谷氨酸脫羧酶基因工程改造研究進展

靳春鵬，楊套偉，徐美娟，張顯，饒志明*

1(國家知識產權局專利局專利審查協作北京中心, 北京, 100081) 2(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(如皋)食品生物技術研究所，江蘇 如皋，226500)

谷氨酸脫羧酶基因工程改造研究進展

靳春鵬1，楊套偉2,3，徐美娟2，張顯2，饒志明2,3*

1(國家知識產權局專利局專利審查協作北京中心, 北京, 100081) 2(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(如皋)食品生物技術研究所，江蘇 如皋，226500)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種具有重要生理功能的天然氨基酸，廣泛應用在醫藥、食品、化工等行業。利用谷氨酸脫羧酶催化法合成GABA因其反應條件溫、對環境友好和原料易得已成為當前研究的熱點。該研究論述了催化合成GABA關鍵酶谷氨酸脫羧酶的分子改造、基因工程菌構建等研究進展。

谷氨酸脫羧酶；γ-氨基丁酸；分子改造；重組菌構建

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種具有重要生理功能的天然氨基酸，具有降低血壓、鎮靜安神、增進腦活力、增強記憶等功能，在醫藥、食品保健、化工等行業具有廣泛應用前景[1-2]。其合成方法主要包括：化學合成法[3]、植物富集法[4]和生物合成法[5-6]?；瘜W合成法因其反應條件較為劇烈，且常用到有毒催化劑等，限制了其應用范圍。植物富集法因植物生長周期長，受資源和環境限制等因素，因此，該方法并不能應用于GABA大量合成。微生物法因反應條件溫和、對環境友好等具有顯著的優點，因此，利用微生物生產GABA具有廣闊的應用前景。

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase, GAD，EC4.1.1.15)的主要功能是催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧合成GABA，廣泛分布于微生物和動植物等各種有機體活細胞中[7]。微生物具有分布廣、生長速度快、以及不受資源、環境等限制，是生物酶的重要來源。為了提高GABA合成效率，研究者對GAD進行了大量研究，包括篩選獲得了不同來源的GAD，并對GAD進行分子改造和修飾研究。

本文首先概述了不同來源的GAD，并比較了其部分酶學性質；繼而綜述了目前對GAD的分子改造，即提高GAD催化活力、熱穩定性，和拓展GAD在偏中性環境中的催化活力和催化效率方面的研究狀況；隨后，概述以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構建及應用的研究進展。最后，討論了在棒桿菌中構建以廉價底物葡萄糖為底物發酵生產GABA的重組菌株，以便為工業化生產GABA提供了新的方向。

1 谷氨酸脫羧酶

1.1 不同來源的谷氨酸脫羧酶

本文概述了不同來源的GAD，并對其部分酶學性質進行了比較。由表1可知，GAD來源比較廣泛，人們不但對微生物中的GAD進行研究，在谷物、甚至水果中的GAD也有大量研究。不同來源的GAD在酶學性質上存在一定的差異。大部分的GAD最適作用pH偏酸性環境，一般在4.0～6.0之間，而當環境pH>6時，GAD活力急劇下降，甚至完全喪失催化活性。極少數來源的GAD最適作用pH偏堿性環境，如P.horikoshii來源的GAD最適作用pH為8.0。大部分的GAD最適作用溫度在37～50 ℃，很少來源GAD最適作用溫度在50 ℃以上，目前報道的最耐熱的GAD來源于P.horikoshii，其最適作用溫度可以達到97 ℃。另外，由表1可以看出，不同來源的GAD對底物谷氨酸/谷氨酸鹽的親和力存在較大差別，甚至同一屬來源的GAD對底物谷氨酸/谷氨酸鹽的親和力也存在比較大的差別?？傮w而言，微生物來源的GAD比植物來源的GAD對底物谷氨酸/谷氨酸鹽具有更好的親和力。

一般來說，激活劑能夠顯著提高酶的活力以及催化效率。因此，大量研究者對GAD的激活劑進行了篩選研究。如表1所示，磷酸吡哆醛(PLP)是谷氨酸脫羧酶一個輔助因子，但是并不是所有來源的GAD都需要PLP參與，這無疑可以降低生產成本。另外，研究發現，Ca2+是GAD最通用的激活劑，其能激活大部分來源的GAD活力。Mg2+, Mn2+甚至 Li+和Ba2+也可以作為GAD的激活劑。而在生產研究過程中，則要求盡可能少地加入額外的物質，以便降低生產成本，因此，對PLP、金屬離子等激活劑依賴較低的GAD將是工業生產中首選的對象。

