豚鼠腦缺血再灌注后聽皮層內質網應激相關因子的表達及意義△

呂哲張穎王團徐鷗路虹

豚鼠腦缺血再灌注后聽皮層內質網應激相關因子的表達及意義△

呂哲1張穎1王團2徐鷗1路虹1

目的 觀察豚鼠腦缺血再灌注后葡萄糖結合蛋白（glucose－regulated protein，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－12（caspase－12）在聽皮層的表達，探討內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在腦缺血再灌注后聽皮層神經元凋亡中的作用。方法 選取健康豚鼠50只，隨機分為5組：正常對照組、A組（缺血再灌注6 h）、B組（缺血再灌注12 h）、C組（缺血再灌注24 h）、D組（缺血再灌注72 h）。采用夾閉雙側頸總動脈的方法建立腦缺血再灌注損傷模型，分別在腦缺血再灌注后6、12、24、72 h行聽性腦干反應（ABR）測試后處死各組豚鼠，應用HE染色法觀察聽皮層神經元病理變化，免疫組化染色及Western－blot方法檢測各組GRP78、caspase－12的表達。結果 從正常對照組到B組豚鼠ABR反應閾值逐漸增加，從C組到D組又逐漸下降，但D組仍比正常對照組高（P＜0.05）。HE染色示正常對照組聽皮層神經元排列整齊，胞漿豐富，胞核大而圓，染色清晰；A、B、C、D組聽皮層神經元均有不同程度的數量減少，且體積萎縮，胞核固縮，碎裂，核仁消失。免疫組化染色及Western－blot示正常對照組GRP78、caspase－12蛋白僅有微量或少量表達，缺血再灌注后6 h，二者表達開始上調，至12 h GRP78表達達到高峰，12 h后逐漸降低，各組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。caspase－12表達24 h達到峰值，后逐漸下降，缺血再灌注6 h組與12 h組間差異無統計學意義，其余各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 腦缺血再灌注損傷可誘發內質網應激，使GRP78、caspase－12表達增加，GRP78、caspase－12可能參與了ERS介導的聽皮層神經元細胞凋亡過程。

內質網應激； 缺血再灌注損傷； 凋亡

內質網應激反應（endoplasmic reticulum stress，ERS）近年來備受國外學者的關注，尤其是其在腦缺血再灌注后聽皮層神經元凋亡過程中的作用更是研究者關注的重點之一。腦缺血一定時間恢復血液供應后，其功能不但未恢復，反而出現了更加嚴重的機能障礙，稱之為缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注可誘發內質網應激，激活內質網凋亡途徑，導致神經細胞凋亡；聽覺皮質接受來自大腦中動脈的血供，在缺血缺氧情況下容易發生細胞凋亡。本研究旨在通過建立豚鼠腦缺血再灌注損傷模型，檢測其聽皮層組織中葡萄糖結合蛋白（glucose－regulated protein，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－12（caspase－12）的表達，探討腦缺血再灌注對聽皮層神經元細胞內質網應激反應的誘導及ERS介導的神經元凋亡過程，為臨床血管病變造成聽損傷的治療提供理論依據及新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇健康白色雄性豚鼠50只，購于河北醫科大學實驗動物中心，體重400～450 g，雙耳ABR反應閾均在10 d B SPL以內，隨機分為正常對照組、A組（缺血再灌注6 h）、B組（缺血再灌注12 h）、C組（缺血再灌注24 h）、D組（缺血再灌注72 h），每組10只。

1.2 試劑和儀器 PXS－1020型體視解剖顯微鏡，ICS－CHARTR－EP型ABR電位儀（北京麥德森醫療器械），免疫組化試劑盒（河北博海生物工程有限公司），兔抗鼠GRP78抗體（美國SANTA Cruz），兔抗鼠caspase－12抗體（美國SANTA Cruz），HRP標記羊抗兔IgG（碧云天生物技術公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術公司）。

1.3 腦缺血再灌注動物模型的建立 A、B、C、D組動物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于頸部正中切口逐層分離暴露兩側頸總動脈后用微動脈夾夾閉兩側頸總動脈，計時15 min后恢復血流灌注，沖洗創口對位縫合。在夾閉雙側頸總動脈后豚鼠出現翻正反射消失、雙側瞳孔散大、對光反射消失，呼吸平穩無抽搐，清醒后反應遲鈍，無偏癱或癲癇［1］，為腦缺血再灌注動物模型建立成功。對照組動物不作任何處理。

