DKK1促進非小細胞肺癌線性程序性壞死和血管生成擬態形成*

姚伶俐張丹芳②趙秀蘭董學易劉芳林賢孫俊英鄭旭

·臨床研究與應用·

DKK1促進非小細胞肺癌線性程序性壞死和血管生成擬態形成*

姚伶俐①張丹芳①②趙秀蘭①董學易①劉芳①林賢①孫俊英①鄭旭①

目的：探討非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中DKK1影響線性程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）和血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）的機制。方法：收集人NSCLC標本173例，H&E染色檢測LPPCN，CD31/PAS雙染檢測VM，免疫組織化學檢測DKK1及相關蛋白表達，分析其臨床病理意義及相互關系，進而裸鼠H460-DKK1移植瘤體內驗證研究假設。結果：NSCLC中14.45%（25/173）存在VM，49.71%（86/173）具有LPPCN，LPPCN（+）組25.6%（22/ 86）形成VM，二者均與分化差、TNM分期晚、易復發轉移和預后差相關。VM（+）組和LPPCN（+）組DKK1均高表達，均與VE-cadherin、MMP-2、β-catenin核表達及Twist1正相關。H460-DKK1移植瘤模型證實DKK1促進VM和LPPCN及相關蛋白表達上調。結論：DKK1引起的β-catenin、Twist1表達上調可促進NSCLC中LPPCN和VM形成。

非小細胞肺癌 血管生成擬態 DKK1 上皮間充質轉化 線性程序性壞死

腫瘤生長和轉移依賴腫瘤血管生成，目前已知的腫瘤微循環模式包括內皮依賴性血管、腫瘤血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）和馬賽克血管［1-2］。VM是腫瘤細胞通過自身變形和與細胞外基質相互作用模仿內皮細胞圍成管腔樣結構，并與內皮依賴性血管連通，成為腫瘤的功能性血管，在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌和肺癌等10余種腫瘤內均發現VM存在［1，3-5］，存在VM的腫瘤惡性度明顯高于無VM的腫瘤［1］，常規的以血管內皮為靶點的抗血管生成藥物對存在VM的腫瘤療效不佳［1，6］。因此，研究VM形成的分子調控機制，尋找有效的治療靶點是改善具有VM腫瘤患者不良預后的關鍵。前期研究發現存在VM的腫瘤組織中可見一類特殊類型的壞死細胞，胞體縮小、染色質高度凝集、排列成線狀、表達凋亡相關基因。因此課題組將這類細胞死亡形式命名為“線形程序性壞死”（linearly patterned programmedcell necrosis，LPPCN）［7-8］。LPPCN走行與VM一致，提示LPPCN細胞死亡后形成的裂隙狀結構可成為VM的空間基礎，但具體塑型過程和分子機制尚不清楚。

經典Wnt通路即Wnt/β-catenin通路的異?；罨驯蛔C實與胃癌、乳腺癌、結腸癌及肺癌等多種腫瘤的發生發展密切相關［9］，前期研究發現Wnt拮抗劑Dickkopf（DKK）分泌蛋白家族成員DDK1通過促進上皮間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）促進VM形成［3］，且存在VM的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中均有LPPCN，因此假說DKK1是調控NSCLC LPPCN和VM形成的關鍵分子。本研究通過人體標本、細胞轉染和動物模型研究DKK1對NSCLC LPPCN和VM形成的調控作用。

1 材料與方法

1.1病例資料

收集1990年10月至2010年11月于天津醫科大學腫瘤醫院手術治療的非小細胞肺癌173例，回顧性分析臨床病理資料及腫瘤壞死面積等，隨訪截止至2013年5月1日。根據WHO（2015）肺癌診斷和TNM分期標準，復習切片并將其分為三類：鱗狀細胞癌、浸潤性腺癌和其它類型癌。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色及計數本研究兔、羊或小鼠源性多克隆一抗體包括CD31（Zymed，1A10）、DKK1（Santa，SC-25516）、E-cadherin（Santa，SC-7870）、MMP2（Zymed，CA-4001）、MMP9（Santa SC-6840）、Slug（LifespanLS-B3449）、Twist1（Santa，SC-15393）、VE-cadherin（Abcam，Ab33168）、vimentin（Epitomics，EPR3776）、β-catenin（Zymed，CAT-5H10）、MMP-2（Zymed，CA-4001）、MMP-9（Santa，SC-6840）和endomucin（eBioscience，lot：E028994），相應二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。按SP兩步法操作，石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫封閉30 min，微波修復抗原，血清封閉，一抗4℃過夜，次日二抗室溫孵育60 min，DAB顯色。蘇木素復染，樹膠封片。