表1 不同來源的谷氨酸脫羧酶及其部分酶學性質

1.2 谷氨酸脫羧酶分子改造研究

一般情況下，在酶催化工業中，要求酶具有較高的催化效率，同時最適作用pH為中性環境，以便減少酸堿加入量，降低生產成本。因此，研究者對GAD的分子改造一般集中在2個方面，1是提高GAD催化活力或熱穩定性，2是拓展GAD在偏中性環境中的催化活力和催化效率。

1.2.1 基于提高GAD催化活力或熱穩定性的研究

目前，關于提高GAD酶活力的研究報道較少。LIN等[34]通過易錯PCR對短乳桿菌來源的GAD進行隨機突變，篩選獲得1個酶活力比原始GAD提高1.2倍的突變體Q51H；在此基礎上對51位進行飽和突變，并為獲得比突變體Q51H活力更高的突變體。而在進行N端缺失的試驗中，他們發現第88位的天冬氨酸和N端區域對GAD的活力和正確折疊起到決定性作用。為了GAD 的催化活力或熱穩定性，柯丕余等通過分析短乳桿菌GAD1407三維模擬結構的拉氏圖，確定K413為GAD1407不穩定氨基酸殘基位點，并對該位點進行定點突變獲得2個突變體K413A 在50℃的半衰期是原始酶的2.1倍，而突變酶K413I 熱穩定性沒有明顯的提高，但其酶活力是野生酶的1.6倍。

1.2.2 基于拓寬GAD酶催化pH作用范圍的研究

據大多數文獻報道(表1)，GAD作用pH一般在4.0～6.0之間，而當環境pH>6時，GAD活力急劇下降，甚至完全喪失催化活性。較低的pH，在酶催化過程中需要加入無機鹽作為緩沖劑，這無疑增加生產成本和下游提取費用；而催化底物谷氨酸和谷氨酸鈉在酸性環境中的溶解度都較低，不利于GAD的催化反應進行和GABA的高效合成。因此，大部分學者就如何拓寬GAD的pH作用范圍開展了大量研究。

PENNACCHIETTI等[35]發現，當對465位的His進行突變時，GadBH465A和GadBΔHT活性位點的“鎖”不能形成，而突變體pH作用范圍明顯向堿性拓展，因此，他們推測His465并非GAD的活性位點，對該位點進行突變，并沒有使其失活而是改變了酶的構型，該位點對整個構型的協調性是必須的。

KANG等[36]構建了大腸桿菌來源的GAD△466突變體，改突變體催化活力和pH作用范圍均得到大幅提升。

THU等[37]發現，E.coli來源的GAD在pH6.0時基本完全喪失活力，而刪除該GAD的C末端15個氨基酸殘基 (Δ452～466) 時，突變體GAD(Δ452～466)的pH作用范圍向堿性偏移的1個pH，該突變體在pH7.0時基本完全喪失活力。突變體 Glu89Gln/Δ452～466的pH作用范圍繼續向堿性偏移的0.5個pH，其在pH7.5時基本完全喪失活力。Glu89Gln/His465Ala在pH8.5時基本完全喪失活力，但是其pH4催化活力比原始酶降低了25%。

林玲等[38]發現來自短乳桿菌CGMCC NO．1306的谷氨酸脫羧酶(GADl407)催化pH范圍較窄(4.2～5.2)，當pH大于5.0以后，隨著pH的增大酶活性急劇下降。與擬南芥GADl的氨基酸序列進行比對，發現了一個影響GAD1407催化pH特性的關鍵位點：S307。通過對這個位點進行飽和突變并篩選，最終確定S307N拓寬了該酶催化的最適pH范圍。

De BIASE等[39]對改變GAD的pH作用范圍進行了總結，他們發現，GAD有3個區域與pH作用范圍有關，1是N端前15位氨基酸，2是C端347～466位氨基酸，3是300～313位點，這些位點位在PLP主要結合區域組成了一個-發夾結構。

2 以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構建及應用研究

在酶催化工業中，人們通常希望酶的生產者具有高效合成具有優良工業屬性的酶催化劑，而對于GAD的合成也是如此。而自然界中的天然GAD生產者，要么所產天然GAD特性不適合工業化生產要求，要么GAD產量和生產效率比較低等問題。對于酶的特性改造，我們已經在前一部分進行了綜述，而在這一部分我們將概述以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構建及應用的研究進展，具體研究情況如表2所示。

