廣東省59例大前庭水管綜合征患者SLC26A4基因突變及表型分析*

朱美嬋周楓王蒙林穎王興君于鋒王海濤黃利芬梁子健

廣東省59例大前庭水管綜合征患者SLC26A4基因突變及表型分析*

朱美嬋1周楓1王蒙1林穎1王興君1于鋒1王海濤1黃利芬1梁子健1

目的 探討廣東省大前庭水管綜合征（enlargement of vestibular aqueduct syndrome，EVAS）患者SLC26A4基因位點突變及相關聽力表型，為研究EVAS發病機制提供參考。方法 采用基因芯片法對59例EVAS患兒進行SLC26A4基因IVS7－2A＞G：2168A＞G位點檢測，并行顳骨CT影像學檢查。結果 59例EVAS患者中21例（35.59%）為SLC26A4雙等位基因（純合或復合雜合）突變，其中16例為IVS7－2A＞G純合突變，2例為2168A＞G純合突變，3例為IVS7－2A＞G、2168A＞G復合雜合突變，這21例CT均顯示為雙側前庭水管擴大或其他內耳畸形；38例為SLC26A4單等位基因突變，其中31例為IVS7－2A＞G雜合突變，7例為2168A＞G雜合突變，這38例中4例為前庭水管擴大伴Mondini畸形，2例表型正常，其余均為雙側前庭水管擴大。59例患兒均表現為重度－極重度聾。結論 本組EVAS患者中SLC26A4基因IVS7－2A＞G位點的突變發生率最高，其次為2168A＞G；均表現為雙耳重度或極重度感音神經性聽力損失。

SLC26A4基因； 大前庭水管綜合征； 內耳畸形； 表型

SLC26A4基因突變導致的大前庭水管綜合征（enlargement of vestibular aqueduct syndrome，EVAS）是引起感音神經聾的常見遺傳學病因之一［1］，而大前庭導水管綜合征以前庭水管擴大伴感音神經性聽力損失為主要特征，是遺傳性聾的第2大病因［2］，該疾病表現為隱性遺傳，主要致病基因為SLC26A4［3］。研究表明，SLC26A4基因突變在不同地域和民族中具有迥異的基因圖譜，在歐美EVAS患者中，50%不能發現SLC26A4基因突變［4，5］，但中國EVAS患者SLC26A4基因突變發生率明顯高于西方人群［6］。本研究擬通過DNA分子檢測手段，對廣東地區59例EVAS患者進行SLC26A4基因突變位點分析，以明確該地區EVAS患者中SLC26A4基因突變的高發位點，為EVAS耳聾的早期發現、診斷和防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取廣東地區（包括廣州、中山、肇慶、珠海等地）聾校及語訓中心感音神經性聽力損失（SNHL）患者507例，男281例，女226例，年齡7～18歲，中位數年齡為13歲，已剔除全身器質性疾病或合并其他遺傳疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 病史資料采集 由學生家長填寫遺傳性聾基因檢測登記表，以獲取耳聾的相關信息，包括患者的一般信息、家族史、個人史（遺傳性疾病史、耳毒性藥物應用情況、頭部外傷史等）、耳聾發病年齡、患者母孕期情況等。對受檢者進行詳細的病史調查及體格檢查，以排除其他致病因素和綜合征型聾。

1.2.2 DNA提取 患者在簽署知情同意書后，抽取外周靜脈血2 ml，3.2%檸檬酸鈉抗凝，無菌4℃保存待檢。采用天根生化科技有限公司生產的血液基因組DNA提取系統（非離心柱型）（貨號：DT319－02），晶芯Bio Mix－er TMII芯片雜交儀、晶芯SlideWasher TM芯片洗干儀、晶芯LuxScan TM10K－B微陣列芯片掃描儀由北京博奧生物工程有限公司提供。從所有患者外周血中提取基因組DNA，用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，其余保存于－70℃冰箱備用。

1.2.3 SLC26A4基因芯片檢測方法 通過以人基因組DNA為模板，采用帶有Tag標簽序列的基因位點特異性引物對相關基因位點所在的基因片段進行擴增和熒光標記，然后與能夠識別相應標簽序列的通用基因芯片進行雜交。使用LuxS-can TM10K－B微陣列芯片掃描儀和相應的遺傳性耳聾基因檢測芯片判別系統進行SLC26A4基因IVS7－2A＞G、2168A＞G位點的檢測，操作按試劑盒說明書步驟進行。

1.3 顳骨CT掃描及前庭水管擴大診斷標準 被檢出SLC26A4基因突變的59例患者均進行高分辨率顳骨CT掃描，前庭水管擴大的診斷標準為：前庭水管外口至半規管總腳中點直徑≥1.5 mm。

