高油大豆與低油大豆油脂體組成及其穩定性的研究

梁新婷 江連洲 侯俊財 王勝男

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

高油大豆與低油大豆油脂體組成及其穩定性的研究

梁新婷 江連洲 侯俊財 王勝男

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

為研究高油大豆和低油大豆油脂體組成及乳化穩定性和氧化穩定性差異，本試驗分析了高油大豆和低油大豆油脂體基本組成、脂肪酸組成、磷脂組成、生育酚組成，同時比較了高油大豆油脂體與低油大豆油脂體乳化性及乳化穩定性、過氧化值及TBARS值。研究表明，高油大豆油脂體蛋白質含量顯著低于低油大豆油脂體(P<0.05)，而高油大豆油脂體的脂肪含量顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)；高油大豆油脂體的棕櫚酸和亞油酸含量顯著低于低油大豆油脂體(P<0.05)，而十七碳酸、油酸、二十碳一烯酸和α-亞麻酸含量顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)，高油大豆油脂體的總不飽和脂肪酸質量分數(83.08±0.05)%顯著高于低油大豆油脂體(81.86±0.12)%(P<0.05)；高油和低油大豆油脂體中腦磷脂、卵磷脂和溶血磷脂酰膽堿含量無顯著差異(P>0.05)；高油大豆油脂體中DL-α-生育酚和γ-生育酚含量顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)；高油大豆油脂體和低油大豆油脂體的乳化性無顯著差異(P>0.05)，而高油大豆油脂體的乳化穩定性顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)；14 d熱處理條件下，高油大豆油脂體的過氧化值和TBARS值均高于低油大豆油脂體。上述研究表明，高油大豆和低油大豆的油脂體之間的組成和穩定性都存在差異。

大豆油脂體 組成 熱處理 穩定性

大豆是世界上栽培最為廣泛的作物之一。也是人們膳食蛋白質的重要來源，同時大豆油消費又是世界植物油之首[1-3]。隨著人們對大豆及其制品營養價值和保健功能越來越重視，極大促進大豆加工領域科學研究與產品開發的快速發展[4-5]。

大豆種子中存在一種貯藏三酰甘油(TAGs)的亞細胞微粒，被稱作油脂體(oil body)，大豆油脂體直徑通常在0.5～2.5 μm，其內部為儲存脂類(TAGs)形成的基質，外層是由磷脂分子層及其表面附著的多種油脂體膜蛋白如油質蛋白(Oleosin)等構成[6]。油脂體最早期是由Frey-Wyssling等[7]發現，油脂體被稱為植物細胞中的“圓球體”。近年來，大豆油脂體受到越來越多的關注。Tzen等[8]對包括大豆在內的多種油料作物種子之間的油脂體組成及結構比較發現，油脂體中TAGs、磷脂與結構蛋白含量之間具有一定相關性，Kapchie等[9]研究表明不同的提取方法對大豆油脂體組成及結構也存在一定的影響，Cao等[10]分析了大豆油脂體中的的7種結構蛋白，并研究了堿性條件對結構蛋白穩定性的影響。

然而，關于高油大豆與低油大豆油脂體間組成和穩定性研究鮮有報道，因此，本研究以我國北方典型的高油和低油大豆品種，采用同種方法制備油脂體，研究二者間的油脂體組成、乳化穩定性和氧化穩定性，進一步澄清不同來源的大豆油脂體的功能性，為大豆油脂體的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高油大豆：東農47[蛋白質質量分數為(37.55±0.06)%，脂肪(20.90±0.29)%，水分(6.07±0.05)%]；低油大豆：東農42[蛋白質質量分數為(39.40±0.30)%，脂肪(18.83±0.79)%，水分(7.33±0.32)%]，數據為實測值，購于東北農業大學大豆研究所，4 ℃下貯存；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GL-21M高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；高效液相色譜儀LC-20A：日本島津有限公司；氣相色譜儀GC-7890A：美國安捷倫科技有限公司；高效液相色譜儀LC-2998：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆油脂體的提取

