鼓室注射地塞米松拮抗順鉑耳毒性的研究

李鵬張奕符秋養孟慶翔謝景華梁勇

鼓室注射地塞米松拮抗順鉑耳毒性的研究

李鵬1，2張奕2符秋養2孟慶翔1謝景華1梁勇2

目的 探討鼓室注射地塞米松對順鉑致聽覺損傷的保護作用。方法 將55只豚鼠分為4組：正常對照組（I組）10只，腹腔注射生理鹽水16 ml／kg；地塞米松組（II組）15只，經鼓室注射地塞米松10 mg／ml；順鉑組（III組）15只，單次腹腔注射順鉑16 mg／kg；順鉑＋地塞米松組（IV組）15只，經鼓室注射地塞米松10 mg／ml，1小時后腹腔注射順鉑16 mg／kg。給藥前及給藥后第7天測試各組豚鼠聽性腦干反應（auditory brainstem response，ABR），并檢測耳蝸組織丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。結果 I～IV組給藥前ABR反應閾分別為28.50±4.74、28.67±5.82、26.67±4.88和27.33±5.30 dB n HL，差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥后I組和II組ABR反應閾分別為29.00±3.94和31.33±5.81 dB n HL，給藥前后差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥后III組和IV組ABR反應閾為55.33±4.81、40.67±3.72 dB n HL，均顯著高于給藥前（P＜0.05），但IV組ABR反應閾低于III組（P＜0.05）。給藥后I組MDA含量和SOD活性分別為2.01 ±0.07 mmol／L和234.10±13.09 U／ml，II組分別為2.06±0.09 mmol／L和233.20±13.24 U／ml，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05），III、IV組MDA含量分別為5.74±0.17、3.51±0.18 mmol／L，顯著高于I、II組（均為P＜0.05），但IV組MDA含量顯著低于III組（P＜0.001）；III、IV組SOD活性分別為107.90±14.21、162.70± 11.25 U／ml，明顯低于I、II組（均為P＜0.05），但IV組的SOD活性顯著高于III組（P＜0.001）。結論 鼓室注射地塞米松對順鉑耳毒性具有一定的拮抗作用。

順鉑； 耳毒性； 地塞米松

順鉑是一種常見的抗腫瘤化療藥物，其嚴重副反應有腎毒性、胃腸道毒性、耳毒性和神經毒性，大大限制了其在臨床的使用，尤其是其耳毒性尚無有效治療措施。順鉑的耳毒性表現為耳鳴和感音神經性聽力損失，早期影響高頻聽力，隨劑量增加累及言語頻率［1］，用藥后大約60%～80%的患者聽閾提高，近15%患者有嚴重的聽力障礙［2］。因此，有必要尋找既可保護聽力又不影響順鉑化療效果的防治方法。研究顯示，順鉑可刺激產生活性氧（ROS）引發細胞凋亡［3］，糖皮質激素可抑制活性氧生成，全身應用糖皮質激素已用于治療各種耳蝸功能障礙導致的聽力損失，但也可能會降低順鉑的抗腫瘤效果［4］。經鼓室局部給藥是現代治療內耳疾病的方法之一，可避免全身應用類固醇激素引起的副反應。本研究擬通過經鼓室注入地塞米松觀察其能否減少因順鉑導致的活性氧產生，從而減少耳蝸細胞的凋亡，保護內耳，為順鉑耳毒性的防治提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年豚鼠55只，體重250～350 g，耳廓反射靈敏，鼓膜完整（由廣東省實驗動物中心提供）。將動物隨機分為4組：正常對照組（I組）10只，地塞米松組（II組）15只，順鉑組（III組）15只，順鉑＋地塞米松組（IV組）15只。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物試劑 順鉑（批號H37021358，齊魯制藥廠，山東），地塞米松磷酸鈉粉劑（D4902，美國Sigma公司），丙二醛（malondiadehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2.2 給藥方法 I組動物腹腔緩慢注入生理鹽水16 ml／kg；II組動物經鼓室注射地塞米松10 mg／ml；III組動物單次腹腔注射順鉑16 mg／kg（用生理鹽水將順鉑稀釋為1 mg／ml）；IV組動物經鼓室注射地塞米松10 mg／ml，1小時后腹腔注射順鉑16 mg／kg。

