大腸桿菌O157：H7快速增菌培養基檢測效果的研究

宮春波 劉磊 陶文靖 王覃

摘 要：為了驗證對于大腸桿菌O157：H7菌株特異性、復蘇效果以及快速生長的特點，比較了3種培養基對于大腸桿菌O157：H7的增菌效果。研究結果表明，8h培養時間內，MicroFast?快速增菌培養基對于冷損傷和熱損傷的大腸桿菌O157：H7菌株具有良好的修復和增殖效果。MicroFast?快速增菌培養基營養組分適合O157菌株的生長需求，在MicroFast?快速增菌培養基中，大腸桿菌O157：H7菌株的倍增時間為13.5min，遠高于mEC+n的28min，且MicroFast?快速增菌培養基能夠完全抑制部分G+細菌以及部分G-細菌的干擾，對于大腸桿菌O157：H7具有特異性的選擇。故MicroFast?快速增菌培養基對于大腸桿菌O157：H7菌株具有良好的選擇特異性，能夠短時間內（8h內）有效富集培養大腸桿菌O157：H7菌株，是一種能夠實現大腸桿菌O157：H7菌株快速高效、特異增殖的培養基，將其結合檢測金標卡，能夠實現8h內快速檢測，結果可信可靠。

關鍵詞：MicroFast?快速增菌培養基 大腸桿菌O157：H7 增菌 效果

目前，病原微生物污染防控是食品安全的剛性需求，微生物污染是食品不合格的主要原因，也是造成食物中毒的主要原因，尤其以細菌性食物中毒為主，食品中大腸桿菌污染率最高達到了41.1%，大腸桿菌O157則為3.7%[1]。腸出血性大腸桿菌O157：H7是腸出血性大腸桿菌（EHEC）的一個血清型，是引起食源性疾病主要血清型[2]，主要臨床癥狀為突發性腹痛、腹瀉、血便，嚴重時并發腎衰竭，病死率高。大腸桿菌O157：H7主要污染肉類食品[3，4]，蔬菜中也時有檢出[5]，是食品中潛在危害巨大的食源性致病菌。因此，快速、特性、高效的檢出食品中大腸桿菌O157：H7，對于其引起的食源性疾病防控以及暴露病例的治療具有重要的意義。本文比較了MicroFast?快速增菌培養基（簡稱MF培養基）、改良EC肉湯培養基（簡稱：mEC+n）和FP培養基對大腸桿菌O157：H7的增菌效果，以期驗證不同培養基的增菌優勢和特異性，為探索省時、高效、特異的快速檢測方法提供依據。

1 材料與方法

1.1菌種

大腸埃希氏菌O157：H7（ATCC12478/NCTC12900）為實驗用標準陽性菌株。

大腸桿菌FSCC146255/146264、ATCC25922/8739、CMCC44102/44103（Escherichia coli）、腸桿菌ATCC14028/ 43864/49027（Enterobacteria），沙門氏菌CICC21482 CMCC 50333/50220/50115/ 50335（Salmonella），李斯特氏菌ATCC 19115、CMCC54002/ 22260（Listeria），假單胞菌ATCC 27853、CMCC10104（Pseudomonas），枯草芽孢桿菌ATCC 6633、CMCC63501（Bacillus subtilis），為特異性檢測用菌株。

1.2 培養基

MicroFast?快速增菌培養基，簡稱MF培養基，北京良潤生物科技有限公司；改良EC肉湯培養基，簡稱為mEC+n培養基，按照GB 4789.36-2008規定步驟配置，備用；FP培養基，國外某品牌培養基。

1.3 儀器設備

紫外可見分光光度計（UV-2450），日本島津；隔水式電熱恒溫培養箱（GHP-9270），金壇市城東久久實驗儀器廠；凈化工作臺（YJ-875），吳江市華都凈化設備公司；自動電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40C1），上海申安醫療器械廠；電子天平（BSA323S），北京賽多利斯。

1.4 方法

1.4.1 培養基的制備

按照說明書或者GB 4789規定的要求和步驟進行，按照需要制作液體培養基和固體培養基。

1.4.2 菌株修復

將陽性標準菌株進行制備熱損傷和冷損傷。熱損傷菌體制備：將標準陽性菌株的菌懸液（108～109cfu/mL）置于55℃水浴鍋、加熱15min后取出，室溫冷卻30min，定義為熱損傷菌體細胞，備用。冷損傷菌體制備：將菌懸液置于-20℃冰箱、冷凍2h，然后取出室溫預熱30min，定義為冷損傷菌體細胞，備用；正常對照組：未做處理的菌懸液，定義為正常組菌體細胞。將相同濃度的大腸埃希氏菌O157菌懸液菌，分別按照上述規定的方法進行菌體損傷處理，36±1℃、培養8h后，稀釋進行平板計數，每組做5個平行，取平均值。

1.4.3 生長速度

吸取0.2mL大腸埃希氏菌O157 NCTC12900的菌懸液（108～109cfu/mL），按照2%的接種量，分別接種到盛有10mL MF培養基、mEC+n培養基和FP培養基的18×180mm試管中，每組10支試管，36±1℃培養，每隔1h測定其OD600吸光度值，每只試管測3次，取平均值繪制其生長曲線。同時通過平板計數法計數對數期各時間點的菌落形成單位數，計算倍增時間。