1.4 聽性腦干反應（auditory brainstem response，ABR）測試 對照組及A、B、C、D組于腦缺血再灌相應時間點行ABR檢測。動物水合氯醛腹腔注射麻醉后置于隔聲屏蔽室內，采用美國ICS聽性腦干誘發電位儀檢測，刺激聲為短聲，極性為交替波，速率為21.1次／秒，增益為50 k，以可引出波III的最小刺激強度定為ABR反應閾。

1.5 動物聽皮層標本制備及染色觀察 參照《大鼠腦立體定位圖譜》［2］，確定豚鼠聽皮層區域。

完成ABR檢測后，每組取2只豚鼠麻醉后，開胸經心尖依次灌注生理鹽水和多聚甲醛，取出整個大腦置于4%多聚甲醛中固定24 h。固定后二次取材，經脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制成石蠟塊，確定聽皮層區域，用石蠟切片機連續切片，行HE染色及免疫組化檢測。各組其余8只豚鼠麻醉后迅速冰上斷頭取腦，找到聽皮層，用刀片切取后盡量切碎，－80℃冰箱保存。

1.5.1 HE染色及聽皮層神經元觀察 二甲苯脫蠟2次，無水乙醇洗去二甲苯2次，依次浸入95%、80%、70%酒精水化，蘇木精染色。然后1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，直至輕柔甩干，中性樹脂封片。觀察聽皮層神經元的大小、形態、分布以及胞漿、胞核、核仁變化。用Image Pro Plus 5.1彩色圖像處理軟件在40×10倍鏡下計數每張切片的凋亡細胞。

1.5.2 免疫組化染色檢測GRP78、caspase－12表達 石蠟切片經脫蠟、復水，采用辣根過氧化物酶染色，胞漿或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細胞。全自動照相機顯微鏡下拍照，Image Pro Plus 5.1圖像處理軟件在40×10倍鏡下觀察并計數陽性細胞，每張切片采集5個具有代表性的高倍視野。

1.5.3 Western－blot檢測GRP78、caspase－12蛋白表達 聽皮層組織加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑進行低溫勻漿，蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白樣品含量，電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗（兔抗鼠GRP78、caspase－12多克隆抗體）、二抗（HRP標記羊抗兔IgG）孵育，洗膜，增強化學發光法顯色，X光膠片曝光，進行條帶掃描，計算目的樣本蛋白光密度與β－actin基因條帶光密度比值，分析GRP78、caspase－12蛋白表達。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組ABR反應閾 正常對照組及A、B、C、D組動物雙耳ABR反應閾見表1，可見從正常對照組到B組雙耳ABR反應閾值逐漸增加，從C組到D組逐漸下降，但D組ABR反應閾仍高于正常對照組（P＜0.05）。

2.2 各組聽皮層HE染色結果 正常對照組豚鼠聽皮層神經元排列整齊，細胞體積較大，胞漿豐富呈紅色，胞核大而圓，核膜清楚，核仁明顯，染色清晰。A、B、C、D組（腦缺血再灌注后各時間點）聽皮層神經元數量減少，分布不均，有不同程度的體積萎縮，胞漿、胞核窺視不清，核膜、核仁分界不明，胞核固縮，碎裂，核仁消失（圖1）。對各組凋亡細胞數進行統計分析顯示，除A組與B組比較差異無統計學意義外（P＝0.839），其余各組間差異均有統計學意義（表1）。

2.3 各組免疫組化結果 GRP78抗原陽性細胞為胞漿有棕黃色，正常對照組GRP78陽性細胞少量表達，缺血再灌注6 h后（A組）陽性細胞表達即迅速增加，至12 h（B組）達到高峰，以后表達逐漸減少，各組間差異均有統計學意義（表1，圖2）。caspase－12抗原陽性細胞呈棕黃色，胞漿胞核均有表達，但以胞漿表達為主，正常對照組僅有微量表達，缺血再灌注6 h（A組）陽性細胞表達有少量增加，之后表達逐漸增加，至24 h（C組）達高峰，然后明顯下降。除正常對照組與缺血再灌注72 h（D組）差異無統計學意義外（P＝0.086），其余各組間差異均有統計學意義（表1，圖3）。