1.4 聽力學檢查 被檢出的59例患者均進行純音聽閾測試，對于不能很好配合純音測聽的患者給予聲導抗和聽性腦干反應（ABR）檢測，依據歐洲工作組倡導的遺傳性聾的分級標準，將聽力損失程度分為輕度（20～40 d B HL）、中度（41～70 d B HL）、重度（71～95 dB HL）及極重度（＞95 dB HL）［7］。

1.5 統計學方法 使用SPSS 20.0統計學軟件，分別對SLC26A4突變患兒的聽力檢測結果、發病年齡、前庭水管外口至半規管總腳中點直徑進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

507例受檢的NSHL患者中，59例（11.64%，59／507）攜帶SLC26A4基因的熱點突變，其中，21例（35.59%，21／59）為雙等位基因（純合或復合雜合）突變，其中16例為IVS7－2A＞G純合突變、2例為2168A＞G純合突變及3例為IVS7－2A＞G、2168A＞G復合雜合突變，這21例患兒CT結果顯示為雙側前庭水管擴大或其他內耳畸形。38例（64.41%，38／59）為單等位基因突變，其中31例為IVS7－2A＞G雜合突變、7例為2168A＞G雜合突變，這38例中4例為前庭水管擴大伴Mondini畸形，2例表型正常，其余均為雙側前庭水管擴大。59例患兒的基因突變及表型見表1。

21例雙等位基因突變（純合或復合雜合，包括IVS7－2A＞G純合突變，IVS7－2A＞G、2168A＞G復合雜合突變，2168A＞G純合突變）患者的純音聽閾（94.67±7.21 d B HL）與單等位基因突變（包括IVS7－2A＞G雜合突變、2168A＞G雜合突變）患者的純音聽閾（92.63±14.95 d B HL）差異無統計學意義（P＞0.05）?；蛲蛔儥z測結果及對應的顳骨高分辨CT掃描結果見圖1～8。

表1 59例SLC26A4基因突變患者基因型及相關聽力表型（±s）

表1 59例SLC26A4基因突變患者基因型及相關聽力表型（±s）

突變分類例數（例，%）檢測年齡（歲）發病年齡（歲）前庭水管直徑（mm）平均聽閾（d B HL）左 右IVS7－2A＞G純合突變16（27.12）10.50±3.58 1.49±0.90 3.34±0.71 91.88±8.34 95.31±6.70 IVS7－2A＞G、2168A＞G復合雜合突變3（5.08）9.00±1.00 2.67±0.58 3.53±0.094 95.00±4.36 100.33±5.51 IVS7－2A＞G雜合突變31（52.54）12.39±2.77 1.27±1.01 3.38±1.08 93.77±9.87 96.42±7.59 2168A＞G雜合突變7（11.86）14.43±2.23 1.89±1.07 3.01±0.47 85.86±6.36 87.86±6.99 2168A＞G純合突變2（3.39）9.50±0.71 2.50±0.71 3.20±0.28 97.50±3.54 100.00±0.00

圖1 IVS7－2A＞G純合突變患者的EVAS

圖2 IVS7－2A＞G純合突變患者的前庭和耳蝸畸形

3 討論

SLC26A4基因突變在大前庭水管患者中的檢出率國內外不同，我國為97.9%，日本為92%，韓國為78%，但在高加索地區白種人中只有53%［8～11］。歐美白人中SLC26A4基因突變位點T416P、L236P和IVS8＋1G＞A是Pendrin綜合征患者最常見的幾種突變類型［12］，亞洲人群IVS7—2A＞G、H723R和L676Q的突變頻率較高［6，9，13］；戴樸等［14］發現SLC26A4基因在中國耳聾人群中的獨特突變譜，最常見的類型為IVS7－2A＞G。明確不同種族人群中SLC26A4基因不同的突變譜對于耳聾的基因診斷有很大幫助。

圖3 IVS7－2A＞G雜合突變患者HRCT顯示EVAS＋Mondini畸形耳蝸發育小，周數減少或僅有底周，呈囊狀擴大

圖4 2168A＞G雜合突變患者的EVAS

圖5 2168A＞G雜合突變患者的EVAS＋Mondini畸形

圖6 2168A＞G純合突變患者的EVAS

圖7 IVS7－2A＞G、2168A＞G復合雜合突變患者的前庭和耳蝸畸形

圖8 IVS7－2A＞G、2168A＞G復合雜合突變患者的EVAS

中國人群中SLC26A4基因熱點突變包括IVS7—2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1975G＞C、1229C＞T、1174A＞T、1687_1692ins A、IVS15＋5G＞A、2027T＞A、589G＞A、281C＞A等，上述11種熱點突變在大前庭水管綜合征患者群體中的等位基因頻率高達72.62%，其中IVS7—2A＞G、2168A＞G突變等位基因頻率最高［15］。本組59例SLC26A4基因突變患者中突變位點主要集中于IVS7－2 A＞G和2168A＞G，與上述研究相符，可見針對IVS7—2A＞G、2168A＞G進行SLC26A4基因突變篩查可提高篩查效率。

