酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝中酒精發酵生酸原因解析與控制

王柯，楊圣乾，張建華，毛忠貴

1(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝中酒精發酵生酸原因解析與控制

王柯1, 2，楊圣乾1, 2，張建華1, 2，毛忠貴1, 2

1(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

在酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝中，將沼液和酒糟的混合水回用于酒精發酵過程，可有效解決傳統酒精生產工藝存在的能耗大、廢水處理成本高的問題。但是產業化應用中，該工藝會引起酒精發酵生酸較高。本文對造成這一問題的原因進行了研究，并探索了相應的解決方案。結果表明，沼液和酒糟混合、儲存過程中，沼液中的產酸菌能夠吸收利用酒糟中的營養物質快速生長并生成大量揮發性有機酸。產酸菌會對釀酒酵母產生競爭性抑制作用，而揮發性有機酸則會對釀酒酵母產生毒害作用。通過向沼液中加入適量的克菌靈可有效殺滅產酸菌，延緩混合水的酸化，從而消除對酒精發酵的影響。

酒精發酵；釀酒酵母；厭氧消化；揮發性有機酸；克菌靈

燃料乙醇作為一種可再生和環境友好型的生物質燃料，其產業在近幾十年來得到了迅猛的發展[1]。但是燃料乙醇產業也面臨著廢水處理成本高的嚴峻挑戰[2]。針對廢水的處理，學者們展開了廣泛的研究，其主要目標是同時實現廢水中能量的回收和水的再利用，如廢水直接回用、單細胞蛋白(SCP)/生物制品生產、耕地灌溉等等，但是這些技術存在著能耗大、處理不徹底等問題[3-6]。因此，目前生產上仍然主要采用“固液分離-厭氧消化-好氧消化-深度處理-排放”的處理工藝(圖1a)。該工藝存在投資大、占地面積多、能耗高、浪費水資源且難以達到國家排放標準等問題，不僅影響了企業的經濟效益，同時造成了嚴重的環境污染。為了解決廢水處理這一難題，我們提出了“酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝”[7-8]。在該工藝中，首先利用厭氧消化工藝處理酒糟廢水，該過程可將酒糟廢水中的大部分有機物降解，降低廢水化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)并產生沼氣。沼氣供給高壓鍋爐替代煤炭，通過“熱電聯產”技術獲得蒸汽和電力，回供于生產中的各個工序；處理后的沼液回用于酒精發酵過程，整體技術構成一個閉路循環工藝圈。該工藝可顯著降低生產過程能源和水資源的消耗，避免廢水的排放，消除污染。但是，沼液成分非常復雜，其中含有較多的有機物和無機鹽，當其回用于酒精發酵時，可能會對酒精發酵產生負面影響。研究中發現，當沼液中含有較高濃度的丙酸時，酒精發酵受到明顯的抑制[9]。因此，對于耦聯工藝，需要保證厭氧消化的穩定高效運行，使沼液中丙酸的含量處于較低的水平。另外，由于沼液含有較高的堿度，即具有較強的緩沖能力。當其回用配料時，就需要添加硫酸以調節料液的pH至6.0(液化酶的最適pH)，這就向酒精發酵培養基及后續的酒糟中引入了硫酸根離子。厭氧消化過程中硫酸鹽會被硫酸鹽還原菌還原為硫化氫，腐蝕反應器且增加沼氣純化成本，高濃度硫化氫還會毒害釀酒酵母，抑制酒精發酵[10]。為了解決這個問題，我們將部分酒糟(含有較低pH)與沼液混合，從而降低回用水的pH，避免了硫酸的使用(圖1b)[11]。

該耦聯工藝的可行性已在小試和中試水平上得到了驗證，目前正在實際生產中試用。在實際應用中發現，酒精發酵的生酸幅度明顯高于傳統工藝(新鮮水配料)，且酒精產率也有所降低。本研究對造成這一現象的原因進行了解析，并提出了相應的解決方案。

圖1 傳統木薯酒精干磨工藝(a)與酒精-沼氣雙發酵耦聯生態系統(b)流程圖Fig.1 Process diagrams of conventional cassava ethanol process(a) and integrated ethanol-methane fermentation ecosystem (b)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

釀酒酵母(S.cerevisiae)，湖北宜昌安琪酵母有限公司；木薯，河南天冠企業集團有限公司；沼液和酒糟，河南天冠企業集團有限公司；α-淀粉酶(100 000 IU/mL)和糖化酶(10 000 IU/mL)，無錫杰能科有限公司；其它試劑均為分析純或優級純市售商品。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒精發酵種子培養

