似金黃色葡萄球菌[20]。我國每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位[21]。由于金黃色葡萄球菌對人體健康有重大影響,各國均將該菌作為食品重點檢測和監控的項目。目前我國的檢測方法主要是按照國家標準GB4789.10-2010[21]進行的,其檢出時間一般在36～72 h。為了找出一種更快捷的增菌方法用以檢驗,李曉琍[22]等人對2種增菌液的增菌效果進行了研究。其利用菌體在Baird-Parker瓊脂平板上的生長情況來比較驗證2種增菌培養基的增菌效果。實驗結果表明,在金黃色葡萄球菌含量比較高時,采用7.5%氯化鈉肉湯增菌,只需要6 h就可以使菌體濃度從100CUF/mL增加至105CUF/mL;而對于金黃色葡萄球菌含量比較低而雜菌含量高的情況,則采用10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的增菌效果更好,但在培養24 h后才能達到增菌的效果。為了更快的檢測出金黃色葡萄球菌,李瑩[22]以營養瓊脂為基礎,通過添加促進金黃色葡萄球菌生長的添加劑,最終得到配方:蛋白胨10 g/L、酵母粉5.0 g/L、丙酮酸鈉5.0 g/L、氯化鈉20 g/L、亞碲酸鉀20 mg/L、氯化鋰5 g/L、瓊脂15 g/L、5-溴·4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.3 g/L。經過實驗驗證,與傳統的Baird-Parker瓊脂平板相比,其在18 h就可以檢出菌體,與傳統方法相比,大大縮短了時間,檢出率達到(90.2±6.7)%,檢測結果與國標無明顯差異,證明了其有效性。張超楠[23]將計算機視覺技術與前增菌技術結合,通過對促進劑和抑制劑的選擇,得到配方:胰蛋白胨17.0 g/L,植物蛋白胨3.0 g/L,氯化鈉68 g/L,磷酸氫二鉀2.5 g/L,葡萄糖2.5 g/L,丙酮酸鈉5 g/L,甘氨酸9 g/L,亞碲酸鉀60 mg/L,苯乙醇3.8 mL/L。此增菌培養基在4 h內可以抑制除金黃色葡萄球菌外的生長,并可以達到增菌的效果,其在10～107CFU/mL(g)的菌落數范圍內都可以檢出,與傳統方法相比,不僅節省了時間,并且可以準確的檢出。

2.3單增李斯特菌前增菌培養的研究

該病原菌廣泛分布于自然界,有較強的生存能力,但一般情況下,食品中單增李斯特菌含量較低,且往往在加工中受到損傷[26-28]。因此,分離單增李斯特菌之前,必須對待檢樣品進行增菌。目前我國的檢測方法主要是按照國家標準GB4789.30-2010[29]進行的,其檢出時間一般在4～6 d。近幾年來,很多研究人員對單增李斯特菌的增菌進行了研究,其中朱敏[30]等人就做了有關于改良李斯特菌增菌液的研究。因李斯特菌的顯色培養基增菌效果沒有那么明顯,故向其中加入增菌劑和抑菌劑,將不同濃度的吖啶黃、萘啶酮酸、亞碲酸鉀、氯霉素加入增菌液中,發現用吖啶黃15 mg/L、萘啶酮酸20 mg/L、亞碲酸鉀15 mg/L的李斯特菌改良增菌液增菌,單增李斯特菌檢出率明顯高于國標法(p<0.05),單增李斯特菌的檢出率明顯提高了很多。傅宜方[31]等人提出了一種“前增菌方法”,即對損傷的李斯特菌進行修復以使菌體數量達到更多,使檢出效果更明顯,在用此方法增菌4 h后,與傳統方法比較,其檢出率為8.04%,遠遠大于傳統方法的檢出率1.79%,是前增菌的一個有利選擇。

2.4副溶血性弧菌前增菌培養的研究

副溶血性弧菌(VP)每年導致大約35000人患有食源性疾病[32],因該菌是一種在海洋中或鹽湖中廣泛生長的嗜鹽菌,所以其一般浸染的海產品居多[33]。目前我國的檢測方法主要是按照國家標準GB4789.7-2010[34]進行的,其檢出時間一般在44～66 h。為了提高副溶血性弧菌的檢出率,檢測前的前增菌是必不可少的,現有的培養基增菌時間過慢,因此,許多人對優化培養基進行了研究。趙廣英[35]等人根據副溶血性弧菌的培養生長條件以混合型蛋白胨和酵母浸膏為基礎培養基,向其中添加有益于副溶血性弧菌增長的試劑,通過正交實驗得到配方:混合蛋白胨2%(胰蛋白胨1%、魚蛋白胨1%)、酵母浸膏0.2%、氯化鈉3.5%,當用這種配方并調節pH至8.6時,其對副溶血性弧菌增菌效果是普通增菌液的(1.4±0.5)倍,由此可見,其增菌效果明顯提高,可以提前達到檢出限并可以提高檢出率。陳冠武[36]等人也對海水中的副溶血性弧菌的培養基進行了優化,其通過將不同的副溶血性弧菌培養基組合或將其中一種弧菌培養基與堿性蛋白胨水相組合,并與常用于檢測弧菌的TCBS瓊脂和弧菌顯色培養基進行比較,實驗結果表明,堿性蛋白胨水與3%氯化鈉堿性蛋白胨水組合后增菌5～6 h后,其對副溶血性弧菌的分離效果和檢出效果都有明顯的提高。劉雪飛[37]等人利用響應面法優化了副溶血性弧菌的培養基,最佳的配方:酪蛋白胨6.75 g/L、胰蛋白胨3.25 g/L、牛肉膏4.76 g/L、氯化鈉36.75 g/L。用此配方通過響應面法進行檢測,當培養12 h后,其檢測結果是模型預測值的98.77%,可以充分的檢測出副溶血性弧菌,是一個可靠地結果。