2.4 各組聽皮層GRP78、caspase－12蛋白Western－blot檢測結果 正常對照組GRP78、caspase－12蛋白僅有微量表達，缺血再灌注6 h（A組）二者表達開始上調，至12 h（B組）GRP78表達達到高峰，以后逐漸減少，各組間差異均有統計學意義。caspase－12表達在缺血再灌注24 h（C組）時達到峰值，后逐漸下降，A組與B組間差異無統計學意義（P＝0.117），其余各組間差異均有統計學意義（表1，圖4）。

表1 各組ABR反應閾、凋亡細胞數及聽皮層GRP78、caspase－12表達（±s）

表1 各組ABR反應閾、凋亡細胞數及聽皮層GRP78、caspase－12表達（±s）

－actin正常對照組9.91±3.16 2.4±1.12 13.41±1.11 4.93±0.66 0.1組別ABR反應閾（dB SPL）凋亡細胞數（個）GRP78免疫組化表達caspase－12免疫組化表達GRP78／β－actin caspase－12／β 49±0.037 0.252±0.025 A組29.81±2.94 13.8±2.43 35.59±2.71 12.01±2.47 0.223±0.030 0.301±0.018 B組35.22±1.54 23.7±2.15 75.05±5.61 54.47±5.70 1.118±0.027 0.327±0.028 C組29.99±2.13 14.5±3.12 46.17±5.50 85.61±2.46 0.259±0.030 1.122±0.043 D組20.20±2.07 8.4±2.37 40.76±3.74 7.74±2.36 0.403±0.036 0.428±0.041 F 4 940.348 88.937 321.766 1 005.222 1 194.191 1 000.992 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

內質網是細胞內蛋白質合成、翻譯后修飾、折疊、運輸的主要場所，在缺血缺氧、自由基損傷、毒性氨基酸等各種有害因素刺激下，內質網受到擾動，蛋白質的折疊將會受到影響，未折疊或錯誤折疊的蛋白大量增多并滯留于內質網腔中，進一步引起細胞功能障礙，稱為內質網應激反應（ERS）［3，4］。同時，ERS也將啟動細胞自我保護機制，即通過激活分子伴侶蛋白的基因轉錄，促使分子伴侶蛋白（如GRP78）表達增加，抑制細胞蛋白質的合成，同時加強未折疊或錯誤折疊蛋白的折疊或降解，以減輕內質網應激時的負擔，從而抵抗應激，對細胞起到一定程度的保護作用［5，6］。然而，當內質網應激反應程度過強、持續時間過久時，則超出了內質網的保護能力范圍，此時，分子伴侶（GRP78）表達不僅不再增加，反而減少，并通過激活caspase－12前體，進一步激活caspase－9、caspase－3等，最終導致細胞凋亡。

在缺血缺氧情況下，大腦皮質、海馬區等缺血缺氧敏感區最易發生細胞凋亡。聽覺皮質接受大腦中動脈的血供，當其受到阻塞壓迫等造成血流灌注減少時，聽皮質遭受缺血損傷，再灌注后又會造成再灌注損傷，聽皮層神經元內質網會發生一系列的反應，如鈣超載，大量活性氧自由基的產生，從而誘發ERS，使神經元細胞凋亡［7，8］。本實驗在課題組原有方法的基礎上［1］稍加改進，采用夾閉動物雙側頸總動脈從而造成不全腦缺血，也出現了瞳孔散大、對光反射消失，無抽搐，術后清醒后反應遲鈍，沒有出現偏癱或癲癇，說明本實驗的腦缺血再灌注模型造模成功。此方法創傷小，動物死亡率低，與臨床實際情況更加接近，實驗中無動物死亡。