種子培養基組成：葡萄糖(20 g/L)，酵母膏(8.5 g/L)，NH4Cl (1.3 g/L)，MgSO4·7H2O (0.1 g/L)，CaCl2(0.06 g/L)，pH自然，0.08 MPa滅菌15 min。將酵母接種于含有200 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，放于搖床上，100 r/min和30 ℃條件下培養18 h。

1.2.2 液化液制備與酒精發酵

將木薯粉(平均粒徑約0.4 mm)和配料水按1∶3(g∶mL)的比例混合，用NaOH或H2SO4溶液調節料液pH至6.0，加入耐高溫α-淀粉酶(10 IU/g木薯粉)后，將料液加熱至95 ℃并維持1 h。然后降溫至室溫，添加去離子水彌補液化過程水分損失。121 ℃滅菌15 min。降溫后加入尿素(0.05%，w/v)、糖化酶(130 IU/g木薯粉)和種子培養液(10%，v/v)，啟動發酵。發酵溫在度控制30 ℃，發酵周期為48 h。定期測定CO2生成量(該方法用于丁酸對酒精發酵影響的研究)。

1.2.3 分析方法

乙酸、丙酸、丁酸、甘油、乳酸、乙醇采用高效液相色譜法(HPLC，Dionex，U-3000，USA)測定。色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm，Hercules，CA)；RI檢測器(Shodex RI-101，Japan)和UV檢測器(Dionex，USA)；流動相為5 mmol/L H2SO4；柱溫65 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL。樣品預處理：發酵液離心(10 000×g，10 min)后，上清液經0.2 μm膜過濾，取濾液用于HPLC分析。酵母細胞數采用血球板計數法測定。采用SPSS Statistics 19(IBM，USA)進行方差分析(Fisher’s least significant difference，LSD)，當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 產業化中耦聯工藝與傳統工藝中酒精發酵生酸及酒精濃度對比

分別比較了傳統工藝和耦聯工藝條件下連續20批次的酒精發酵的酸度和酒精度。結果表明，與傳統工藝比較，耦聯工藝中酒精發酵結束后酸度較高，并且隨著耦聯工藝的進行酸度逐漸升高，而平均酒精度相對較低(圖2)。通過對混合水儲罐中混合水中揮發性有機酸(volatile fatty acids，VFAs)的跟蹤監測發現，其濃度處于較高水平(圖3)。這可能是由于混合水在儲罐中存留的時間內，其中所含產酸菌(沼液和酒糟中都含有產酸菌)利用混合水中的營養物質進行生長繁殖，并產生VFAs。另外，隨著工藝的持續進行，儲罐的罐壁上會黏附產酸菌并不斷增殖，使得混合水中VFAs的濃度不斷增加。當這樣的混合水用作酒精發酵配料水，其中的產酸菌就會對釀酒酵母產生競爭性抑制作用，而VFAs則會對釀酒酵母產生毒害作用。具體表現為，在低pH條件下，乙酸、丙酸等揮發性有機酸以未解離狀態存在，他們通過細胞膜上Fps1p(一種水-甘油跨膜輸送蛋白)介導的協助擴散方式進入酵母細胞[12]。在胞內高pH(接近中性)環境下，解離為相應的鹽和質子，造成細胞質酸化，從而抑制胞內代謝反應[13]。另外致死濃度下，乙酸會引起胞內ROS積累，線粒體中細胞色素c釋放，線粒體功能紊亂和細胞凋亡蛋白質活力增加，并最終導致細胞死亡(程序性細胞死亡)[14]。所以這些VFAs會進一步造成發酵污染雜菌、酸度升高及酒精度下降。

圖2 不同工藝對酒精發酵生酸和酒精度的影響Fig.2 Effect of different process on the acidity and ethanol concentration in the ethanol fermentation

圖3 耦聯工藝運行過程中混合水中VFAs變化趨勢Fig.3 VFAs concentrationsof the mixture in the integrated process

為了證明上述推測，分別取沼液和酒糟進行混合(60%沼液+40%酒糟，pH6.10)，并將混合水在55 ℃水浴中保溫(儲罐內混合水溫度約50～60 ℃)，每隔2 h取樣測定VFAs濃度。結果如圖4所示。隨著保溫時間的延長，混合水中VFAs濃度呈現明顯的上升趨勢并在14 h時達到最大值(3 200 mg/L)，是初始濃度的10倍以上。這一結果說明，混合水在儲罐中存留的時間內，確實會有產酸菌的生長繁殖，并產生大量VFAs。