油脂體的提取方法參照Tzen等[11]的方法，并加以改進。將大豆種子用蒸餾水浸泡12～14 h。將浸泡之后顆粒飽滿的種子研磨后得到勻漿物，過濾。收集濾液浮選介質(含0.4 mol/L蔗糖和10 mmol/L磷酸鈉的緩沖液，pH為7.5)層疊在上層，10 000 g離心20 min。收集上層洗滌溶液(含有0.1%吐溫20、0.2 mol/L蔗糖和5 mmol/L磷酸鈉的緩沖液，pH 7.5)中，10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH為7.5)層疊在頂部，如上離心。收集上層的油脂體懸浮，浮選介質(含0.25 mol/L蔗糖、2 mol/L NaCl和10 mmol/L磷酸鈉的緩沖液，pH為7.5)層疊在頂部，如上離心；收集上層的油脂體懸浮于9 mol/L尿素中，震蕩10 min，10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)層疊在頂部，將離心管離心。收集上層的油脂體懸浮在研磨介質(含0.6 mol/L蔗糖和10 mmol/L磷酸鈉的緩沖液，pH為7.5)，離心，該步驟重復1次，收集油脂體，均質。

1.3.2 微觀結構觀察

1.3.2.1 大豆種子透射電鏡觀察

取高油和低油大豆種子分別投入到2.5%戊二醛溶液 (0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 6.8)中制作超薄切片，固定6～8 h，磷酸緩沖液沖洗后，用2%鋨酸溶液固定2 h，雙蒸餾水沖洗。丙酮梯度脫水，Epon 812環氧樹脂包埋。超薄切片經鈾、鉛雙重染色后在透射電鏡下觀察。

1.3.2.2 高油和低油大豆油脂體激光共聚焦顯微鏡觀察

采用激光共聚焦顯微鏡 LEICA TCS sp2，使用488 nm的波長激光發射器，樣品經去離子水稀釋后取適量小心地置于載玻片上，使用尼羅藍染色后顯微鏡下觀察。圖像分析使用 LEICA TCS sp2分析軟件。

1.3.3 脂肪酸含量測定

大豆油脂體脂肪酸的測定參照Nash等[12]的方法。用乙醚提取大豆油脂體中的油脂，取20 mg油脂樣品于酯化燒瓶中，進行甲酯化操作，水浴40 ℃加熱20 min，加入3 mL 正己烷溶液振蕩萃取，加入1 g無水硫酸鈉，取上層液體過膜，直接注入氣相色譜儀。進樣量為1 μL。

1.3.4 磷脂含量測定

磷脂含量測定參照Lee等[13]的方法。取0.5 g大豆油脂體樣品，稱重并倒入80 mL離心管中，35 mL 氯仿/甲醇(1∶1，V/V)加入到離心管中，4 000 g離心10 min。收集上清液，該過程重復2次。向合并的上清液中加入25 mL 0.5%的氯化鈉水溶液中，用漩渦混合儀混合2 min，導致兩相分離，用無水硫酸鈉對含有總脂質的下層有機相干燥，過濾，轉移至接收瓶中，用旋轉蒸發儀45 ℃水浴真空蒸干，得到脂質。用2 mL三氯甲烷復溶，過膜，直接注入高效液相色譜儀。

1.3.5 生育酚含量測定

大豆油脂體生育酚的測定參照Rossi等[14]的方法。用乙醚提取大豆油脂體中的油脂，準確稱重20～40 mg油脂，用2 mL正己烷復溶，直到油滴消失成為均勻的溶液，過膜，直接注入高效液相色譜儀。HPLC流動相是含0.3%異丙醇的正己烷溶液，流動速率是1.7 mL/min，波長290 nm。