表2 利用基因工程菌合成GABA

2.1 大腸桿菌

大腸桿菌因其生長速度快，遺傳背景清晰以及分子操作技術成熟等優點，在基因工程領域已被廣泛應用。研究者構建了GAD過表達的大腸桿菌基因工程菌，并開展了GABA合成研究。

張天萌等[40]將來源于Lactococcuslactissubsp．lactisIL1403的GAD基因通過pET-22b(+)質粒為載體克隆至E.coliBL21(DE3)中，構建了基因重組。重組菌GAD的活力比原始菌株有明顯提高；原始菌轉化5 h，底物轉化率為55.8%，而重組菌0.5 h時的底物轉化率就達到了98.3%。

王期等[41]將E.coliBL21(DE3)來源的GAD通過pET-28a(+)質粒為載體自身中過量表達，重組菌E.coliK. 12中GAD活力比原始菌提高了60倍。工程菌1.15 U粗酶液以31 g/L的L-谷氨酸鈉為底物，反應4 h，L-谷氨酸鈉的轉化率為93%。

田靈芝等[15]將來源于植物乳桿菌GB 01-21的GAD基因通過pET-22b(+)質粒為載體克隆至E.coliBL21(DE3)中，GAD成功在大腸桿菌E.coliBL21 (DE3) 中高效誘導表達，為植物乳桿菌GB 01-21中GAD 酶活的4.24倍。將該重組菌應用于轉化L-谷氨酸生產GABA，最終5 L 發酵罐上進行轉化實驗，批次添加底物L-谷氨酸共600 g，轉化24 h，GABA 累計濃度可達204.5 g/L，摩爾轉化率為97.92%，為其工業化應用打下了良好的基礎。

LE VO等[42]將谷氨酸脫羧酶GadA和GadB分別與谷氨酸/GABA反向轉運體GadC進行不同形式的融合表達，發現GadA和GadC融合體催化活性最高，以10 g/L谷氨酸鈉為底物，可以獲得5.65 g/L的GABA，轉化率達到93%。

KANG等[36]構建了大腸桿菌來源的GAD進行突變獲得突變體GADΔ466，該突變體催化活力和pH作用范圍均得到大幅提升，在無緩沖液體系中，利用改突變體進行催化合成GABA，3 h獲得1 mol的GABA，合成效率達到34.3 g/(L·h)。該方法反應體系中無需添加無機鹽作為緩沖試劑，有利于降低下游操作工序和成本。

2.2 枯草芽孢桿菌

芽孢桿菌遺傳背景清楚，蛋白質分泌機制健全，生長迅速，培養簡單，不產內毒素，適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌。莫征杰等[49]將LactobacillusplantarumZJ3443來源的GAD編碼基因lapgad通過質粒pMA5導入到BacillussubtilisWB600系統中，實現了GAD基因在的B.subtilis異源重組表達，其胞內酶活達到0.35 U/mg。并考察了重組菌全細胞轉化谷氨酸生產γ-氨基丁酸的最佳轉化條件：溫度為37 ℃，pH為4.5，添加1 mmol/L Ca2+作為激活劑。

丁偉等[50]從大腸桿菌來源的GAD基因gadB導入枯草芽孢桿菌168，構建了1株高表達GAD 的枯草桿菌，然后通過發酵條件的優化，使得發酵酶活提高了188.8%，確定了最佳發酵參數，為利用枯草芽孢桿菌生產GABA 奠定了基礎。

2.3 乳酸菌

乳酸菌是GAD主要生產菌株，但其天然GAD活力較低。為了提高乳酸菌催化合成GABA能力，KOOK等[44]將L.plantarumATCC 14917 GAD基因通過穿梭載體pTRKH2導入到L.sakeiB2-16中。重組菌L.sakeiB2-16的GABA產量265.3 mmol/L，比原始菌提高了1.42倍。雖然乳酸菌催化生產安全性高，但發酵培養困難、成本高、GABA產量低。

2.4 釀酒酵母

酵母菌具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養簡單，外源基因表達系統完善，遺傳穩定，且生產安全性較高。烏云達來等[51]將釀酒酵母28的GAD1基因通過質粒pUG6在自身體系中進行過表達研究，結果發現，重組菌GAD酶活力比菌株28提高73.8%。通過以上實驗結果得出結論，GAD基因高表達菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性，但并未用于催化合成GABA研究。

