丁酸鹽二甲雙胍對乳腺癌干細胞的抗腫瘤活性及細胞毒性作用研究

王文蓉

（湖北省荊州市第三人民醫院，湖北荊州434000）

丁酸鹽二甲雙胍對乳腺癌干細胞的抗腫瘤活性及細胞毒性作用研究

王文蓉

（湖北省荊州市第三人民醫院，湖北荊州434000）

目的探討丁酸鹽二甲雙胍對乳腺癌干細胞抗腫瘤活性及細胞毒性作用。方法利用超低粘附懸浮培養法，從MDA-MB-231細胞中，獲得乳腺癌干細胞樣細胞。隨機將其分為對照組（化療藥物）和觀察組（丁酸鹽二甲雙胍聯合化療藥物），在缺氧狀態下分別處理細胞，通過流式細胞儀，檢測兩組細胞凋亡情況，利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測乳腺癌干細胞增殖活性。結果對照組丁酸鹽二甲雙胍能夠促進MDA-MB-231細胞凋亡，對ER陽性的MCF-7無明顯影響；觀察組丁酸鹽二甲雙胍能夠明顯增加乳腺癌干細胞對化療藥物的敏感性。結論丁酸鹽二甲雙胍可促進乳腺癌干細胞凋亡，增強乳腺癌干細胞對化療藥物的敏感性。

丁酸鹽二甲雙胍；乳腺癌干細胞；細胞凋亡；細胞增殖

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤，隨著人口年齡趨于老年化、飲食結構多樣化，發病率呈逐年增高、年輕化趨勢［1-2］。三陰性乳腺癌［雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體2（HER2）均陰性］具有較高的復發率、轉移率、死亡率，嚴重影響患者的生活質量，甚至危及生命［3］。研究證實［4］，內分泌激素干預治療能夠明顯防治乳腺癌，其中最常見的是特異性雌激素受體、芳香化酶類抑制劑類藥物治療。二甲雙胍作為臨床常用降糖藥物，在降糖的同時還能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，因此其可作為抗腫瘤藥物應用于臨床［5-6］。本研究中，利用超低粘附懸浮培養法，從MDAMB-231細胞中獲得乳腺癌干細胞樣細胞，探討丁酸鹽二甲雙胍對乳腺癌干細胞抗腫瘤活性及細胞毒性的增強作用，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

儀器及試藥：細胞凋亡試劑盒（上海七海復泰生物有限公司）；細胞增殖試劑盒（美國Promega公司）；流式細胞儀BD FACSCantoll（美國BD公司）。DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胰島素、化療藥物多柔比星（Doxorubicin）均購自Sigma公司；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；丁酸鹽二甲雙胍緩釋片（青島黃海制藥有限責任公司，國藥準字H20040154，規格為每片0.5 g）。

細胞系：乳腺癌三陰性MDA-MB-231細胞及MCF-7（ER陽性）細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心，在含有10%胎牛血清的DMEM，RPMI-1640培養基，37℃，5%CO2條件下培養。

1.2方法

乳腺癌干細胞培養：MDA-MB-231細胞經胰酶消化，制成單細胞懸液，接種于6孔超低粘附培養板，每孔約5 000個，再進行干細胞培養擴增處理。

流式細胞儀檢測乳腺癌干細胞的細胞凋亡：將乳腺癌干細胞接種于3.5 cm培養皿，每個皿約2×105個，常氧（21%O2）條件下，孵育48 h，嚴格按照Annexin V/PI雙染色試劑盒說明書，進行熒光染色處理，隨后根據流式細胞儀進行雙變量分析。

四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測乳腺癌干細胞的細胞增殖：將乳腺癌干細胞接種于96孔培養板，每孔約1×104個，于常氧狀態下孵育過夜，次日分別進行對照組（0.2 μmol/L阿霉素）和觀察組（5 mmol/L丁酸鹽二甲雙胍+0.2 μmol/L阿霉素）各處理組的細胞處理，各組16孔，再將培養板治愈缺氧條件下（1%O2），孵育11 d，嚴格按照細胞增殖試劑盒說明書，進行乳腺癌干細胞細胞增殖活性的檢測。

1.3統計學處理

采用SPSS 18.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差表示，多組間以方差分析處理，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1乳腺癌干細胞成功培養

從乳腺癌細胞MDA-MB-231中，利用超低粘附培養法，成功培養出乳腺癌干細胞，體外培養6 d左右，形成乳腺腫瘤球，見圖1。

2.2丁酸鹽二甲雙胍對乳腺癌干細胞凋亡的影響

經Annexin V/PI雙染色法檢測MDA-MB-321及MCF-7細胞在缺氧條件下處理48 h后凋亡情況，結果丁酸鹽二甲雙胍明顯促進乳腺癌干細胞凋亡，而丁酸鹽二甲雙胍對MCF-7細胞凋亡作用影響不大，見圖2。

