質膜鈣ATP酶異構體1～3在新生大鼠耳蝸基底膜的表達△

陳請國褚漢啟周良強陳金劉云羅蜜陶雁玲

質膜鈣ATP酶異構體1～3在新生大鼠耳蝸基底膜的表達△

陳請國1褚漢啟1周良強1陳金1劉云1羅蜜2陶雁玲1

目的 通過Western blot方法檢測質膜鈣ATP酶異構體1～3（plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms 1～3，PMCA1～3）在新生大鼠耳蝸基底膜（basilar membrane，BM）的表達，并檢測PMCA2在單個新生大鼠耳蝸毛細胞纖毛的表達量。方法 ①取出生后2天（P2）和8天（P8）健康SD大鼠各4只，斷頭后分離出BM，提取總蛋白，分別取20μg，通過Western blot法檢測BM的PMCA1～3表達。②取P2和P8大鼠BM總蛋白3μg，通過Western blot方法檢測BM的PMCA2的表達。③取4只P8大鼠，分離出BM，提取總蛋白，分別取5、10、20 μg總蛋白并取100、400和800 ng牛血清白蛋白（BSA）作為對照組，跑完電泳后將膠分為2部分，部分泳道用于SYPRO染膠，其余泳道用于Western blot檢測PMCA2的表達。結果 ①在20μg的P2和P8大鼠BM總蛋白中，PMCA1僅有微弱的表達（分別為0.126±0.024、0.131±0.012），PMCA2表達水平較高（分別為4.16±0.528、4.25±0.319），PMCA3幾乎沒有表達（均為0），三者間差異有統計學意義（P＜0.05）。②在3μg的P2和P8大鼠BM總蛋白中，P8大鼠PMCA2的表達水平（4.571±0.336）高于P2大鼠（3.622±0.285），差異有統計學意義（P＜0.05）。③PMCA2在單個P8大鼠BM的含量約為2.5 ng。結論 PMCA1～3在新生大鼠耳蝸BM的表達水平不同，PMCA2表達量最大，這可能是由于耳蝸毛細胞對這幾種PMCA亞型有不同的Ca2＋調節需求。

質膜鈣ATP酶異構體1； 質膜鈣ATP酶異構體2； 質膜鈣ATP酶異構體3； 基底膜； 耳蝸

在內耳中，Ca2＋參與耳蝸毛細胞纖毛的機械電轉導過程，對維持正常聽覺生理發揮著關鍵作用。質膜鈣ATP酶異構體（plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms，PMCAs）是維持耳蝸毛細胞內Ca2＋濃度平衡的重要蛋白質之一，它的主要作用是將毛細胞內Ca2＋轉移到細胞外，從而維持毛細胞內低Ca2＋水平。已知PMCA存在四種亞型，分別是PMCA1～4［1］，PMCA1～3在耳蝸內表達，而PMCA4表達很微弱，甚至不表達［2，3］。目前有關PMCA1～3在內耳表達的研究主要集中在成年大鼠，在新生大鼠內耳的研究較少［4，5］。本實驗通過Western blot方法檢測出生2天（P2）和8天（P8）大鼠耳蝸基底膜（basilar membrane，BM）PMCA1～3的表達，并應用SYPRO染膠法檢測單個P8大鼠BM的PMCA2含量，以推測PMCA2在耳蝸毛細胞纖毛的表達量。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇出生2天（P2）的健康SD大鼠4只，出生8天（P8）的健康SD大鼠8只（由華中科技大學同濟醫學院動物中心提供，并具備合格證書）。所有動物實驗都經過華中科技大學同濟醫學院動物委員會同意，并按照標準的獸醫標準執行。

1.2 主要試劑 Tris－base、甘氨酸（Glycine）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tween－20、脫脂奶粉蛋白、Marker、聚丙烯酰胺凝膠、Bradford定量液、上樣緩沖液、BAS標準液（美國Bio－Rad公司），醋酸（美國Thermo Fisher Scientific公司），硝酸纖維素膜（美國Schleicher＆Schuell公司），蛋白酶抑制劑、二硫蘇糖醇（DTT）（美國Sigma公司），PMCA1～3抗體、內參蛋白GAPDH抗體（美國Affinity Bioreagents公司），HRP結合的羊抗兔二抗、ECL增強化學發光試劑、膠片、Sypro Ruby染膠液、蛋白質抽提液（美國Invitrogen Life Sciences）。