1.3.6 SDS-PAGE

參照Nikiforidis等[15]的方法。根據大豆油脂體中蛋白質的含量，準確稱量一定量大豆油脂體，用0.062 5 mol/L Tris緩沖溶液(2%SDS，10%甘油，0.1%溴苯酚藍，5%-巰基乙醇)處理，煮沸2 min，經過2次凍融循環，通過離心分離得到包含蛋白(3～4 mg/mL)的下層清液，應用電泳凝膠用考馬斯亮藍G250染色。

1.3.7 過氧化值和TBARS值

油脂體懸浮液的制備：過氧化值和TBARS值測定參照Kapchie等[16]的方法。將新鮮制備的油脂體用0.1 mol/L Tris-HCl溶液稀釋。油脂體懸浮液加熱處理。定期取樣品進行過氧化值和TBARS值測定。

過氧化值測定：預先氧化的大豆油(由AOCS 1998測得過氧化值)，用來建立吸光度的標準曲線過氧化氫。油脂體懸浮液被稱重到10 mL的容量瓶中，加入5 mL氯仿/甲醇(2∶1，V/V)，定容、密封，60 μL硫氰酸銨(30%)加入到容量瓶，再加入60 μL 氯化亞鐵溶液(0.5 g 硫酸亞鐵溶解在50 mL無氧水中，再溶解水合氯化鋇0.4 g，加入2 mL 10 mol/L的HCl)，反應10 min后，測定吸光度，同時做空白對照。

TBARS值測定：將15%(m/V)三氯乙酸(TCA)和0.375%(m/V)硫代巴比妥酸(TBA)溶解在0.25 mol/L的鹽酸水溶液中，制成TCA/TBA溶液。3 mL 2%丁基化羥基甲苯(BHT)的無水乙醇溶液加入到100 mL的TCA/TBA溶液中。800 μL的油樣品和8 mL TCA/TBA溶液中加入試管中。加熱15 min。冷卻后離心。上層清液測定吸光度，用丙二醛標準品做標準曲線，同時做空白對照。

1.3.8 乳化性測定

油脂體乳化性的測定參照Pearce等[17]的方法。1 mL大豆油與4 mL 1 mg/mL 的樣品稀釋液混合，10 000 r/min均質1 min，然后靜置10 min，取靜置0 min和10 min時的玻璃容器底部的乳化液50 μL，加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中，充分混勻后使用UV-6100紫外分光光度計于波長500 nm下測量其吸光值。

乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)計算公式：

式中：A500nm為波長500 nm處的吸光值；C為蛋白質質量濃度(g/mL)；φ為油相所占體積分數(φ=1/5)；A10為靜置10 min時乳狀液的吸光值；A0為靜置0 min時乳狀液的吸光值；n為稀釋倍數為100。

1.4 統計分析

所有試驗均重復3次，采用Statistix 8.0軟件分析數據，用Tukey HSD進行平均數之間顯著性差異分析，P<0.05表示差異顯著，采用EXCEL軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 高油和低油大豆種子透射電鏡觀察

高油和低油大豆種子透射電鏡的超微結構見圖1。由圖1可見，較大體積的為蛋白質體，小油脂體排列在蛋白質體周圍，可以發現細胞內其他部分多為大油脂體。油體形狀多數為圓形或橢圓形，少數呈不規則狀。在高油大豆種子中，油脂體分布緊密，且鋪滿整個細胞，其中大油脂體數目較少。在低油大豆品種中，油脂體在細胞內分布疏松，油脂體間隙較大。另外，在高油大豆品種單個細胞內，油脂體數量明顯高于低油大豆品種。