2.3丁酸鹽二甲雙胍增強乳腺癌干細胞對化療藥物的敏感性

MDA-MB-231乳腺癌干細胞經兩組處理11 d后，MTT法檢測結果顯示，與對照組相比，觀察組丁酸鹽二甲雙胍能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞增殖（38.2%比83.4%），表明丁酸鹽二甲雙胍能夠增強MDA-MB-231乳腺癌干細胞對化療藥物的敏感性。

圖1　超低粘附培養法乳腺癌干細胞

圖2　Annexin V/PI雙染色法乳腺癌干細胞凋亡情況

3　討論

乳腺癌作為女性常見惡性腫瘤之一，也是女性病死率最高的腫瘤類型。有報道稱，乳腺癌死亡人數占女性惡性腫瘤死亡數的14%［7］。乳腺癌細胞在早期腫瘤細胞就可進入循環系統，并經血行淋巴結，轉移至遠處；化療藥物治療能夠殺滅腫瘤病灶，降低遠處轉移發生率，為手術治療創造良好機會［8-9］。近年來，乳腺癌治療手段得到不斷改進，新型治療藥物及治療方法也不斷更新，但乳腺癌細胞的轉移及進展仍無法得到有效控制。過去10余年，分子靶向治療成為某些腫瘤的一線治療方案，雖然治療初期能夠有效控制腫瘤細胞生長，但是多數進展性腫瘤患者不可避免地產生化療、放療及靶向治療的抗性，最終導致腫瘤的復發［10］。

乳腺癌干細胞不僅具有癌細胞的特征，還具有自我更新、多向分化、增生前潛能等普通干細胞特性。正常干細胞的自我更新、分化和增殖受調控機制的嚴格控制，維持體內各組織、器官的穩定性。而腫瘤干細胞具有惡性增殖能力，經過不同形式的自我更新式分裂，產生并擴增具有不同分化表型、獨特形態的異質性腫瘤細胞（包括腫瘤干細胞）。此外，腫瘤干細胞高表達的三磷酸腺苷（ATP）結合轉運蛋白，利用水解ATP能量，主動轉運方式將多種分子從細胞質內轉運到細胞外，從而賦予腫瘤干細胞抵抗藥物殺傷的能力［11］。乳腺癌干細胞是腫瘤耐藥性及腫瘤細胞復發的根源，因此，乳腺癌治療的理想效果應以根治乳腺癌干細胞為主［12］。傳統放化療不易殺死乳腺癌干細胞，而使其殘存下來，易引起腫瘤細胞的復發或轉移，故徹底治愈乳腺癌的關鍵在于靶向消除、殺滅乳腺癌干細胞。

二甲雙胍作為臨床治療2型糖尿病的常規藥物，通過選擇性作用于肝臟，提高肝臟對胰島素的敏感性，抑制葡萄糖的產生，增加肝外組織對葡萄糖的攝?。?3］。有研究證實，二甲雙胍還具有降低腫瘤危險，減少腫瘤患者死亡率的作用［14-15］。

目前，而乳腺癌干細胞對化療藥物耐藥性高、敏感性差是三陰性乳腺癌的治療效果較差的主要原因［16］。本研究結果顯示，對照組中，丁酸鹽二甲雙胍能夠促進MDA-MB-231細胞凋亡，顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖，明顯增加乳腺癌干細胞對化療藥物的敏感性?？梢?，丁酸鹽二甲雙胍能夠促進乳腺癌干細胞凋亡，增強乳腺癌干細胞對化療藥物的敏感性，從而增強化療藥物治療乳腺癌的療效。

綜上所述，乳腺癌干細胞的發現為乳腺癌發病機制的研究開辟了新的方向，隨著乳腺癌干細胞致病機制、生物學特征、基因調控機制等研究的不斷深入，乳腺癌的發生、發展，以及關鍵調控點的研究也日趨闡明，靶向乳腺癌干細胞治療方法也得到了進一步的推進，為徹底解決乳腺癌轉移及復發提供了新的空間。丁酸鹽二甲雙胍充分利用了乳腺癌干細胞的特性，可增強乳腺癌患者對化療藥物的敏感性，提高放化療治療的臨床療效，值得臨床推廣。

［1］唐志柳，白潔，顧麗娜，等.2000-2010年我國前列腺癌和乳腺癌流行狀況的系統性綜述［J］.中國腫瘤，2013，22（4）：22-23.

