產脂肪酶菌株的篩選鑒定及產酶條件優化

胡珺，杜新凱，王常高，林建國，杜馨，蔡俊*

（湖北工業大學，發酵工程教育部重點實驗室工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢430068）

產脂肪酶菌株的篩選鑒定及產酶條件優化

胡珺，杜新凱，王常高，林建國，杜馨，蔡俊*

（湖北工業大學，發酵工程教育部重點實驗室工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢430068）

以橄欖油為唯一碳源，采用油脂同化平板從食堂廢棄物中篩選出一株產脂肪酶菌株HFE722。通過測定與分析該菌株16SrRNA基因序列，鑒定該菌株為芽孢桿菌（Bacillussp.）。菌株HFE722在初始條件（發酵溫度30℃，接種量為1%，自然pH，裝液量為100mL/250mL，搖床轉速為200 r/min）下培養36 h，測得發酵液上清液脂肪酶酶活為2.17 U/mL。優化后所得菌株HFE722產酶的最適發酵條件為：發酵溫度30℃，發酵周期為36 h，接種量為1%（V/V），初始pH7.0，裝液量為50 mL/250 mL，搖床轉速為160 r/min。在最佳發酵條件下，發酵液上清液酶活可達到5.8 U/mL，酶活較優化前提高了167.28%。

脂肪酶；篩選；鑒定；發酵條件優化

脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，是目前緊俏的生物催化劑之一，一般用于催化油脂的水解和合成反應。脂肪酶的催化活性主要在于它的蛋白質結構，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯鍵的水解，水解生成甘油一酯、二酯或者直接生成甘油和脂肪酸[1]。

微生物來源（包括細菌、霉菌和酵母）的脂肪酶含量最為豐富[2]。由于微生物種類多、繁殖快，易發生遺傳變異，產生的脂肪酶具有比動植物脂肪酶作用更廣的pH值、反應溫度范圍以及底物專一性[3]；而且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業化大生產和樣品提純，因此，微生物脂肪酶是工業用脂肪酶的重要來源，是生物技術和有機化學應用中使用最為廣泛的酶類之一[4-5]。

目前，已知的大約有2%的微生物產脂肪酶。自然界中的微生物大約有65個屬可產脂肪酶，其中放線菌4個屬，細菌28個屬，酵母10個屬，其他真菌23個屬，但事實上，脂肪酶在微生物群落的分布已遠遠超過了這個數字[6]，且不同微生物來源的脂肪酶其組成成分、理化特性各不相同。產微生物脂肪酶菌種的研究主要集中在根酶[7]、黑曲霉[8]、白地霉[9]、青霉[10]、木霉[11]、毛霉、洋蔥伯克霍爾德菌[12]、枯草芽抱桿菌[13]、大腸桿菌工程菌[14]、無色桿菌、酵母[15]、小球菌、發光桿菌[16]、非極端細菌[17]、假絲酵母[18]和假單胞菌[19]等具有工業應用價值的菌株和應用在臨床醫學上的金黃色葡萄球菌、鉤狀螺旋體、粉刺棒狀桿菌。

本研究從食堂廢棄物中篩選到一株產脂肪酶的菌株，對其進行鑒定，并對其培養條件進行了優化，得到最適產酶條件。開展這方面的研究工作，對于開發新酶種和脂肪酶擴大應用領域，具有十分現實的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

橄欖油乳化液：稱取聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）40.0 g，加水800 mL，在沸水浴中加熱，攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1 000 mL。用干凈的雙層紗布過濾，取濾液備用。量取上述濾液150 mL，加橄欖油50 mL，用高速勻漿機處理6 min（分兩次處理，間隔5 min，每次處理3 min），即得乳白色橄欖油乳化液。該溶液現用現配。實驗中所用試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

富集培養基：K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，（NH4）2SO42g，橄欖油乳化液120mL，水1000mL；

油脂同化平板[20]：K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，（NH4）2SO42 g，橄欖油乳化液120 mL，瓊脂20 g，溴甲酚紫4 mL，水1 000 mL；

三丁酸甘油酯平板[21]：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，三丁酸甘油酯2 mL，瓊脂粉20 g，水1 000 mL；

LB斜面培養基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉20 g，水1000 mL；

種子培養基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO45 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨25g，橄欖油10mL，水1000mL；

發酵培養基：葡萄糖5 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨20g，橄欖油10mL，水1000mL。

1.2 儀器與設備

PHS-25pH計：上海雷磁；3K15冷凍離心機：德國Sigma公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；AR1140型電子分析天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZSD-1270全自動生化培養箱、ZHWY系列雙層恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種初篩

取5 g樣品于100 mL生理鹽水中，充分混勻后取1 mL接種于100 mL富集培養基中，30℃、200 r/min培養4 d。取富集后的菌懸液0.5 mL做適當的梯度稀釋，涂布于油脂同化平板上，30℃培養3 d。挑取能使平板變黃的菌落點樣于三丁酸甘油酯平板上，30℃培養2 d。以菌落直徑與水解圈直徑的比值作為初篩依據，將比值較大的菌落保存于LB斜面，以便復篩測酶活。