注：Pb為蛋白質體；Ol為大油脂體；Os為小油脂體(2 000 nm)。

圖1 高油和低油大豆種子超微結構

2.2 高油和低油大豆油脂體激光共聚焦電子顯微鏡觀察

圖2為高油和低油大豆油脂體激光共聚焦電子顯微鏡圖像，富含脂肪質的部分被尼羅藍染料染色后，建立熒光強度，圖中綠色球形亮點部分即為所觀察到的大豆油脂體，與Nantiyakul等[18]觀察的水稻油脂體CLSM圖像類似，說明不同作物種子的油脂體經過稀釋染色后，微觀結構上具有一定的相似性。樣品經過稀釋至合適濃度后觀察，高油和低油2種大豆油脂體間的區別不明顯。

圖2 高油和低油大豆油脂體激光共聚焦電子

顯微鏡圖像(20 μm)

2.3 高油和低油大豆油脂體基本組成分析

高油和低油大豆油脂體基本組成成分見表1。由表1可知，高油大豆油脂體的蛋白質含量顯著低于低油大豆油脂體(P<0.05)。高油大豆油脂體的脂肪含量顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)，高油大豆油脂體和低油大豆油脂體的水分、灰分含量無顯著差異(P>0.05)。在高油大豆和低油大豆中，脂肪和蛋白質的比例分別為0.56∶1和0.48∶1，在高油和低油大豆油脂體中脂肪和蛋白質的比例分別為20.86∶1和10.46∶1，這說明大多數的蛋白質在提取過程中已經被移除，且該高油和低油大豆油脂體的比例均高于Iwanaga等[19]的4.6∶1的結果，這可能是由大豆品種的不同以及提取方法的差異導致的，Iwanaga等采用的為代碼5601T高油大豆，提取方法參照Loer等[20]，均與本試驗不同。高油大豆油脂體中脂肪和蛋白質比例高于低油大豆油脂體，一方面可能是由于在高油大豆中脂肪和蛋白質比例高于低油大豆，直接影響了油脂體中的脂肪和蛋白質的比例，另一方面可能是在提取過程中，低油大豆蛋白質含量較高，經過同樣的提取步驟，油脂體中殘留的外在蛋白較多，導致脂肪和蛋白質比例較高。

表1 高油和低油大豆油脂體基本組成成分/%

注：同列平均值右上角字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

高油和低油大豆油脂體脂肪酸組成見表2，由表2可知，在高油和低油大豆油脂體中，含量最高的脂肪酸均為亞油酸，質量分數分別為50.22%和52.21%，其次均為油酸，質量分數分別為23.94%和21.87%，該結果與Kapchie等[9]的結果相接近。高油大豆油脂體的棕櫚酸和亞油酸含量顯著低于低油大豆油脂體(P<0.05)，高油大豆油脂體的十七碳酸、油酸、二十碳一烯酸和α-亞麻酸含量顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)，高油大豆油脂體與低油大豆油脂體的硬脂酸、花生酸和二十二碳酸含量無顯著差異(P>0.05)。高油大豆油脂體的總不飽和脂肪酸質量分數(83.08±0.05)%顯著高于低油大豆油脂體(81.86±0.12)%(P<0.05)。高油和低油大豆油脂體中各種脂肪酸組成的差異可能是由高油大豆和低油大豆品種間的差異導致的[21]。

表2 高油和低油大豆油脂體脂肪酸組成/%

高油和低油大豆油脂體磷脂含量見圖3，本試驗中高油和低油大豆油脂體中磷脂總質量分數分別為0.47%和0.49%，在Tzen等[21]的研究結果0.5%～2%的磷脂含量范圍內，高油和低油大豆油脂體中含量最高的磷脂均為卵磷脂，高油和低油大豆油脂體中的腦磷脂、卵磷脂和溶血磷脂酰膽堿含量無顯著差異(P>0.05)，磷脂酰肌醇含量未檢出。