1.3 實驗方法

1.3.1 P2和P8大鼠BM總蛋白提取 取P2和P8大鼠各4只，用海羅芬麻醉后斷頭，解剖出耳蝸，挑開骨質后去掉螺旋韌帶和螺旋神經節組織，分離耳蝸基底膜（BM）（分離過程中用液氮罐保持低溫，防止組織蛋白降解），剔除Tectorial膜和Reissner氏膜，然后提取總蛋白，用Bradford法測蛋白濃度。

1.3.2 Western blot方法比較PMCA1～3在P2和P8大鼠BM的表達差異 分別取P2和P8大鼠BM總蛋白20μg，在沸水中變性后加到7.5%聚丙烯酰胺凝膠上樣孔，在170 V恒壓條件下電泳1 h后轉膜，根據泳道位置將膜剪成條帶狀，放到密封袋中，分別加入兔抗PMCA1～3抗體（1：1 000）、GAPDH（1：1 000）、4℃下在搖床上孵育過夜。TBST溶液（10 m M Tris-HCl（p H 8.0），150 m M NaCl，0.05%Tween 20）洗滌3次，每次10 min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的HRP結合的羊抗兔二抗（1：2 500），室溫孵育1 h。TBST液體洗滌3次，每次10 min，用ECL增強化學發光法顯色。之后顯影、定影、壓片、曝光到柯達膠片上，時間2～4 min。掃描后用Photoshop標記圖片。之后取3μg的P2和P8大鼠BM總蛋白，依次加入兔抗PMCA2抗體（1：1 000），GAPDH（1：1 000）、HRP結合的羊抗兔二抗（1：3 000），具體步驟同上。以上每個步驟重復5次。

1.3.3 單個P8大鼠耳蝸BM的PMCA2含量檢測

取4只P8大鼠的耳蝸，分離出BM（具體方法同上），加80μl蛋白抽提液和40μl蛋白酶抑制劑，提取總蛋白，獲取上清液共117μl；用Bradford法測量蛋白濃度，分別上樣5、10和20μg總蛋白，對照組分別加入100、400和800 ng牛血清白蛋白（BSA）。跑完電泳后將膠切為兩部分，一部分用于SYPRO染膠（含10μg和20μg的總蛋白及100～800 ng BSA蛋白的泳道），另一部分（含5μg蛋白的泳道）用于做Western blot檢測。將用于SYPRO染色的膠放到干凈的容器，加入100 ml固定液（50%甲醛，7%醋酸，溶于雙蒸水），放在搖床上固定30 min，倒掉液體后加入新鮮固定液，繼續固定30 min；倒掉固定液后加入60 ml SYPRO Ruby染膠液，放到搖床上搖晃過夜。將膠轉移到另外一個干凈的容器，加入洗滌液（10%甲醛，7%醋酸，溶于雙蒸水）搖床上搖晃30 min，之后用雙蒸水漂洗膠2次，每次5 min，將膠放到凝膠成像系統中掃描。切下的另外一塊膠用來做Western blot檢測，轉膜后封閉，加入一抗和二抗，具體方法同前。通過測量蛋白Marker條帶之間的間距，比較Western blot實驗后的膠片條帶和SYPRO染膠后的蛋白條帶，確定SYPRO染膠上PMCA2蛋白條帶的位置。用Photoshop軟件分別測量不同BSA含量條帶的灰度值，畫出BSA含量VS灰度值曲線，得到關系等式；然后測量PMCA2蛋白條帶的灰度值，應用到BSA關系等式后算出條帶中PMCA2的含量，通過計算上樣的BM蛋白體積和BM蛋白提取液總體積的比值，算出8個BM中總的PMCA2含量，除以8得到單個BM的PMCA2含量。