人體標本免疫組織化學染色結果按Mattern積分法計數［10］：每例切片選擇5個高倍視野（×400），以陽性細胞數占視野中總細胞數的百分比評分：無陽性著色為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；陽性強度：無陽性為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細胞數和陽性強度乘積為最后得分，＞3分視為陽性表達。

1.2.2CD31/PAS雙重染色及結果判定采用CD31/ PAS雙重染色檢測VM，具體步驟如下：常規CD31免疫組織化學染色至DAB顯色，滴加1%過碘酸溶液中反應15 min，蒸餾水沖洗，滴加雪夫氏液，37℃避光孵育約20 min，蒸餾水沖洗3次，蘇木素復染，樹膠封片。

1.2.3細胞培養、質粒構建和細胞轉染人NSCLC細胞株H460細胞購自中國醫學科學院基礎醫學院細胞資源中心，采用RPMI 1640培養基加10%胎牛血清（FBS），置于37℃，5%CO2培養箱中培養。pcDNA3.1-DKK1過表達質粒購自上海吉凱基因公司（forward primer：5'-CTAGCTAGCACATGATGGCTCT GG-3'，reverse primer：5'-GGAATTCGTGTCTCTGAC AAGTGTG-3'）。常規轉化感受態大腸桿菌，經氨芐青霉素抗性篩選單克隆后，將質粒進行大量提取，PEI轉染6 h，細胞轉染48 h后加入G418篩選。

1.2.4裸鼠移植瘤模型選取20只3～4周齡雄性BALB/c裸鼠分為對照組和實驗組，每組10只，將穩定轉染DKK1質粒的H460細胞及對照細胞制備單細胞懸液，接種至小鼠右側腋窩皮下，1×107個細胞/只小鼠。每天觀察小鼠情況，測量移植瘤體積（體積=長徑×短徑2/2），21天后處死小鼠，收集腫瘤組織，制備石蠟包埋切片。

1.3統計學分析

數據均用SPSS 18.0軟件進行統計分析。各組間的差異采用χ2檢驗及Spearman相關分析，采用Kaplan-Meier法生存分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1VM和LPPCN的臨床病理意義

CD31/PAS雙重染色顯示在173例NSCLC組織中14.45%（25/173，圖1）存在VM，VM陽性組和VM陰性組腫瘤病理類型、分化程度、TNM分期及復發或轉移存在差異。存在VM的腫瘤病理類型多為鱗癌和浸潤性腺癌，分化程度低，TNM分期晚，易復發或轉移（表1）。173例NSCLC組織中49.71%（86/173，圖1）具有LPPCN，LPPCN細胞呈梭形，胞漿濃縮，胞核深染，呈線狀、條帶狀、網絡狀分布，走行在血管或VM周邊。LPPCN陽性組腫瘤多為中央型，分化程度低，TNM分期晚，易復發或轉移。Kaplan-Meier生存分析顯示VM陽性組較VM陰性組患者生存時間短（χ2= 6.178，P=0.013），LPPCN陽性組較陰性組患者預后生存差（χ2=2.288，P=0.040）。

2.2VM、LPPCN和腫瘤壞死面積之間的相關關系

LPPCN陽性組腫瘤約25.6%（22/86）可形成VM，而不存在LPPCN的腫瘤VM陽性率僅3.4%（3/87）（表1），進一步分析顯示LPPCN陽性組內存在VM的腫瘤壞死面積較VM陰性者?。é?=4.414，P=0.042，圖1），而LPPCN陰性組無顯著差異（χ2=1.253，P=0.263）。

圖1　非小細胞肺癌VM陽性組和VM陰性組VM（黑色箭頭）和LPPCN比較（Bar=100微米）Figure 1Morphological characteristics of VM（black arrow）and LPPCN of the VM-positive group and VM-negative group（Bar=100 μm）

2.3NSCLC DKK1表達與VM、LPPCN及其相關蛋白之間的相關關系

本研究中173例NSCLC DKK1陽性率為68.21%（118/173），VM陽性組腫瘤DKK1陽性率88.0%，顯著高于VM陰性組，LPPCN陽性組約80.2%的腫瘤表達DKK1，LPPCN陰性組DKK1陽性率為56.3%，兩組差異具有統計學意義（表2）。Spearman相關分析表明NSCLC VM形成與LPPCN和DKK1呈正相關（r=0.281，0.175，P=0.000，0.022），DKK1高表達與β-catenin核表達、VE-Cadherin、Twist和Slug呈正相關（r=0.207、0.364、0.274、0.235，P= 0.006、0.000、0.000、0.002）。