腹腔注射方法：將注射針頭自下腹部刺入皮下并向前推0.5 cm，再以45度角穿過腹肌注入腹腔。

鼓室內注射方法：1%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）經腹腔注射麻醉后，將豚鼠左側臥位，使右耳朝上，在解剖顯微鏡下，使用1 ml無菌注射針頭先將右鼓膜前上方刺破一小孔（便于鼓室內空氣排出，防止在圓窗龕形成氣泡影響吸收），然后在右鼓膜八九點方向用微量注射器向鼓室內注入0.1～0.3 ml地塞米松藥液，可見鼓室內液平面不斷上升，直至從前上穿孔處溢出。注射完畢后將豚鼠繼續側臥30 min，并抬高頭部鼻側，使鼻側高于枕側，減少藥物經咽鼓管流失。操作過程中注意保溫，待動物完全清醒后放回籠中正常飼養。

1.3 聽性腦干反應（ABR）測試 給藥前及給藥后第7天測試各組動物ABR反應閾。測試前準確稱重，以1%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射麻醉后，在隔聲室中采用KeyPoint ABR測試儀進行ABR測試（右耳為測試耳）。使用銀制針形電極，將記錄電極置于豚鼠顱頂正中皮下，接地電極置于鼻尖，參考電極置于同側耳廓。耳機給聲，距外耳道口約15 mm，刺激聲為短聲（click），掃描時間10 ms，刺激頻率20次／秒，濾波范圍30～3 000 Hz，疊加1 024次。以剛能引出重復性好、穩定波III的最小聲壓級為ABR反應閾。

1.4 各組耳蝸組織中MDA含量及SOD活性檢測給藥后7天完成ABR測試后迅速處死I～IV組動物各10只，取出豚鼠的右耳耳蝸，每兩耳合為一份標本用玻璃研磨器制成10%勻漿，高速冷凍離心機離心10分鐘，取上清液用硫代巴比妥酸法測MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，測試過程按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件對數據進行統計學分析，給藥前后的比較采用配對t檢驗，四組結果的比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），進一步采用LSD方法進行兩兩比較；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組ABR反應閾比較 給藥前I～IV組ABR反應閾差異無統計學意義（P＝0.708），I組和II組給藥前后ABR反應閾無明顯變化（P＞0.05）；給藥后III組和IV組ABR反應閾較給藥前及I、II組顯著升高（P＜0.001），但IV組ABR反應閾顯著低于III組（P＜0.001）（表1）。

表1 各組動物給藥前后ABR反應閾（dB n HL，±s）

表1 各組動物給藥前后ABR反應閾（dB n HL，±s）

注：*與I、II組比較，P＜0.001；△與III組比較，P＜0.001

組別耳數（耳）給藥前給藥后I 10 28.50±4.74 29.00±3.94 II 15 28.67±5.82 31.33±5.81 III 15 26.67±4.88 55.33±4.81*IV 15 27.33±5.30 40.67±3.72*△

2.2 各組耳蝸MDA含量及SOD活性比較 給藥后I、II組MDA含量及SOD活性差異無統計學意義（P＞0.05）；III組和IV組SOD活性與I組、II比較均明顯下降（P＜0.001），但IV組SOD活性顯著高于III組（P＜0.001）；III組和IV組MDA含量較I、II組顯著升高（P＜0.001），但IV組MDA含量顯著低于III組（P＜0.001）（表2）。