1.4 統計學方法 用Photoshop軟件測量PMCA1～3蛋白條帶和內參蛋白條帶GAPDH的灰度值，計算PMCA1～3條帶和GAPDH條帶的灰度值比值，作為PMCA1～3的相對表達量。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，使用SPSS 16.0軟件對數據進行單因素方差分析和處理，采用t檢驗做比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PMCA1～3在P2和P8大鼠BM的表達差異

從圖1看出，PMCA1在P2和P8大鼠的BM中表達較少，而PMCA2的表達強烈，PMCA3幾乎沒有表達。三者之間的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。在20μg P2和P8大鼠BM總蛋白中PMCA1、PMCA2的表達差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 通過Western blot方法檢測PMCA1～3在P2和P8大鼠BM的表達電泳圖

表1 20μg P2和P8大鼠BM總蛋白中PMCA1～3表達的蛋白條帶灰度值比值（±s）

表1 20μg P2和P8大鼠BM總蛋白中PMCA1～3表達的蛋白條帶灰度值比值（±s）

出生天數PMCA1 PMCA2 PMCA3 P2 0.126±0.024 4.16±0.528 0 P8 0.131±0.012 4.25±0.319 0

從表1看，PMCA2的表達太過強烈，可能影響其灰度值的檢測。為了進一步檢測P2和P8大鼠BM PMCA2表達差異，將BM總蛋白的上樣量從20μg減少為3μg，再做Western blot，結果發現P8的蛋白條帶灰度值比值（4.571±0.336）明顯比P2（3.622±0.285）大，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 Western blot方法檢測PMCA2在3μg的P2和P8大鼠耳蝸BM表達電泳圖

2.2 單個P8大鼠BM的PMCA2的含量 比較Western blot膠片條帶和SYPRO染膠后的蛋白條帶，用黑色直線標記的是PMCA2蛋白條帶（圖3）。用凝膠成像系統掃描凝膠后，用Photoshop測量不同BSA含量條帶的灰度值，800 ng條帶為191.85，400 ng條帶為165.6，100 ng條帶為113.27，分別減去背景灰度值后，用Excel畫出BSA蛋白含量VS灰度值曲線，得到關系等式y＝0.093 5x＋21.638（y為灰度值，x為BSA蛋白含量），然后測量10μg和20μg上樣蛋白條帶中PMCA2條帶的灰度值，減去背景灰度值后應用上面等式算出PMCA2含量，最后推算出單個P8大鼠基底膜中PMCA2的含量為2.5 ng左右。

圖3 SYPRO染膠后的PMCA2蛋白條帶

3 討論

Ca2＋在內耳發揮著不可或缺的作用，因此調控內耳Ca2＋平衡的機制研究也顯得尤為重要。目前已知下列機制參與維持Ca2＋平衡：PMCAs和Na＋／Ca2＋交換蛋白（NCX）將Ca2＋排出細胞外、位于內質網的肌漿－內質網Ca2＋－ATPase（SERCA）結合胞質內的Ca2＋、Ca2＋單輸送體將Ca2＋運送到線粒體、胞質內的鈣緩沖蛋白結合游離Ca2＋等。對毛細胞而言，由于它的纖毛浸泡在內淋巴液中，內淋巴液中豐富的K＋阻礙Na＋／Ca2＋交換體發揮作用，同時毛細胞纖毛內缺少Ca2＋儲存系統來隔離Ca2＋［6］，因此，它主要依靠Ca2＋緩沖系統及PMCA來調控胞內Ca2＋濃度。PMCA2是PMCA家族中唯一與聽覺有直接關聯的亞型［7］，PMCA2基因突變的小鼠出現先天性聾，主要原因是PMCA2突變后排鈣能力明顯下降，毛細胞纖毛附近淋巴液中的Ca2＋水平降低［8］，導致毛細胞適應的速度減慢，機械電轉導通道開放的幾率增加，甚至使它處于完全開放的狀態［9］，結果使毛細胞對聲音刺激反應遲鈍，從而出現耳聾。