2.4DKK1高表達促進人NSCLC裸鼠移植瘤VM和LPPCN形成

本研究建立了H460-DKK1裸鼠移植瘤模型，觀察DKK1對H460細胞移植瘤生長及VM和LPPCN形成影響。H460-DKK1組較對照組細胞成瘤能力強，移植瘤生長速度快，處死小鼠時H460-DKK1組腫瘤平均體積為（1.74±0.251）cm3，對照組腫瘤體積僅為（0.84±0.16）cm3（t=2.21，P＜0.05）。Endomuncin/PAS雙染結果發現H460-DKK1組移植瘤VM數目較對照組多，形成VM的能力較強，內皮依賴性血管數目較少（圖2）。同時對LPPCN計數顯示H460-DKK1組移植瘤LPPCN數目較對照組多，結果與VM形成趨勢一致。免疫組織化學染色驗證實驗組腫瘤顯著高表達DKK1（圖3）。H460-DKK1組腫瘤中間葉性標記物VE-Cadherin和Vimentin，EMT調控因子Twist和Slug表達顯著增高，而且Wnt通路的重要分子β-catenin核表達也顯著增多（圖3）。

表1　NSCLC中VM和LPPCN與臨床病理因素之間的關系Table 1The relationship between VM，LPPCN and clinicopathological parameters in non-small cell lung cancer

表1　NSCLC中VM和LPPCN與臨床病理因素之間的關系（續表1）Table 1The relationship between VM，LPPCN and clinicopathological parameters in non-small cell lung cancer

表2　不同DKK1水平的NSCLC VM、LPPCN及其相關蛋白之間的差異（續表2）Table 2The difference of VM，LPPCN and VM-associated proteins expression in the DKK1+and the DKK-groups in non-small cell lung cancer

圖2　DKK1高表達促進人NSCLC裸鼠移植瘤VM和LPPCN形成P＜0.05Figure 2DKK1 overexpression promotes VM and LPPCN formation in non-small cell lung cancer H460 of the nude mice model P＜0.05

?圖3　H460-DKK1移植瘤與對照組移植瘤DKK1、MMP2、MMP9、VE-cadherin、Vimentin、β-catenin、Twist1和Slug蛋白表達差異（Bar=100微米）Figure 3The different expression of DKK1，MMP2，MMP9，VE-cadherin，Vimentin，β-catenin，Twist1，and Slug between the H460-DKK1 group and the control.（Bar=100 μm）

3 討論

LPPCN是孫保存教授發現并命名的黑色素瘤中特殊的腫瘤細胞死亡形式，本研究證實在NSCLC中也存在LPPCN現象，它們與內皮依賴性血管或VM走行一致，人體標本分析也顯示存在LPPCN的腫瘤VM陽性率更高，LPCCN與VM呈正相關，LPPCN陽性組腫瘤生物學行為與VM陽性組相近，說明存在LPPCN的腫瘤更容易形成VM，再次證實了本課題組的研究假設，線形排布LPPCN細胞被清除降解，局部形成管腔樣結構，與血管連通后形成VM［11］。本研究還發現黑色素瘤中LPPCN陽性率與VM陽性率相近［7］，而NSCLCLPPCN陽性率為49.71%，VM陽性率僅為14.45%，具有LPPCN的NSCLC約25.59%可形成VM，形成VM者腫瘤壞死面積較小，未形成VM的腫瘤壞死面積較大。上述結果提示VM不是LPPCN的唯一結局，LPPCN形成VM后，血液流入缺氧狀態緩解，腫瘤細胞存活；未形成VM者持續缺氧造成腫瘤組織大面積壞死。

腫瘤組織內的高壓微環境和缺氧是VM形成的主要驅動因素［12］，它們二者可能也是LPPCN的直接誘因［13-14］。為進一步研究調控NSCLC VM和LPPCN形成的分子機制，免疫組織化學染色發現VM陽性組腫瘤和LPPCN陽性組DKK1表達水平均顯著增強，上調DKK1的NSCLC移植瘤VM和LPPCN形成能力也顯著提高，提示DKK1參與了NSCLC中VM和LPPCN形成過程。EMT和細胞外基質重塑是VM形成過程中的重要環節，Twist1、Slug等多種EMT調控因子均可促進腫瘤細胞發生塑型［15-17］，基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9通過誘導細胞外基質重塑促進VM形成。本研究發現NSCLC DKK1與Twist1、Slug及VM相關分子表達呈正相關。因此本研究推測DKK1一方面能夠促進部分腫瘤細胞發生LPPCN為VM形成提供空間，另一方面還能夠促進腫瘤細胞高表達Twist1、Slug、MMP2等分子，調控細胞外基質重塑、癌細胞EMT等，共同參與調控VM形成。