圖4 保溫過程混合水中VFAs變化趨勢Fig.4 VFAs concentrations in the mixture during the heat preservation process

2.2 混合水酸化原因的探究

為了探究混合水酸化的原因，需要對產酸菌的來源以及其生長所需的營養來源進行檢測。因此分別將沼液、酒糟和混合水置于55 ℃水浴中保溫，每隔4 h取樣檢測，觀察不同水樣甘油和有機酸隨時間變化趨勢，結果如圖5所示。在55 ℃水浴保溫過程中，單獨的沼液和酒糟不會產生VFAs，而對于混合水，在較短的時間內所含VFAs濃度迅速升高，平均生成速率達到了116.5 mg/(L·h)，出現了明顯的酸化現象(圖5e)。造成這種現象的原因可能是沼液中含有產酸菌，但是缺乏其生長繁殖所需要的營養物質，而與酒糟混合后，酒糟為產酸菌提供了生長所需的營養物質。同時接近中性的pH以及50～60 ℃的環境條件有利于微生物的快速繁殖；另外也有可能是酒糟中含有雜菌(酒精發酵過程中不可避免會污染雜菌)，但是酒糟較低的pH以及缺少氮源等條件抑制了雜菌的生長，當與沼液混合后為雜菌生長提供了適宜的條件，從而導致混合水酸化現象。當然，也有可能是兩類菌共同作用的結果。從圖5a和圖5d可以看出，在混合水保溫過程中，來源于酒糟中的甘油和乳酸濃度不斷下降，說明酒糟中的甘油、乳酸等有機物可作為產酸菌生長所需的營養物質被消耗；另外在酒糟保溫過程中乳酸濃度有所增加，說明酒糟仍然含有具有活性的產乳酸菌。由圖5b和圖5c可知，混合水酸化過程中主要的揮發性有機酸是乙酸和丁酸，在水浴保溫4 h后乙酸和丁酸濃度開始增加，在16～28 h時丁酸占總揮發性有機酸含量的80%以上，說明丁酸是產生的最主要的揮發性有機酸。

圖5 保溫過程混合水、沼液和酒糟中甘油和有機酸的變化Fig.5 Change of the glycerol and organic acids of the mixture, digestate and stillage during the heat preservation process

為了深入了解混合水酸化對酒精發酵的影響，研究了丁酸對釀酒酵母生長和代謝的影響。實驗中，向配料水(自來水)中添加不同濃度的丁酸(0～2 000 mg/L)，配制酒精發酵培養基，接種后進行酒精發酵。從圖6可以看出，當丁酸濃度高于500 mg/L時，發酵速率和酵母細胞數都有明顯下降，且隨著丁酸濃度的增加，發酵結束后的酵母細胞數呈現出不斷下降的趨勢。

圖6 丁酸對酒精發酵的影響(圖b中不同的字母表示數值間有顯著性差異)Fig.6 Effect of butyric acid on the ethanol fermentation (Different letters in Fig.b for the same indicator meant significant difference)

這說明丁酸可以顯著抑制釀酒酵母的生長代謝，當然混合水中產生的乙酸也會對釀酒酵母產生一定的毒害作用。這也就說明酸化的混合水回用時，會抑制釀酒酵母的生長代謝，使得發酵液中雜菌表現出更強的生長優勢，從而導致酒精發酵酸度升高，酒精產量下降。

為了查明產酸菌的來源，實驗中分別將沼液和酒糟徹底滅菌(121 ℃，30 min)，并配置不同的混合水(60%沼液+40%酒糟)，即沼液+酒糟、滅菌沼液+酒糟、沼液+滅菌酒糟，將這些混合水在55 ℃水浴中保溫，每隔4 h取樣檢測，觀察不同水樣中VFAs隨時間變化趨勢，實驗結果如圖7所示。由圖7可以看出，在沼液未滅菌條件下混合水在保溫過程中出現了VFAs濃度大幅度升高現象；沼液經滅菌后，混合水在水浴保溫過程中沒有出現VFAs累積現象，說明導致混合水酸化的產酸菌主要來源于沼液，而酒糟為這些產酸菌長提供了充足的營養物質。

圖7 不同配料水中VFAs在保溫過程中的變化Fig.7 Change of theVFAs of different mixture during the heat preservation process