雖然沒有證據表明PMCA1和PMCA3與聽覺有直接關聯，但不排除它們協助PMCA2維持正常聽覺功能，因此，了解PMCA1～3在BM的表達有一定的意義。前期通過免疫熒光檢查發現PMCA2主要在BM的毛細胞纖毛表達，PMCA1和PMCA3除了在毛細胞表達外，在BM其他組織也有表達，但表達量很低［5］；故檢測BM的PMCA2表達相當于檢測毛細胞纖毛的PMCA2表達；檢測BM中PMCA1和PMCA3的表達也能間接了解它們在毛細胞的表達情況。本研究結果顯示，PMCA1～3在新生大鼠BM的表達量有明顯差異，PMCA2表達量最大，PMCA1次之，PMCA3未見明顯表達，PMCA1在P2和P8大鼠BM的表達量區別不大；PMCA1主要表達于毛細胞的胞體側膜［5］，同樣發揮著將胞內Ca2＋轉移到胞外的作用。從文中結果看，P8大鼠BM的PMCA2表達量明顯強于P2大鼠，而PMCA2主要表達在外毛細胞纖毛，間接說明隨著大鼠生長發育，外毛細胞纖毛PMCA2表達量明顯增多。已有研究證實小鼠耳蝸外毛細胞的機械電轉導電流隨著小鼠生長發育也逐漸增大［10］；由于Ca2＋進入毛細胞是機械電轉導電流出現的關鍵環節，PMCA2負責將胞內大部分Ca2＋排出，因此，表明PMCA2和機械電傳導電流之間存在著緊密的聯系。此外，PMCA2對毛細胞機械電轉導通道的發育也起著重要作用，此在發育中的小雞耳蝸毛細胞得到證實［11］。PMCA3主要表達于內毛細胞的pericuticular necklace，在內毛細胞的胞體側膜也有微弱的表達［2］。本實驗未能在P2和P8大鼠的BM檢測到PMCA3的表達，推測PMCA3在新生大鼠BM沒有表達，或者表達很微弱，可能需要增加總蛋白上樣量（比如50μg）才能檢測到，方能進一步比較PMCA3在P2和P8大鼠BM的表達差異。從文中PMCA1～3在大鼠耳蝸BM的表達差異可以看出，BM對PMCA2的需求最大，PMCA1次之，PMCA3幾乎沒有，這可能與PMCA1～3在耳蝸發揮的生理功能不同有關。

前期研究證實PMCA2在P8大鼠耳蝸毛細胞纖毛的表達基本達到成年水平［5］，因此，本研究取P8大鼠耳蝸BM，間接得出單個大鼠耳蝸毛細胞中PMCA2的含量為2.5 ng。根據Beurg等［12］對大鼠的研究，每個毛細胞的纖毛面積約為200μm2，每個耳蝸大約有11 000個毛細胞，每μm2纖毛含有6 000個鈣泵，故每個耳蝸中約有1.32×1010個鈣泵，而每摩爾物質中含有6.02×1023個微粒，可以推算每個耳蝸中含有2.19×10－14摩爾鈣泵，而PMCA2的分子量為127 KDa，因此，重量為2.78 ng，該推測結果和本實驗結果相近。PMCA在牛蛙毛細胞纖毛的分布密度為2 000／μm2［13，14］，而大鼠毛細胞纖毛的PMCA密度為6 000／μm2，是牛蛙的幾倍，這可能是由于哺乳動物聽覺機制復雜，耳蝸毛細胞對Ca2＋有著更高的調控需求。因此，檢測PMCA2在耳蝸毛細胞的表達量有助于進一步了解PMCA2與內耳聽覺功能的關聯。

1 Keeton TP，Burk SE，Shull GE.Alternative splicing of exons encoding the calmodulin－binding domains and C termini of plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms 1，2，3，and 4［J］.J Biol Chem，1993，268：2740.

2 Dumont RA，Lins U，Filoteo AG，et al.Plasma membrane Ca2＋－ATPase isoform 2a is the PMCA of hair bundles［J］.J Neurosci，2001，21：5066.

3 Crouch JJ，Schulte BA.Expression of plasma membrane Ca－ATPase in the adult and developing gerbil cochlea［J］.Hear Res，1995，92：112.

4 陳請國，褚漢啟，王顯紅，等.質膜鈣ATP酶異構體2在新生大鼠螺旋神經節細胞中的表達［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，45：128.