DKK1是經典Wnt通路的拮抗劑［18］，它與Wnt信號的共受體LRP5/6胞外結構域結合，從而阻止β-catenin解離入核，本研究報道DKK1在結腸癌中表達下調，并可抑制結腸癌細胞發生EMT和VM形成［19］，而本研究發現DKK1可促進NSCLC VM和LPPCN形成，其經過也與EMT相關，提示DKK1可能在不同腫瘤的發生發展過程中經由不同的分子信號轉導通路發揮各異的作用。同時DKK1可抑制Wnt/β-catenin經典通路［20］，DKK1還參與Wnt非經典信號途徑，DKK1可阻滯Wnt3a介導的C2C12細胞的NF-κB配體減少、可直接抑制NF-κB受體激活因子配體RANKL的表達、可調節β-catenin和RUNX2、可調控p-RB及AKT/NF-kB等［21-22］。DKK1也是β-catenin下游通路的靶點，如食管腺癌中β-catenin入核后與轉錄調控因子TCF/LEF-1結合可上調DKK1表達［23］。本研究發現DKK1表達與β-catenin的核定位呈正相關，Chen等［24］報道DKK1可以促進肝細胞肝癌β-catenin轉錄和翻譯，促進β-catenin下游基因MMP7的表達從而導致肝癌細胞侵襲和遷移。本研究推測NSCLC中Wnt經典通路被激活后β-catenin由胞漿入核，可促進其靶基因DKK1高表達，DKK1還可反饋性促進β-catenin活性。本研究發現β-catenin下游基因cmyc上調可促進黑色素瘤表達snail/bax促進LPPCN和VM形成［25］。

本研究在NSCLC中觀察了VM是LPPCN的結局之一，LPPCN形成VM之后，血液流入缺氧狀態緩解，腫瘤細胞存活；未形成VM者導致持續缺氧，造成腫瘤細胞發生大面積壞死。Wnt信號轉導通路分子DKK1促進NSCLC LPPCN和VM形成的機制與DKK1表達上調引起的β-catenin、Twist1及VM調控分子表達有關，促進EMT和細胞外基質重塑，進而促進VM形成，但分子之間的調控關系尚待進一步研究。

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（2016-07-10收稿）

（2016-08-27修回）

（編輯：楊紅欣校對：武斌）

姚伶俐專業方向為病理學基礎研究。

E-mail：ahmuyao@126.com

DKK1 promotes linearly patterned programmed cell necrosis and vasculogenic mimicry in non-small cell lung cancer

Lingli YAO1，Danfang ZHANG1，2，Xiulan ZHAO1，2，Xueyi DONG1，Fang LIU1，Xian LIN1，Junying SUN1，Xu ZHENG1
1Correspondence to:Danfang ZHANG；E-mail:danfangzhang@hotmail.com

Department of Pathology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2Department of Pathology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

Objective:To investigate the effect of DKK1 on linearly patterned programmed cell necrosis（LPPCN）and vasculogenic mimicry（VM）and the related molecular mechanism in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods:A total of 173 human NSCLC specimens were collected to detect LPPCN by H&E staining，detect VM with CD31/PAS double staining，and investigate DKK1 and related protein expression by immunohistochemistry.The clinical pathological significance of LPPCN，VM，and DKK1 and the correlation of them were analyzed.Human NSCLC H460-DKK1 cells were engrafed in nude mice to evaluate the influence of DKK1 up-regulation on VM and LPPCN in vivo.Results:Approximately，14.45%（25/173）of NSCLC had VM and 49.71%（86/173）had LPPCN.25.6%（22/86）of NSCLC cases in LPPCN-positive group formed VM.Both of VM and LPPCN were all correlated with poor differentiation，late TNM stage，easy recurrence and metastasis and poor prognosis in NSCLC.DKK1 expression in the VM-positive group and the LPPCN-positive group was higher than that in the VM-negative group and the LPPCN-negative group，respectively.DKK1，LPPCN，and VM were positively correlated with VE-cadherin，MMP-2，β-catenin nuclear expression and Twist1.H460-DKK1 transplantation tumor model confirmed that DKK1 promotes the expression of VM and LPPCN and related proteins in NSCLC.Conclusion:The increase of the β-catenin and Twist1 expression induced by DKK1 may promote the formation of LPPCN and VM in NSCLC.

non-small cell lung cancer，vasculogenic mimicry，DKK1，epithelial mesenchymal transition，linearly patterned programmed cell necrosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.18.807

①天津醫科大學病理教研室（天津市300070）；②天津醫科大學總醫院

*本文課題受國家自然科學基金重點項目（編號：81230050）和國家自然科學基金面上項目（編號：81572872）資助

張丹芳danfangzhang@hotmail.com