3　食源性致病菌共增菌培養的研究

食源性疾病暴發時,引發暴發的致病菌并不明確,如果只對單一的菌種進行增菌然后逐個檢測,十分的浪費人力與財力,因此,對于可以同時富集多種致病菌培養基的研究變得更加重要了。就目前而言,共增菌培養的研究相對較少,現最多只有三種菌的富集。常用的方法為向液體培養基中加入增菌劑和抑菌劑,通常向培養基中所添加的增菌劑與抑菌劑[38-39]有亞碲酸鉀、氯化鋰、甘露醇、丙酮酸鈉、吖啶黃、萘啶酮酸、檸檬酸鈉、水楊酸、苯乙醇、磷霉素等。

王永志[40]等人研制出了一種可以使沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌共增菌的培養基,其以15 g/L胰蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、2.5 g/L磷酸二氫鉀、2.5 g/L葡萄糖、35 g/L氯化鈉為基礎增菌培養基,向其中加入增菌集和抑菌劑:氯化鋰0.5 g/L、牛膽鹽0.1 g/L、甘露醇2 g/L、亞碲酸鉀0.3 mg/L,最終得到的培養基可以充分滿足三種菌共同生長,增菌12 h就可以使菌從103CFU/mL增加至107CFU/mL,能夠充分達到檢測限。翁思聰[41]等人研制出了一種SSSV共增菌培養基,其可以使沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌同時生長,其以BPW為基礎培養基,向其中加入促進目標菌生長,抑制其他菌的添加劑,最終得到配方:緩沖蛋白胨水20 g/L、魚蛋白胨12 g/L、膽鹽3號3 g/L、檸檬酸鈉1.5 g/L、氯化鋰1 g/L、亞碲酸鉀1.2 mg/L、氯化鈉15 g/L、葡萄糖2 g/L、甘露醇1 g/L、丙酮酸鈉4 g/L。將此配方調節pH至7.2±0.4進行驗證,結果表明,利用SSSV培養三種菌8 h后,菌體濃度可達到106CFU/mL,不僅增菌時間短,增菌效果也十分明顯。陳萍[42]等人對沙門菌、志賀菌和金葡菌共增菌的培養基也進行了研制,其利用PCR對增菌效果進行鑒定,結果顯示,增菌培養基在增菌4 h即可達到PCR的檢測限,接種100 CFU/mL的菌液,在培養12 h后,可增加至106～108CFU/mL的菌量,充分達到了增菌的效果。王虎虎[43]等人提出了一種新的增菌方法,3種菌共修復,其利用TSB-YE作為修復亞致死狀態的致病菌,且得到了較好的增菌效果。

經過這幾種培養基的比較,得出結果表明,大多數增菌培養基的研究都是以現有的培養基為基礎培養基,通過添加對菌體有促進作用的試劑,并抑制其他菌體的生長,得到一種全新的共增菌培養基,此培養基的研制可以同時富集多種致病菌,最終達到可以同時檢出的效果,節省檢出時間。

4　展望

目前,食品安全問題一直是各國關注的焦點,而食源性致病菌的致病問題又是這一焦點的核心,每年都會有眾多的人群受到食源性致病菌的毒害,因此,能夠方便、快速的檢測出食源性致病菌將是大勢所趨。就目前而言,食源性致病菌的快速檢測技術要從快速增菌和快速檢測兩個方向入手,如何能夠在短時間內大量增菌,如何能夠快速、簡捷的分離提取出致病菌,將是阻止疾病暴發的關鍵存在點。通過查閱文獻,2000～2010年這十年間,前增菌的研究幾乎是一個空白,因此,前增菌液的研究將是以后研究的又一重點,其研究的方向有以下幾點。第一,單菌檢測的前增菌液種類繁多,要選定一種對單菌菌屬有增菌效果的增菌液并進行改良。第二,共增菌的增菌液仍需要進一步研究,達到最終可以同時富集5種或5種以上菌體。第三,將增菌方法與完善的檢測方法合理的結合,最終達到快速檢測的目的。

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Research progress in the pre-enrichment of rapid detection of foodborne pathogenic bacteria

QIAN Hong-mei1,HU Wen-zhong2,*,FENG Ke3,Sa-ren-gao-wa3,SHAO Wen-jun2

(1.College of Food Science,Dalian Polytechnic University,Dalian 116600,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

In recent years,the food poisoning and deaths caused by food-borne pathogens have frequently occurred in the world,serious harm to human health,food-borne microorganisms have become the No.1 killer of human health. At present,the research on the technology of food-borne pathogenic bacteria detection has become a hot spot for international scholars,and the focus of the research is on rapid detection technology. However,in the rapid detection,especially molecular biology techniques,pre-enrichment process is required,how to shorten the pre-enrichment time and improve the enrichment effect is a problem to solve that in the development of rapid detection. In this paper,outbreaks ofSalmonella,Staphylococcusaureus,Listeriamonocytogenes,VibrioparahaemolyticusandShigellaare discussed and focused on the status of the pre-enrichment of first four bacteria,in order to acquaintance the existing of pre-enrichment of rapid detection and achieve a shorter time to detect foodborne pathogens.

food-borne pathogenic bacteria;enrichment culture;rapid detection

2015-12-09

錢紅玫(1991-)，女，在讀碩士，研究方向：食品質量與安全，E-mail：qhm171@126.com。

胡文忠(1959- )，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)；國家自然科學基金項目(31172009，31471923)。

TS255.7

A

1002-0306(2016)13-0360-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.066