文中結果顯示，59例SLC26A4基因突變的患者中檢出SLC26A4雜合突變41例（69.49%，41／59）（IVS7－2 A＞G雜合突變，2168 A＞G雜合突變，IVS7－2 A＞G、2168 A＞G復合雜合突變），純和突變18例（30.51%，18／59）（IVS7－2A＞G純合突變，2168A＞G純合突變），雜合突變的檢出率高于純合突變，提示SLC26A4基因在常染色體隱性遺傳的同時可能具有部分顯性遺傳特征，但并非所有SLC26A4基因雜合突變者均發生大前庭水管綜合征，因此該基因的顯性遺傳特征還有待進一步實驗證明。

本組有3例為IVS7－2A＞G和2168A＞G復合雜合突變，推測相同基因不同位點的復合雜合突變與相同位點的純和突變具有相似的致病作用，也可以導致其產物Pendrin蛋白出現結構變化和功能障礙引起耳聾，進一步證實SLC26A4基因具有顯性遺傳特性的推測。

SLC26A4 IVS7—2A＞G突變是國人最熱點的突變，SNHL患者中80%的IVS7—2A＞G單雜合突變可以出現EVAS表型［16］。本組病例中SLC26A4 IVS7—2A＞G單雜合突變31例，這些單雜合突變攜帶者聽力表型特征均為重度－極重度感音神經性聾，但其聽力損失是否與SLC26A4基因突變有關，尚待進一步的研究。

SLC26A4基因IVS7－2 A＞G、2168 A＞G單雜合突變攜帶者不一定會發生SNHL，這部分單雜合突變攜帶者，如果表型為EVAS和SNHL，推測是多基因遺傳或者多種因素作用而發病，其原因：①可能存在導致EVAS表型的其他基因突變，突變可能在內含子的隱蔽剪切位點，或者在啟動子區而沒有被分析到，例如：更遠距離的調控作用、啟動子區的轉錄調控作用、啟動子甲基化。近來有研究（梅凌云，2008）證明轉錄因子基因FOXII參與了EVAS的發病，啟動子區域的突變直接影響SLC26A4基因的轉錄；②可能有其他基因突變具有SLC26A4基因突變類似的功能，還可能存在其他的修飾基因，也會影響聽力表型的外顯率；③環境因素的影響。還有小部分IVS7—2A＞G單雜合攜帶者可能只有SNHL的表型，并不伴EVAS，雜合突變也有可能使聽力表型發生改變。

嬰兒進行CT、MRI檢查較為困難，基因診斷可為明確其耳聾病因提供一定的參考，基因診斷可以解釋部分重度－極重度感音神經性聾的病因，但是還有一部分患者的病因需要進行更加深入的研究。本研究對廣東省聾校非綜合征型聾患者SLC26A4基因突變情況進行了初步分析，發現了SLC26A4基因突變集中的位點，為廣東地區耳聾患者的基因篩查提供了較好的依據。針對SLC26A4基因的復合、雜合突變對耳聾的致病作用，將通過擴大大前庭水管綜合征病例及家系的研究進一步證實，爭取進一步發現SLC26A4雜合和復合雜合突變對大前庭水管綜合征發病的影響及其可能的分子遺傳學機制。

1 Hilgert N，Smith RJ，Van Camp G.Forty－six genes causing nonsyndromic hearing impairment：which ones should be analyzed in DNA diagnostics［J］.Mutat Res，2009，681：189.

2 Morton CC，Nance WE.Newborn hearing screening－－a silent revolution［J］.N Engl J Med，2006，354：2151.

3 Abe S，Usami S，Hoover DM，et al.Fluctuating sensorineural hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct maps to 7q31，the region containing the Pendred gene［J］.Am J Med Genet，1999，82：322.

4 Azaiez H，Yang T，Prasad S，et al.Genotype－phenotype correlations for SLC26A4 related deafness［J］.Hum Genet，2007，22：451.

5 Pryor S，Madeo A，Reynolds J，et al.SLC26A4／PDS genotype phenotype correlation in hearing loss with enlargement of the vestibular aqueduct（EVA）：evidence that Pendred syndromeand non—syndromic EVA are distinct clinical and genetic entities［J］.J Med Genet，2005，42：159.

6 Wang Q，Zhao Y，Rao S，et al.A distinct spectrum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China［J］.Clin Genet，2007，72：245.

7 Mazzoli M，Camp GV，Newton V，et al.Recommendations for the description of genetic and audiological data for families with nonsyndromic hereditary hearing impairment［J］.Audiological Medicine，2009，1：148.