1.3.2 復篩

將上述所得到的菌落接種于種子培養基中，30℃、200 r/min培養12 h，然后將液體種子1 mL接種于發酵培養基中，30℃、200 r/min培養36 h。取發酵液8 000 r/min離心10 min，吸取上清液作為粗酶液，采用GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中所述的酸堿滴定法測其脂肪酶酶活，篩選出脂肪酶酶活較高的菌株。脂肪酶酶活定義為：1 mL液體酶，在一定溫度和pH條件下，1 min水解底物產生1 μmol可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.3 菌種的鑒定與保藏

菌株鑒定和保藏由中國典型培養物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）執行。鑒定內容包括菌株16S rRNA基因序列的測定與分析（如圖1所示）和微生物菌株的分類地位。菌株HFE722已于2015年12月10日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2015735。

圖1 HFE722菌株16S rRNA基因序列Fig.1 Gene sequence of 16S rRNA of strain HFE722

1.3.4 發酵條件優化

（1）發酵周期的優選試驗

在發酵溫度30℃、接種量1.0%、自然pH、裝液量100 mL/250mL和搖瓶轉速200 r/min條件下，每隔6 h測一次酶活，考察發酵周期對HFE722產脂肪酶的影響。

（2）發酵溫度的優選試驗

在發酵周期36 h、接種量1.0%、自然pH、裝液量100 mL/250 mL和搖瓶轉速200 r/min條件下，分別在26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃和38℃發酵培養后測定酶活，考察發酵溫度對菌株產脂肪酶的影響。

（3）接種量的優選試驗

在發酵溫度30℃、發酵周期36 h、自然pH、裝液量100 mL/250 mL和搖瓶轉速200 r/min條件下，調整接種量（V/V）分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，考察接種量對菌株產脂肪酶的影響。

（4）初始pH值的優選試驗

在發酵溫度30℃、接種量1.0%、發酵周期36 h、裝液量100 mL/250 mL和搖瓶轉速200 r/min條件下，調整初始pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，考察初始pH值對菌株產脂肪酶的影響。

（5）裝液量的優選試驗

在發酵溫度30℃、接種量1.0%、pH 7.0、發酵周期36 h和搖瓶轉速200 r/min條件下，采用250 mL搖瓶裝液，搖瓶裝液量分別為25 mL、50 mL、75 mL、100 mL和125 mL，考察裝液量對菌株產脂肪酶的影響。

（6）搖瓶轉速的優選試驗

在發酵溫度30℃、接種量1.0%、pH 7.0、裝液量50 mL/250 mL和發酵周期36 h條件下，搖瓶轉速分別為120r/min、140r/min、160 r/min、180 r/min和200 r/min，考察搖瓶轉速對產脂肪酶的影響。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

利用油脂同化平板初篩出能產脂肪酶的61株菌株，然后點樣于三丁酸甘油酯平板（如圖2所示），將菌落直徑與水解圈直徑之比大的挑出來檢測酶活，結果如表1所示，菌株HFE722酶活最高為2.17 U/mL，將菌株HFE722稀釋涂布，分離純化確保其為單菌落后，保存于LB斜面。

圖2 產脂肪酶菌株在三丁酸甘油酯平板上形成的水解圈Fig.2 Hydrolyzation circle performed by the lipase-producing strains on tributyrin plate

表1 不同菌株的脂肪酶酶活Table 1 Lipase activity of different strains

2.2 菌種鑒定

對菌株HFE722的16S rRNA基因序列進行測定后經Blast比對部分結果如表2所示，菌株HFE722的系統發育樹如圖3所示。結果表明，菌株HFE722的基因序列與Bacillus siamensis、Bacillus vanillea、Bacillus methylotrophicus相似度較高，但還不能準確鑒定到種，由此鑒定菌株HFE722為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 HFE722菌株16S rRNA基因序列部分BLAST結果Table 2 Part BLAST consequence of 16S rRNA gene sequence of strain HFE722

圖3 菌株HFE722的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HFE722

2.3 發酵條件優化

2.3.1 發酵周期的優選試驗

圖4 發酵時間對脂肪酶酶活的影響Fig.4 Effect of fermentation time on lipase activity

發酵時間對產酶的影響（圖4）可知，隨著發酵時間的延長，脂肪酶酶活逐漸升高，當發酵時間為36 h時，脂肪酶酶活最高為4.7 U/mL。隨著時間的繼續增加，酶活呈下降趨勢，可能是因為后期營養不足，菌體自溶導致的。故最佳發酵時間為36 h。

2.3.2 發酵溫度的優選試驗

圖5 發酵溫度對脂肪酶酶活的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on lipase activity