5 Chen QG，Mahendrasingam S，Tickle JA，et al.The development，distribution and density of the plasma membrane calcium ATPase 2 calcium pump in rat cochlear hair cells［J］.Eur J Neurosci，2012，36：2302.

6 Jacobs RA，Hudspeth AJ.Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog＇s internal ear［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1990，55：547.

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8 Wood JD，Muchinsky SJ，Filoteo AG，et al.Low endolymph calcium concentrations in deafwaddler 2J mice suggest that PMCA2 contributes to endolymph calcium maintenance［J］.J Assoc Res Otolaryngol，2004，5：99.

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10 Lelli A，Asai Y，Forge A，et al.Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea［J］.J Neurophysiol，2009，101：2961.

11 Si F，Brodie H，Gillespie PG，et al.Developmental assembly of transduction apparatus in chick basilar papilla［J］.J Neurosci，2003，23：10815.

12 Beurg M，Nam JH，Chen QG，et al.Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells［J］.J Neurophysiol，2010，104：18.

13 Lumpkin EA，Hudspeth AJ.Regulation of free Ca2＋concentration in hair－cell stereocilia［J］.J Neurosci，1998，18：6300.

14 Yamoah EN，Lumpkin EA，Dumont RA，et al.Plasma membrane Ca2＋－ATPase extrudes Ca2＋from hair cell stereocilia［J］.J Neurosci，1998，18：610.

（2015－10－08收稿）

（本文編輯 雷培香）

The Expression of Plasma Membrane Ca2＋－ATPase lsoforms 1～3 in the Basilar Membrane of Neonatal Rat Cochlea

Chen Qingguo*，Chu Hanqi，Zhou Liangqiang，Chen Jin，Liu Yun，Luo Mi，Tao Yanling
（*Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan，430030，China）

Objective To study the expression of plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms 1～3（PMCA 1～3）in the basilar membrane（BM）of the neonatal rat cochlea by Western blot.The PMCA2 content in single BM of the neonatal rat was also examined.Methods Four rats at postnatal 2 days（P2）and 8 days（P8）were respectively decapitated and their BMs were isolated.The total proteins of BMs were extracted.The 20μg total proteins were respectively loaded to the gel.The expression of PMCA1－3 was detected by Western blot.Likewise，3μg total proteins from P2 and P8 rat BM were loaded.The expression of PMCA2 was detected by Western blot.Four rats at P8 were decapitated and their BM was isolated.The 5μg，10μg and 20μg total proteins of P8 rat BM were added to the gel and 100 ng，400 ng and 800 ng bovine serum albumin（BSA）were also loaded as reference.After electrophoresis，the gel was separated into two parts.One part was used for SYPRO staining and the other part was used for PMCA2 detection by Western blot.Results In the 20μg BM total proteins of P2 and P8 rats，the expression of PMCA1 was weak（0.126±0.024，0.131±0.012，respectively），PMCA2 was strong（4.16±0.528，4.25±0.319，respectively），and PMCA3 was barely expressed（0）.There was a statistical difference among PMCA1，PMCA2 and PMCA3（P＜0.05）.In the 3μg BM total proteins of P2 and P8 rats，the expression of PMCA2 in P8（4.571± 0.336）was higher than P2（3.622±0.285）.There was a statistical difference（P＜0.05）.The PMCA2 content in the BM of a P8 rat was about 2.5 ng.Conclusion There was a different－level expression of PMCA1～3 in the neonatal rat BM with highest expression of PMCA2，which could be explained that cochlear hair cells had different requirements of Ca2＋turning for these PMCA isoforms.

Plasma membrane Ca2＋－ATPase isoform 1（PMCA1）； Plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms 2（PMCA2）； Plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms 3（PMCA3）； Basilar membrane； Cochlea

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.011

時間：2016－6－29 16：16

R339.16

A

1006－7299（2016）04－0366－05

△ 國家自然科學基金青年基金（81300827）資助

1 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院耳鼻咽喉－頭頸外科（武漢 430030）； 2 湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院耳鼻咽喉－頭頸外科

陳請國，男，湖北人，主治醫師，主要研究方向為聽覺生理。

陶雁玲（Email：18907183041＠163.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1616.072.html