圖1 各組動物聽皮層HE染色結果（HE×400）

圖3 各組動物聽皮層caspase－12免疫組化結果（免疫組化×400）

圖4 各組動物聽皮層GRP78、caspase－12蛋白Western－blot結果

GRP78是內質網中最主要的分子伴侶蛋白，被認為是ERS的標志物，能夠協助錯誤蛋白折疊、維持內質網與細胞漿間的鈣離子平衡，從而維持細胞內環境的穩定［9］。正常狀態下，GRP78與3個內質網應激感受蛋白結合，包括肌醇需求激酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE－1）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶（phosphorylated extracellularsignal regulated kinase，PERK）、活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6），處于無活性狀態。當內質網處于應激狀態時，GRP78與3個跨膜應激感受蛋白解離，并與錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白結合，同時解離后的感受蛋白通過各自的信號傳導途徑啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），減少未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網內累積，促進其降解［10］；因此，GRP78表達量顯著增高，在一定程度上反映了ERS的啟動。本實驗結果顯示，隨著腦缺血再灌注時間的延長，聽皮層GRP78蛋白表達逐漸增多，在再灌注后12小時最多，其后表達逐漸下降，提示腦缺血再灌注后誘發了ERS，以拮抗細胞凋亡、保護細胞，但當應激時間過長時（＞12 h），內質網功能結構受到破壞，出現功能障礙，超出了內質網的自我保護能力，GRP78不但不繼續升高，反而下降。提示缺血再灌注12 h內對細胞內質網應激是比較合適的，超過此時間段則超出了細胞的自我調節能力，內質網應激過度，細胞凋亡及壞死將明顯增加。

caspase－12也是ERS介導細胞凋亡的一個主要因素，僅在ERS時被特異性激活，非ERS相關刺激誘導的細胞凋亡中不被激活。它以酶原的形式存在于內質網的胞漿面，當內質網過度應激時被活化，激活后移位到胞質繼而激活caspase－9、caspase－3引起細胞凋亡。文獻報道，caspase－12缺陷的小鼠較有caspase－12表達的小鼠腎小管細胞對內質網應激更有抵抗力，而對非內質網應激途徑介導的細胞凋亡，二者敏感性相似，表明caspase－12與內質網應激介導細胞凋亡的機制有關，而與非內質網應激介導的細胞凋亡（死亡受體途徑和線粒體途徑）無關，即caspase－12特異性的參與了內質網相關凋亡途徑，因此caspase－12被認為是內質網應激介導凋亡的重要標志物［11，12］。本實驗結果表明，caspase－12在腦缺血再灌注6 h后聽皮層開始表達，并隨著再灌注時間的延長，表達量逐漸增多，在24 h時表達最多。提示再灌注12 h后，超出了內質網的保護能力范圍，此時GRP78表達下降，caspase－12前體被激活，并進一步激活凋亡相關級聯反應，導致聽皮層神經元凋亡。

研究顯示，噪聲、缺血、缺氧、耳毒性藥物等都可導致感音神經性聾［13］。內質網應激介導的凋亡途徑是腦缺血再灌注損傷的重要機制，因而也是腦缺血損傷聽皮層引發聽力下降的重要機制。本研究結果表明，腦缺血再灌注損傷可誘發內質網應激，使GRP78、caspase－12表達增加，GRP78、caspase－12參與了ERS介導的聽皮層神經元細胞凋亡過程。抑制ERS，阻止其誘導的凋亡途徑可能為治療突發性聾，尤其是伴腦血管基礎疾病的突發性聾提供新的治療思路［1，14］，如：消除誘因，促進ERS特異性保護蛋白的表達；終止內質網相關凋亡途徑的下傳等。

1 路虹，王團，徐鷗，等.內質網應激反應對豚鼠腦缺血再灌注后聽皮質區損傷的作用［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2014，21：249.

2 Paxinos G，Watson C，著.諸葛啟釧，主譯.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.第3版.北京：人民衛生出版社，2005.102～115.

3 薛秋紅，陳小林，龔樹生，等.未折疊蛋白反應在強噪聲致豚鼠耳蝸細胞損傷過程中的作用［J］.聽力學及言語疾病雜志，2011，19：149.

4 Park SW，Ozcan U.Potential for therapeutic manipulation of the UPR in disease［J］.Semin Immunopathol，2013，35：351.

5 Ni M，Zhang Y，Lee AS.Beyond the endoplasmic reticulum：atypical GRP78 in cell viability，signalling and therapeutic targeting［J］.Biochem J，2011，434：181.

6 Nakamura S，Takizawa H，Shimazawa M，et al.Mild endoplasmic reticulum stress promotes retinal neovascularization via induction of BiP／GRP78［J］.PLoS One，2013，8：e60517.

7 孫建松，漆－飛，程永華，等.突發性耳聾與腦梗塞的相關性研究［J］.中國現代醫藥雜志，2008，10：33.