2.3 克菌靈對混合水酸化的抑制

在酒精生產過程中，克菌靈是常用的殺菌或抑菌劑。它是通過抑制細菌細胞壁的合成來發揮抑菌作用。細菌細胞壁的結構成分主要是胞壁粘肽，由N-乙酰葡萄糖胺和與五肽相連的N-乙酰胞壁酸重復交替聯結而成。胞壁粘肽的合成分為胞漿內、胞漿膜與胞漿外3個階段?？司`能阻礙直鏈十肽二糖聚合物在胞漿外的交叉聯接過程。它的作用靶位是胞漿膜上的結合蛋白，通過抑制轉肽酶的轉太作用，從而阻礙交叉聯接，阻礙細胞壁合成，導致細菌細胞壁缺損[15]。酵母細胞壁的主要成分是甘露聚糖、葡聚糖、蛋白質和幾丁質，因而克菌靈不會抑制酵母細胞。所以實驗中選擇克菌靈來抑制混合水的酸化。

分別向沼液中加入0、3、6和9 mg/L的克菌靈，然后將沼液與酒糟(60%沼液+40%酒糟)，混合水置于55 ℃水浴中保溫，每隔4 h取樣進行檢測，觀察混合水中VFAs變化情況，結果如圖8所示。

圖8 克菌靈對混合水酸化的影響Fig.8 Effects of the Kejunling on the acidification of the mixture

克菌靈可延緩混合水酸化的時間，并且隨著克菌靈濃度的增加，酸化的時間也不斷增加。當克菌靈濃度為9 mg/L時，混合水出現酸化的時間已延長到16 h。說明克菌靈在一定時間內可有效抑制混合水中的酸化菌，防止混合水的酸化。但是超過一定時間后，混合水的酸化仍然不可避免的發生。因此，在實際生產中，在添加適量克菌靈的前提下，需要合理控制混合水在儲罐中的停留時間，并定期對儲罐及管道進行清洗消毒，以防止混合水的酸化。

3 結論

酒精-沼氣雙發酵耦聯工藝在產業化應用中會造成酒精發酵生酸較高，酒精產率下降。造成這一問題的原因是沼液和酒糟在混合、儲存的過程中，沼液中的產酸菌能夠吸收利用酒糟中的營養物質(甘油、乳酸等)快速生長繁殖，并產生大量揮發性有機酸，這些有機酸以丁酸為主，而丁酸會顯著抑制釀酒酵母的生長代謝。另外，產酸菌也會對釀酒酵母產生競爭性抑制作用。通過向沼液中添加適量的克菌靈可有效延緩混合水的酸化，通過控制混合水在儲罐中的停留時間，并定期對儲罐和管道進行清洗消毒，可防止混合水的酸化，并達到緩解酒精發酵升酸的目的。

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Analysis and control of acidity production in ethanol fermentation during integrated ethanol and methane fermentation process

WANG Ke1,2, YANG Sheng-qian1,2, ZHANG Jian-hua1,2, MAO Zhong-gui1,2

1 (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2 (School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In the integrated ethanol and methane fermentation process, the mixture of digestate and stillage was reused as process water for the ethanol fermentation, thereby the problems of massive energy consumption and high cost for wastewater treatment faced by ethanol production process was resolved. However, in the industrial application, this integrated process caused high level of acidity production in the ethanol fermentation. In this study, reasons for this problem were explored and corresponding strategies were chosen. Results showed that in the mixing and storing process of digestate and stillage, the acidogenic bacteria in digestate could utilize the nutrient substances contained in stillage to grow and produce a mountain of volatile fatty acids (VFAs). These acidogenic bacteria could out-competeSaccharomycescerevisiaefor substrates, and the VFA could cause toxicity toS.cerevisiaeas well. Adding moderate amount of Kejunling to digestate could kill acidogenic bacteria and delay acidification of the mixture of digestate and stillage, thereby eliminating their effect on the ethanol fermentation.

ethanol fermentation;Saccharomycescerevisiae; anaerobic digestion; volatile fatty acids; Kejunling

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612002

博士研究生，講師(王柯為通訊作者，E-mail: kewang@jiangnan.edu.cn)。

工業生物技術教育部重點實驗室“現代工業生物技術高效開發與應用”專項科研項目子項目(JUSRP51504)；生物燃料技術國家重點實驗室開放課題(KFKT2014001)

2016-08-24，改回日期：2016-09-14