由圖5可知，從26℃開始，隨著溫度的升高酶活逐漸升高，可能是因為溫度升高，菌株生長和代謝加快，有利于酶的產生。當溫度為30℃時，酶活最高為5.2 U/mL。而30℃過后，隨著溫度升高酶活逐漸降低，可能是因為過高的溫度不利于菌體的生長，菌株為了能更好的在高溫條件下生存，改變了代謝途徑，從而脂肪酶酶活也受到影響。故最佳發酵溫度為30℃。

2.3.3 接種量的優選試驗

圖6 接種量對脂肪酶酶活的影響Fig.6 Effect of inoculum on lipase activity

由圖6可知，接種量為0.5%時酶活較低，當接種量為1.0%（V/V）時，酶活最高為4.3 U/mL。隨著接種量升高，酶活反而下降，可能是因為較大的接種量使得微生物生長過快，從而培養基營養消耗過快，溶氧下降，不利于后期產酶。故最佳接種量為1.0%。

2.3.4 初始pH值的優選試驗

由圖7可知，當初始pH在4.5～7.0時，隨著初始pH升高酶活逐漸增加。當初始pH為7.0時，酶活最高為4.8 U/mL。隨著初始pH的繼續升高，酶活顯著下降，說明菌株HFE722在中性條件下更易產脂肪酶，過酸或過堿的環境都對菌株代謝有一定的影響，從而影響了脂肪酶的產量。故最佳初始pH值為7.0。

圖7 初始pH對脂肪酶酶活的影響Fig.7 Effect of initial pH on lipase activity

2.3.5 裝液量的優選試驗

圖8 裝液量對脂肪酶酶活的影響Fig.8 Effect of loading volume on lipase activity

由圖8可知，當裝液量為50 mL/250 mL時，酶活最高為5.8 U/mL，此時發酵培養基中的溶氧量適合菌體生長和代謝產酶。隨著裝液量的逐漸增加，酶活呈下降趨勢，說明是由于發酵體系溶氧不足，菌體生長與代謝產酶失去平衡，從而代謝產酶過程受到抑制。故最佳裝液量為50 mL/250 mL。

2.3.6 搖瓶轉速的優選試驗

圖9 搖床轉速對脂肪酶酶活的影響Fig.9 Effect of rotating speed on lipase activity

由圖9可知，搖床轉速在120～160 r/min時，隨著搖床轉速的升高酶活逐漸增加，當搖床轉速為160 r/min時，酶活最高為5.2 U/mL。隨著搖床轉速的繼續增加，酶活變化很小，從節約成本和簡化工藝條件著手，選擇160 r/min作為最佳的搖床轉速。

2.4 驗證試驗

在上述優化下得到的最佳發酵條件為發酵周期36 h，發酵溫度30℃，接種量1%（V/V），初始pH值7.0，裝液量50 mL/250 mL，搖床轉速160 r/min。按此最佳發酵工藝條件發酵驗證3批，每批次3次重復，測得菌株HFE722的脂肪酶活力平均值為5.8 U/mL。驗證結果與優化試驗結果一致，說明工藝穩定可行。

3 結論

本文以橄欖油為唯一碳源篩選到一株產脂肪酶酶活較高的菌株HFE722，酶活為2.17U/mL。通過對菌株HFE722進行菌落形態特征、顯微形態結構觀察和16S rRNA基因序列的測定與分析，確定該菌株HFE722為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。通過發酵條件優化，確定了該菌株的最佳產酶條件：發酵周期36 h，發酵溫度30℃，接種量1%（V/V），初始pH值7.0，裝液量50 mL/250 mL，搖床轉速160 r/min。優化后酶活為5.8 U/mL，較優化前提高了167.28%。

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Screening and identification of lipase-producing strains and optimization of fermentation conditions

HU Jun,DU Xinkai,WANG Changgao,LIN Jianguo,DU Xin,CAI Jun*
(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Using olive oil as unique carbon source,a lipase-producing strain HFE722 was isolated from the waste of canteen by screening plates. Through 16S rRNA gene sequence determination and analysis,results showed that strain HFE722 was identified as aBacillussp.Strain HFE722 was incubated for 36 h in the initial fermentation condition(fermentation temperature 30℃,inoculum 1%,natural pH,loading volume 100 ml/250 ml, shaking speed 200 r/min),the lipase activity of the fermentation broth was 2.17 U/ml.Single-factor method was used for optimizing the fermentation conditions,and then the optimum lipase production conditions were determined as follows:fermentation temperature 30℃,time 36 h,inoculum 1% (v/v),initial medium pH 7.0,loading volume 50 ml/250 ml,and shaking speed 160 r/min.Under these fermentation conditions,the lipase activity of fermentation broth of strain HFE722 reached 5.8 U/ml,which was 167.28%higher than that of before optimization.

lipase;screening;identification;fermentation conditions optimization

Q815

0254-5071（2016）11-0039-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.008

2016-08-13

國家自然科學基金（31401807）

胡珺（1988-），男，碩士研究生，研究方向為發酵過程優化與放大。

*通訊作者：蔡?。?968-），男，教授，博士，研究方向為微生物發酵工程。