8 鄭鳴，王豐，梁書鋒.豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷后iNOS活性與細胞凋亡關系［J］.中國臨床解剖學雜志，2006，24：190.

9 Pfaffenbach KT，Lee AS.The critical role of GRP78 in physiologic and pathologic stress［J］.Curr Opin Cell Biol，2011，23：150.

10 Promlek T，Ishiwata－Kimata Y，Shido M，et al.Membrane aberrancy and unfolded proteins activate the endoplasmic reticulum stress sensor Ire1 in different ways［J］.Mol Biol Cell，2011，22：3520.

11 Xu X，Liu T，Zhang A，et al.Reactive oxygen species－triggered trophoblast apoptosis is initiated by endoplasmic reticulum stress via activation of caspase－12，CHOP，and the JNK pathway in toxoplasma gondii infection in mice［J］.Infect Immun，2012，80：2121.

12 Kim EM，Shin EJ，Choi JH，et al.Matrix metalloproteinase－3 is increased and participates in neuronal apoptotic signaling downstream of caspase－12 during endoplasmic reticulum stress［J］.J Biol Chem，2010，285：16444.

13 丁中家，唐曉旭，陳鑫，等.谷氨酸損傷體外培養大鼠螺旋神經元中凋亡誘導因子的表達與分布［J］.聽力學及言語疾病雜志，2014，22：620.

14 路虹，王團，徐鷗，等.內質網應激與聽力損傷的相關研究［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2014，21：220.

（2015－10－12收稿）

（本文編輯 李翠娥）

Expression of the ERS－associated Factors on Auditory Cortex after Brain lschemia Reperfusion lnjury in Guinea Pig

Lv Zhe*，Zhang Ying，Wang Tuan，Xu Ou，Lu Hong
（*Department of Otolaryngology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，050000，China）

Objective To investigate the expression of GRP78 and caspase－12 on the auditory cortex and to study the effects of endoplasmic reticulum stress in the auditory cortex neuron apoptosis after the brain ischemia reperfusion injury in guinea pig.Methods Fifty healthy male guinea pigs were selected and randomly divided into 5 groups which were hormal group group A（reperfusion for 6 hours），group B（reperfusion for 12 hours），group C（reperfusion for 24 hours），group D（reperfusion for 72 hours）.The cerebral ischemia reperfusion injury model was produced by the occlusion of bilateral common carotid arteries.The guinea pigs were sacrificed at reperfusion of 6，12，24，and 72 hours respectively after they received ABR tests.The pathological changes were observed by HE and the levels of GRP78 and caspase－12 protein were detected by immunohistochemistry and Western blot.Results The hearing thresholds increased gradually from the normal group to group B，and decreased gradually from group Cto group D，but the thresholds of group D were still higher than that of the normal group.HE staining showed that the neurons in the normal control group were arranged in order，the cytoplasm was abundant，large and round.The cells were stained clearly.After reperfusion，the number of neurons in each time point was decreased，the nucleus presented atrophic，fragmented，the disappeared.The expression of GRP78 and caspase－12 protein in normal control group was only a trace or a small amount by immunohistochemistry and Western blot.The expression of GRP78 and caspase－12 began to inerease.The expression of GRP78 reached the peak at reperfusion of 12 hours and decreased gradually.There were significant statistic differences between each group comparison.The expression of caspase－12 reached the peak at reperfusion of 24 hours，then decreased gradually.There was no statistic difference between group A and group B.There were significant statistic differences anong other groups.Conclusion Endoplasmic reticulum stress（ERS）may be induced by brain ischemia reperfusion injury，and can increase the expression of GRP78 and caspase－12.GRP78 and caspase－12 participate in the process of neuron apoptosis on auditory cortex caused by ERS.

Endoplasmic reticulum stress； Ischemia reperfusion injury； Apoptosis

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.013

時間：2016－6－29 16：11

R339.16

A

1006－7299（2016）04－0377－05

△ 河北省衛計委醫學科學研究基金（ZL20140118）資助

1 河北醫科大學第二醫院耳鼻咽喉科（石家莊 050000）； 2 河北省邯鄲市第三醫院耳鼻喉科

呂哲，女，河北人，醫學碩士，副主任醫師，主要研究方向為耳科疾病的基礎和臨床研究。

路虹（Email：wx_900804＠163.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1611.028.html