8 Tsukamoto K，Suzuki H，Harada D，et al.Distribution and frequencies of PDS（SLC26A4）mutations in Pendred syndrome and nonsyndromic hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct：a unique spectrum of mutations in Japanese［J］.Eur J Hum Genet，2003，11：916.

9 Park HJ，Shaukat S，Liu XZ，et al.Origins and frequencies of SLC26A4（PDS）mutations in east and south Asians：global implications for the epidemiology of deafness［J］.J Med Genet，2003，40：242.

10 Choi BY，Stewart AK，Nishimura KK，et al.Efficient molecular genetic diagnosis of enlarged vestibular aqueducts in East Asians［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2009，13：679.

11 Albert S，Blons H，Jonard L，et al.SLC26A4 gene is frequently involved in nonsyndromic hearing impairment with enlarged vestibular aqueduct in Caucasian populations［J］.Eur J Hum Genet，2006，14：773.

12 Campbell C，Cucci R，Prasad S，et al.Pendred syndrome，DFNB4 and PDS／SLC26A4：identification of eight novel mutations and possible genotype－phenotype correlations［J］.Hum Mutst，2001，17：403.

13 Dai P，Li Q，Huang D，et al.SLC26A4C 919—2A＞G varies among Chinese ethnic groups as a cause of hearing loss［J］.Genet Med，2008，10：586.

14 李琦，黃德亮，朱慶文，等.感音神經性耳聾患者大前庭導水管綜合征相關SLC26A4基因IVS7—2A＞G的全序列分析［J］.中華醫學遺傳學雜志，2010，27：610.

15 王國建，袁永一，李榮，等.不同聽力學表型人群中常見耳聾基因突變檢出率的分析［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，10：445.

16 戴樸，朱秀輝，袁永一，等.Pendred綜合征熱點突變篩查赤峰市聾啞學校大前庭水管綜合征患者［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2006，41：497.

（2015－12－28收稿）

（本文編輯 李翠娥）

Mutations in SLC26A4 Gene and Relevant Phenotype Analysis in Fifty－nine Cases of Enlargement of Vestibular Aqueduct（EVA）Syndrome Children in Guangdong District

Zhu Meichan，Zhou Feng，Wang Meng，Lin Ying，Wang Xingjun，Yu Feng，Wang Haitao，Huang Lifen，Liang Zijian
［Department of Otorhinolaryngology，Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery Hospital of Guangzhou（Guangzhou No.12 Hospital），Guangzhou，510620，China］

Objective The molecular etiology of hearing impairment in Guangdong District has not been thoroughly investigated.SCL26A4 gene mutation and relevant phenotype were analyzed in this study.Methods The coding exons of SLC26A4 were analyzed in 59 EVA cases.Those SLC26A4 gene mutations patients were examined by temporal bone CT.Results Fifty－nine cases were SLC26A4 mutations deafness patients，and 21 cases（35.59%）and 38 cases（64.41%）patients with SLC26A4 biallelic allele（compound homozygous or heterozygous）and monoallelic gene mutation，including 16 cases of SLC26A4 gene IVS7－2 A＞G homozygous mutations，2 cases of 2168A＞G homozygous mutations and 3 cases of IVS7－2A＞G，2168 A＞G compound heterozygous mutations in children with CT showing bilateral enlarged vestibular aqueduct or other types of inner ear malformations.Thirtyone patients were IVS7－2A＞G heterozygous for SLC26A4 mutation and seven 2168 A＞G heterozygous mutation.Four patients with SLC26A4 gene mutations were confirmed to have enlarged vestibular aqueduct with Mondini dysplasia.Two patients with normal phenotype，and others were enlarged vestibular aqueduct.Conclusion Mutations in the SLC26A4 gene with enlarged vestibular aqueduct patients were frequently found in Guangdong District.IVS7－2A＞G mutations rate were highest，followed by 2168 A＞G.We established the new strategy that detects SLC26A4 mutations prior to the temporal bone CT scan to find enlarged vestibular aqueduct and inner ear malformation patients.

SLC26A4 gene； Enlargement of vestibular aqueduct syndrome； Inner ear malformation； Phenotype

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.004

時間：2016－6－29 16：12

R764.3

A

1006－7299（2016）04－0335－05

* 廣州市科技計劃項目（2014Y2－00119）資助

1 廣州市耳鼻咽喉頭頸外科醫院（廣州市第十二人民醫院），廣州醫科大學耳鼻咽喉頭頸外科研究所，廣州市耳鼻咽喉頭頸外科醫院聽力中心，耳鼻咽喉頭頸外科（廣州 510620）

朱美嬋，女，廣東人，醫師，主要研究方向為耳科臨床及聽力學。

周楓（Email：zhoufengguangzhou＠163.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1612.040.html