表2 各組動物耳蝸MDA含量和SOD活性檢測結果

3 討論

順鉑耳毒性的發生機制目前尚不十分確切，有藥物在內耳蓄積、鈣離子紊亂、代謝障礙、凋亡等學說，目前認為順鉑耳毒性和過量的活性氧自由基的生成有關。正常情況下，耳蝸內活性氧的生成和耳蝸的抗氧化防御系統能夠維持動態平衡，應用順鉑后，順鉑與甲硫氨酸及谷胱甘肽等含巰基的蛋白質作用，致使谷胱甘肽含量降低，氧自由基生成過多，抗氧化系統被損害，耳蝸內增多的自由基不能被及時清除，使平衡被打破，從而出現氧化應激狀態［5］；大量脂質過氧化物產生后進而改變細胞膜的通透性，最后使細胞的結構和功能出現改變。因此，順鉑所致的細胞內氧自由基增多與抗氧化酶的活性下降甚至喪失是導致細胞損害的重要原因，所以推測在應用順鉑早期及時采用抗氧化治療可以抑制自由基的產生，減少氧化損傷，并改善體內抗氧化防御體系，從而減輕其耳毒性。

研究表明，外源性抗氧化劑藥物（白藜蘆醇、維生素E、褪黑素、n－乙酰半胱氨酸、水楊酸鈉、銀杏葉提取物等）能夠減輕順鉑耳毒性，主要途徑是通過清除氧自由基，然而，其中大部分藥物同時被發現可使順鉑的抗腫瘤作用減弱［6］。糖皮質激素受體在胞漿中與糖皮質激素結合，然后被激活和核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF－κB）結合，進而阻止NF－κB易位進入胞核，使之處于失活狀態，滯留于胞漿中，避免NF－κB激活后導致細胞凋亡和促炎因子iNOS、IL－1β、TNF－α的表達［7，8］；聲損傷可激活NF－κB增加炎癥因子的表達，進而損害聽覺［9］。地塞米松作為臨床上常用的糖皮質激素，其可通過抑制氧自由基生成和穩定生物膜從而減輕因缺血所致的血迷路屏障損傷［10］，還能通過下調iNOS的表達，減少NO的過量生成而抑制內耳細胞的凋亡［11］。

MDA是脂質過氧化物的裂解產物，其在機體中的含量高低可反映脂質過氧化的程度，并能間接反映自由基攻擊細胞的嚴重程度；SOD是機體內主要的抗氧化酶，可催化超氧化物陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧氣，因此能減少或清除氧自由基，在氧化與抗氧化的平衡中起著十分重要的作用。由于順鉑耳毒性與氧自由基損傷有關，故本研究通過檢測耳蝸組織中MDA含量和SOD活性，了解使用順鉑后耳蝸內氧自由基的變化，觀察地塞米松是否能降低順鉑導致耳蝸內氧自由基增加，減少細胞受損程度。從文中結果看，地塞米松組（II組）鼓室給藥前后ABR反應閾無明顯差異（P＞0.05），表明經鼓膜穿刺注入地塞米松本身不會造成豚鼠聽力損傷，與其他研究結果［12］相似；同時發現，對照組（I組）和地塞米松組耳蝸MDA含量及SOD活性無明顯差異（P＞0.05），提示地塞米松不會影響內耳氧化和抗氧化的平衡狀態。順鉑組（III組）腹腔注射順鉑后ABR反應閾和耳蝸MDA含量明顯升高，SOD活性顯著下降，表明順鉑導致耳蝸氧自由基增加，抗氧化防御系統受到破壞，提高了氧自由基攻擊內耳細胞的作用，從而造成聽覺損傷；而鼓室注射地塞米松后，再行腹腔注射順鉑的IV組盡管ABR反應閾也較用順鉑前升高，但上升幅度小于III組（P＜0.001），說明地塞米松降低了順鉑對聽覺的損傷，同時，使用順鉑后的IV組耳蝸組織中MDA含量增加的幅度及SOD活性下降程度均較III組減?。≒＜0.001），提示地塞米松一定程度上能減少脂質過氧化反應，降低耳蝸組織MDA含量，增加SOD活性，糾正失衡的氧化和抗氧化狀態，保護了內耳細胞；也有研究觀察到鼓室內注射地塞米松后能顯著增加耳蝸血流量，使氧自由基能得到及時清除［13］。文中結果顯示地塞米松并不能完全使耳蝸免于順鉑的損傷，有一定局限性，是否與順鉑耳毒性的其他機制有關有待進一步研究。