1.4.4 特異性

無菌吸取0.2mL對照標準菌株菌懸液（108～109cfu/mL），接種于盛有10mL不同培養基中，36±1℃、培養18h，觀察培養管的渾濁程度，統計結果。

2 結果與分析

2.1 MF培養基、mEC+n培養基和FP培養基對菌株復蘇效果

熱損傷、冷損傷往往導致細菌菌體細胞生理狀態的破壞，部分成為存活但不能培養的菌體細胞（viable but non-euhurable state，VBNC），無法再常規培養基增殖生長[6]，具體到食品衛生微生物檢測，由于培養基的差異或者營養成分的缺失，往往不適合VBNC菌體細胞的增殖，從而無法計數檢測VBNC，增加了假陰性的幾率。圖1表明，熱或冷損傷菌體細胞在MF培養基上復蘇效果好于mEC+n培養基和FP培養基，尤其是高于GB 4789.36-2008規定培養基計數值的3個數量級，說明MF培養基成分能夠利于O157菌株的復蘇和增殖，促進損傷細胞的復蘇，特別是8h培養時間，遠遠低于GB常規檢測規定的時間，具有耗時短，增殖復蘇效果好的特點，適合快速檢測的前期培養和目的菌株的初分離。

2.2 MF培養基、mEC+n培養基和FP培養基對菌株生長影響

大腸埃希氏O157：H7標準菌株在3種培養基上生長速度存在差異（如圖2），盡管菌體在3種培養基上進入對數生長期的時間接近，但對數生長期的菌體生長速度各異，MF培養基、FP培養基均優于GB 4789.36-2008規定的mEC+n培養基，MF培養基生長速度最快，其倍增時間最短，尤其是對于冷損傷菌體（如圖3），表現出良好的修復和增殖功效，說明MF培養基組分適合大腸埃希氏菌O157：H7的生長，提供生長因子滿足其增殖的要求。

2.3 MF培養基、mEC+n培養基和FP培養基抑菌情況

特異性驗證結果表明（見表1），MF培養基、mEC+n培養基和FP培養基均能夠較好的抑制G+細菌，李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌在3種培養基上均檢測不到菌落的形成，說明培養基能夠有效抑制G+生長，減少了假陽性結果，提高了可信度。對于G-細菌，MF培養基均能抑制沙門氏菌、腸桿菌、假單胞菌和大腸桿菌，尤其對于大腸桿菌的抑制，說明MF培養基對于O157：H7特異性強，具有良好的選擇性。mEC+n培養基抑制效果相對較弱，不能夠很好地抑制大腸桿菌、腸桿菌和假單胞菌。3種培養基均能選擇性地培養O157：H7菌株，MF培養基特異性要優于其他2種培養基，mEC+n培養基選擇性最弱。食品衛生微生物檢測中選擇性培養基的特異性是檢測結果的基石，其選擇性高低決定著結果的可靠、可信程度，尤其快速檢驗逐漸將成為主流檢測方法，因此選擇性培養基特異性更加重要。實驗結果說明，MF培養基對于O157的檢測具有優良的特異性，其選擇性培養結果可信可靠，優于同類培養基產品。

3.討論

微生物污染是食品不合格的主要原因，也是造成食物中毒的主要病因，尤其細菌性污染往往是食源性疾病暴發的主要誘因。大腸桿菌O157：H7作為腸出血性大腸桿菌的一種，其往往侵染肉類及其制品，蔬菜及其制品中也時有報道。目前，常規方法檢測O157需要18～24初分離培養，生化鑒定、血清分型等步驟，往往耗時、費力，不利于食源性疾病病例的對癥治療，也不利于污染食品的后期處理，因此快速高效、特異可靠的快檢方法逐漸成為食品衛生檢驗微生物檢驗以及食源性疾病病因檢測的理想方法。實現快速檢測可以從三方面考慮[7]：其一，實驗設備簡化；其二，前處理方法簡單快速；其三，簡單、快速和準確地判定分析方法。由此可知，微生物檢測中提高選擇性培養基的特異性、快速性以及可信度，可以大大縮短檢測時間，提高檢測快速性。針對大腸桿菌O157的MicroFast?快速增菌培養基具有修復性好，特異性強以及適合O157生長的組分。驗證試驗證明MF培養基對O157具有良好的選擇特異性，選擇性優于FP培養基和mEC+n培養基，并且能夠有效的抑制部分G+、G-細菌。MicroFast?快速增菌培養基能夠8h內特異性初分離到O157，結合金標準卡法，完全能夠實現8h內檢測O157，遠遠低于GB 4789.36-2008的18～24h要求，其檢測限值（1cfu/25g）、快速性以及特異性可與生物芯片技術（8h）和Lateral Flow（8.4h）技術媲美，而檢測成本則較低。因此，MicroFast?快速增菌培養基及其快速檢測組合方法能夠滿足食品中O157快檢以及食源性疾病病因快速檢測的要求。

參考文獻：

[1]安靜.你吃的食品安全嗎？現階段的食品安全風險EB/OL：摘編自旭日干、龐國芳主編《中國食品安全現狀、問題及對策戰略研》. http：//blog.sciencenet.cn/blog-528739-957755. html，2016-1-6.

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[6] 郭瀟，雷曉凌.活的不可培養的細菌的研究進展[J]. 微生物學雜志，2010，30（3）：82-86.

[7] 王晶，王林，黃曉蓉，主編.食品安全快速檢測技術[M].北京：化學工業出版社，2005.