高油和低油大豆油脂體中生育酚含量見圖4，高油和低油大豆油脂體中生育酚總量分別為46.99、37.36 mg/100 g TAGs，高油和低油大豆油脂體中主要的生育酚均為 γ-生育酚和δ-生育酚。Kapchie等[16]的研究表明，γ-生育酚所占比例高達73.50%，δ-生育酚僅為1.89%，而在本試驗中，高油大豆油脂體中 γ-生育酚和 δ-生育酚所占比例分別為45.37%和52.26%，低油大豆油脂體中 γ-生育酚和 δ-生育酚所占比例分別為44.03%和54.08%，這可能與油脂體提取的方法有關，Kapchie等[16]采用的方法與本試驗有所不同。高油大豆油脂體中DL-α-生育酚和 γ-生育酚含量顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)，而 δ-生育酚含量無顯著差異(P>0.05)，這可能與大豆品種有關[21]。

圖3 高油和低油大豆油脂體磷脂含量

圖4 高油和低油大豆油脂體中生育酚含量

2.4 大豆油脂體SDS-PAGE分析

高油和低油大豆SDS-PAGE電泳圖見圖5a，由圖5可知，高油和低油大豆SDS-PAGE圖譜顯示分子質量～25 ku的頻段，可能屬于大豆蛋白質中的2 S。低油大豆的條帶強度明顯強于高油大豆，這可能是由于低油大豆中蛋白質含量較高導致的。高油和低油大豆油脂體SDS-PAGE電泳圖見圖5b，由圖5可知，高油和低油大豆油脂體SDS-PAGE電泳4個主要頻段對應的分子質量約為17、18、24、34 ku，依據Tzen等[8]和Nikiforidis等[15]的研究結果，大豆油脂體中油質蛋白的分子質量為15～26 ku，因此，本試驗圖譜中約為17、18、24 ku可能均屬于大豆油脂體中的油質蛋白的部分，其余條帶可能屬于大豆油脂體提取過程中殘留的外在蛋白(β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白等)[22-23]，它們不能被認為真的是吸附于油脂體的表面蛋白，因為它們并沒有滲透到吸附的表面膜內，而且通過各種水相介質可以將它們洗除，它們的存在可以作為包括主要的磷脂-蛋白質混合層在內的，第2個非吸附的表面層，有助于改善大豆油脂體在貯藏期間抗聚結的穩定性[24-26]。圖5低油大豆油脂體的條帶強度明顯高于高油大豆油脂體的條帶強度，可能是由低油大豆油脂體中較高的蛋白質含量造成的。

圖5 SDS-PAGE電泳圖

2.5 高油和低油大豆油脂體乳化性及乳化穩定性比較

高油和低油大豆油脂體乳化性見圖6，高油和低油大豆油脂體的乳化性分別為(70.32±1.23) m2/g和(68.50±2.32) m2/g，高油大豆油脂體和低油大豆油脂體的乳化性無顯著差異(P>0.05)，高油和低油大豆油脂體乳化穩定性見圖7，高油和低油大豆油脂體的乳化穩定性分別為(31.04±1.55)%和(19.76±4.39)%，高油大豆油脂體的乳化穩定性顯著高于低油大豆油脂體(P<0.05)。Pearce等[17]的研究表明，對于一種蛋白質的乳化能力很可能與濃乳液在高剪切下的穩定性有關，而與在分散液中通過有限數量的蛋白質就能穩定的油脂的數量無關。因此高油和低油大豆油脂體中脂肪的含量高低沒有起到決定性的作用，大豆油脂體蛋白質的組成[10]以及乳液濁度很可能是高油大豆油脂體乳化穩定性較高的原因[17]。