［2］Litzenburger BC，Brown PH.Advances in preventive therapy for estrogen receptor negative breast cancer［J］.Curr Breast Cancer Rep，2014，6（2）：96-109.

［3］黃遠麗，孫圣榮.二甲雙胍聯合DE-G方案治療表皮生長因子受體2陰性乳腺癌35例［J］.中國藥業，2015，24（7）：99-100.

［4］侯進，李汾，李新華，等.百合多糖1可增強二甲雙胍對乳腺癌細胞的抗增殖作用并促進其凋亡［J］.細胞與分子免疫學雜志，2016，32（6）：780-784.

［5］Wang Y，Wei J，Li L，et al.Combined use of metformin and everolimus is synergistic in the treatment of breast cancer cells［J］. Oncol Res，2015，22（4）：193-201.

［6］Walker EJ，Ko AH，Holly EA，et al.Metformin use among type 2 diabetics and risk of pancreatic cancer in a clinic-based casecontrol study［J］.Int J Cancer，2015，136（6）：E646-E653.

［7］胡楊麗，楊舉倫.乳腺癌干細胞的生物學特性與治療前景［J］.臨床與實驗病理學雜志，2014，30（3）：298-301.

［8］穆蘭，邢芳，肖盟，等.二甲雙胍與乳腺癌關系的研究進展［J］.中國腫瘤臨床，2014，41（21）：1 413-1 415.

［9］李璞玉，馮笑山.降糖藥二甲雙胍治療乳腺癌的研究進展［J］.河南科技大學學報（醫學版），2015，33（4）：311-314.

［10］崔暢暢，柯學，呂慧俠.腫瘤干細胞靶向治療研究進展［J］.藥學進展，2016，40（1）：20-29.

［11］劉明明，楊恭.乳腺癌干細胞的研究進展［J］.中國癌癥雜志，2013，23（8）：624-631.

［12］姚慧，鄧雪瑜，方秦，等.洛伐他汀對乳腺癌干細胞的體外化療增敏作用［J］.湖南師范大學學報（醫學版），2015，12（5）：1-3.

［13］Al Hilli MM，Bakkum-Gamez JN，Mariani A，et al.The effect of diabetes and metformin on clinical outcomes is negligible in risk-adjusted endometrial cancer cohorts［J］.Gynecol Oncol，2016，140（2）：270-276.

［14］馮鐸，陳天文，陶霖玉，等.二甲雙胍對人HER2陽性乳腺癌細胞增殖與凋亡的影響［J］.中國現代醫學雜志，2012，22（18）：37-40.

［15］陳旭，沈宇輝，張偉濱.二甲雙胍抗腫瘤效應及其機制的研究進展［J］.診斷學理論與實踐，2015，14（3）：270-274.

［16］謝錦華，劉地發.二甲雙胍聯合CEF方案與單純CEF方案在乳腺癌新輔助化療中的療效比較［J］.實用癌癥雜志，2011，26（1）：92-93.

The Enhancement of Anti-Tumor Activity and Cytotoxicity on Breast Cancer Stem Cells by M etformin Hydrochloride

Wang Wenrong
（Jingzhou Third People′s Hospital，Jingzhou，Hubei，China434000）

ObjectiveTo study the enhancement of anti-tumor activity and cytotoxicity of metformin hydrochloride on breast cancer stem cells.M ethodsThe breast cancer stem cells were obtained by ultra-low adherence suspension culture from MDA-MB-231 cells.The breast cancer stem cells were randomized into the control group（doxorubicin）and the observation group（metformin hydrochloride combined with doxorubicin）.The cells were controlled under hypoxia.The cell apoptosis in two groups was detected by flow cytometry.The proliferation of breast cancer stem cells was assayed by MTT measurement.ResultsIn the control group，the treatment of metformin hydrochloride could promote the cell apoptosis of MDA-MB-231 without obvious effect on ER-positive MCF-7；in the observation group，the treatment of metformin hydrochloride could significantly increase the sensitivity of breast cancer stem cells to chemotherapy drug.ConclusionMetformin hydrochloride can promote the apoptosis of breast cancer stem cells and increase the sensitivity of breast cancer stem cells to chemotherapy drug.

metformin hydrochloride；breast cancer stem cells；cell apoptosis；cell proliferation

R965；R977.1+5；R737.0

A

1006-4931（2016）17-0035-03

王文蓉（1979-），女，大學本科，主治醫師，研究方向為婦產科，（電子信箱）wangwenrong123ww@ sina.com。

（2016-04-25；

2016-05-13）