總之，鼓室注射地塞米松通過抑制脂質過氧化反應，降低耳蝸組織MDA含量、增加SOD活性，提高內耳細胞清除氧自由基的能力，可減輕順鉑導致的氧化應激狀態，達到保護內耳的作用。本研究所采用的是鼓室注射地塞米松后再腹腔注射順鉑的聯合用藥方式減輕了順鉑的毒副作用，至于地塞米松應用的最佳濃度、給藥頻率以及給藥的方式等，還需進一步研究。

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（2015－09－08收稿）

（本文編輯 雷培香）

The Protective Effects of lntratympanic Dexamethasone to Prevent Cisplatin Ototoxicity

Li Peng*，Zhang Yi，Fu Qiuyang，Meng Qingxiang，Xie Jinghua，Liang Yong
（*Department of Otorhinolaryngology，Guangzhou First People’s Hospital Guangzhou，510515，China）

Objective To investigate the effectiveness of intratympanic dexamethasone injection as a protection agent against cisplatin ototoxicity.Methods Fifty five healthy guinea pigs were randomly divided into four groups.The guinea pigs groups received（group I）0.9%NaCl solution（16 ml／kg）intraperitoneally（IP），（group II）dexamethasone（10 mg／ml）intratympanically（IT），（group III）cisplatin（16 mg／kg）only intraperitoneally（IP）and（group IV）dexamethasone（10 mg／ml）IT followed after 1h by 16 mg／kg cisplatin.Before and 7 days following injections，the ototoxic effect was measured with auditory brainstem response（ABR）.The contents of malondiadehyde（MDA）and activities of superoxide dismutase（SOD）were also measured.Results ABR thresholds before and after dosing were 28.50±4.74，29.00±3.94 dB n HL and 28.67±5.82，31.33±5.81 dB n HL in group I and group II，respectively，with no significant differences（P＞0.05）.The contents of MDA and activities of SOD were 2.01 ±0.07 mmol／L，234.10±13.09 U／ml and 2.06±0.09 mmol／L，233.20±13.24 U／ml in the group I and group II，respectively，with no significant differences（P＞0.05）.ABR thresholds after dosing were 55.33±4.81，and 40.67 ±3.72 dB n HL in the group III and group IV，which were significantly increased，but ABR thresholds in the group IV were significantly lower than that in the group III（P＜0.05）.The contents of MDA were 5.74±0.17，3.51±0.18 mmol／L in the group III and group IV，which were significantly increased.SOD activities were 107.90± 14.21，and 162.70±11.25 U／ml，which significantly decreased.Nevertheless，in the group IV dexamethasone relatively reduced the contents of MDA（P＜0.001）while increased the activities of SOD（P＜0.001）compared with group III.Conclusion Intratympanic dexamethasone injection presents as an effective treatment modality to prevent cisplatin ototoxicity without any ototoxic effect.

Cisplatin； Ototoxicity； Dexamethasone

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.014

時間：2016－6－29 16：14

R764.5

A

1006－7299（2016）04－0382－04

1 廣州市第一人民醫院耳鼻咽喉科（廣州 510515）； 2 南方醫科大學附屬南方醫院耳鼻咽喉頭頸外科

李鵬，男，四川人，副主任醫師，主要研究方向為臨床聽力學及耳顯微外科。

梁勇（Email：yliang＠fimmu.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1614.044.html