圖6 高油和低油大豆油脂體乳化性

圖7 高油和低油大豆油脂體乳化穩定性

2.6 高油和低油大豆油脂體過氧化值和TBARS

高油和低油大豆油脂體過氧化值見圖8，由圖8可知，高油大豆油脂體和低油大豆油脂體0 d的過氧化值均為0.07 mmol/kg，無顯著差異(P>0.05)。高油和低油大豆油脂體過氧化值均在貯藏第2天有微小升高，在2～14 d逐漸降低，高油大豆油脂體的過氧化值始終高于低油大豆油脂體的過氧化值。高油和低油大豆油脂體丙二醛(MDA)含量見圖9，本試驗中以丙二醛(MDA)含量作為TBARS值的衡量指標。高油和低油大豆油脂體0 d 的丙二醛(MDA)含量均為1.03 μg/mL，高油和低油大豆油脂體在第2天都有微小升高，在其他時間點保持平穩，且在2～14 d內，高油大豆油脂體的丙二醛含量均低于低油大豆油脂體的丙二醛含量。由于氧化形成的氫過氧化物和二級氧化產物丙二醛的含量均處于較低的水平，說明高油和低油大豆油脂體即使在14 d加熱貯藏的條件下也具有較好的氧化穩定性，可能是由于油脂體本身的特殊結構，外層穩定的油質蛋白層保護了易氧化的不穩定成分不受反應的氫過氧化物的影響，降低氧的滲透率，也可能是由于大豆油脂體中殘留的蛋白、磷脂比油脂體優先氧化，同時存在于大豆油脂體中的天然抗氧化劑也可能是大豆油脂體高氧化穩定性的關鍵原因[16,27]。

圖8 高油和低油大豆油脂體過氧化值

圖9 高油和低油大豆油脂體TBARS值

3 結論

本研究發現，高油大豆油脂體脂肪含量顯著高于低油油脂體(P<0.05)，蛋白質含量顯著低于大豆油脂體(P<0.05)，在脂肪酸、磷脂、生育酚的組成上均存在一定的差異性。高油大豆油脂體比低油大豆油脂體具有更高的乳化穩定性。高油大豆油脂體和低油大豆油脂體都具有較好的氧化穩定性。研究結果可以為大豆油脂體應用于食品、藥品等領域提供理論依據和技術參考，具有一定實際的意義。

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The Composition and Stability of Oil Bodies from High Oil Soybean and Low Oil Soybean

Liang Xinting Jiang Lianzhou Hou Juncai Wang Shengnan

(Food College of Northeast Agricultural University, Haerbin 150030)

In order to study on the composition,the emulsification stability and oxidation stability of oil body from high oil soybean (OBHOS) and oil body from low oil soybean (OBLOS), this study analyzed the composition, fatty acid profiles, the concentration of phospholipids, and tocopherol of OBHOS and OBLOS, and evaluated emulsification and emulsion stability, the value of PV and TBARS of OBHOS and BOLOS at the same time. The study showed that the protein content of OBHOS was significantly lower than that of OBLOS (P<0.05), however the fat content of OBHOS was significantly higher than that of OBLOS (P<0.05); The palmitic acid and linoleic acid contents of OBHOS were significantly lower than that of OBLOS (P<0.05). The concentrations of C17∶0, C18∶1n9c, C20∶1n9, and C18∶3n3 of OBHOS were significantly higher than those in OBLOS (P<0.05). The total unsaturated fatty acid content of OBHOS(83.08±0.05)%was higher than that of OBLOS (81.86±0.12)%. There were no difference in PE, PC, L-PC contents between OBHOS and OBLOS (P>0.05). The concentrations of DL-α-tocopherol and γ-tocopherol in OBHOS were significantly higher than those in OBLOS (P<0.05). There were no significant difference in emulsification between OBHOS and OBLOS; while the emulsification stability of OBHOS was significantly higher than that of OBLOS (P<0.05). The PV and TBARS value of OBHOS were higher than those of OBLOS with heating treatment for 14 days. The study indicated that there were difference in composition and stability between OBHOS and OBLOS.

soybean oil body,composition,heating treatment,stability

TS221

A

1003-0174(2016)10-0011-07

國家自然科學基金(31371784)，黑龍江省博士后科研啟動金(LBH-Q13015)

2015-01-28

梁新婷，女，1993年出生，碩士，食品工程

侯俊財，男，1975年出生，教授，糧食、油脂與植物蛋白工程