2.5 谷氨酸棒桿菌

谷氨酸棒桿菌是氨基酸工業常用生產菌株，尤其在谷氨酸生產中被廣泛利用。SHI等[45]將L.brevisLb85來源的GAD基因gadB2、L-谷氨酸/GABA逆向轉運體基因gadC和上游調控基因gadR在谷氨酸棒桿菌中成功共表達，以谷氨酸為底物，重組谷氨酸棒桿菌pDXW-8/gadRCB2發酵72 h，GABA濃度僅為2.15 g/L。為了提高重組谷氨酸棒桿菌合成GABA效率，SHI等[46]隨后將L. brevis Lb85來源的GAD基因gadB1和gadB2在谷氨酸棒桿菌中進行共表達，相比于單表達一個GAD基因，共表達2個GAD基因的重組菌GABA產量提高了1倍，最終，搖瓶發酵120 h，GABA產量達到27.13 ± 0.54 g/L，發酵罐培養60 h，GABA產量達到26.32 g/L, GABA產率為0.60～0.74 mol/mol。

3 廉價底物合成GABA研究

谷氨酸是GABA合成常用的底物，而谷氨酸發酵一般是以棒桿菌為生產菌株發酵代謝葡萄糖實現，因此，為降低生產成本，研究者嘗試在棒桿菌中構建以葡萄糖為底物發酵生產GABA的重組菌株。

TAKAHASHI等[47]將E.coliW3110來源的GAD導入谷氨酸棒桿菌中，獲得一種能以葡萄糖為底物直接發酵法合成GABA的重組菌，該菌株能在72 h內以葡萄糖為底物生產12.37±0.88 g/L的GABA，生產強度達到0.172 g/(L·h)。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶G調控三羧酸循環進入谷氨酸合成途徑的關鍵酶2-酮戊二酸脫氫酶活力，因此，OKAI等[48]在上述基礎上，為了提高谷氨酸合成途徑中2-酮戊二酸脫氫酶活力活力，他們敲除了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶G的編碼基因pknG，獲得1株重組谷氨酸棒桿菌GADΔpknG；在發酵培養基中添加0.1 mmol磷酸吡哆醛(PLP)，該菌株可以在120 h內以100 g/L葡萄糖為底物發酵合成31.1 ± 0.41 g/L的GABA，生產強度達到0.259 g/(L·h)，GABA產率達到0.893 mol/mol葡萄糖。

孫紅梅等[52]將來自于植物乳桿菌γ-氨基丁酸合成途徑的關鍵酶谷氨酸脫羧酶基因(lpgad)在產谷氨酸菌株鈍齒棒桿菌中進行整合表達，通過重疊PCR 的方法獲得鈍齒棒桿菌精氨酸合成途徑關鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶( NAGK) 基因內部缺失型基因ΔargB，獲得1株能以葡萄糖為底物發酵合成γ-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌；發酵96 h，重組菌可合成約8.28 g/L 的GABA，且發酵液無精氨酸積累。

ZHANG等[5]通過系統代謝工程技術改造谷氨酸棒桿菌，首先通過插入突變技術，將帶tac啟動子的GAD編碼基因tacgad導入谷氨酸棒桿菌argB和proB基因內部，在引入GAD的同時阻斷L-精氨酸和L-脯氨酸合成途徑。隨后將帶tac啟動子的PLP合成關鍵酶基因tacplk插入dapA內部，在引入PLP合成關鍵酶的同時阻斷L-賴氨酸合成途徑，最終獲得1株無需添加PLP既能高效合成GABA的重組谷氨酸棒桿菌。通過發酵流加實驗，該菌株能夠在70 h內以葡萄糖為底物發酵合成70.6 g/L的GABA，這是目前報道的利用葡萄糖一步法合成GABA的最高產量。

4 結論與展望

目前，生物法合成GABA主要包括酶轉化法和微生物發酵法。酶催化法合成GABA通常以谷氨酸為底物，通過GAD一步催化合成GABA，相對于發酵法，步驟單一，反應體系成分簡單。不足之處是酶需要分離獲得、且反應過程不能持久，采用固定化細胞可以提高批次使用效率[53]，但是其催化效率偏低，有待進一步篩選固定化材料和方法。另外，GAD作用pH偏酸性，需要加入無機鹽維持最適催化環境，增加了生產附加成分。本文重點概述了拓展GAD在偏中性環境中的催化活力和催化效率方面的研究狀況，GAD有3個區域與pH作用范圍有關，1是N端前15位氨基酸，2是C端347～466位氨基酸，3是300～313位點，這些位點位在PLP主要結合區域組成了一個-發夾結構，對這些位點進行分子改造，有利于拓寬GAD在偏中性環境中的催化效率。

微生物發酵法合成GABA通常采用谷氨酸為底物，本文概述以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構建及應用的研究進展，覆蓋了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和谷氨酸棒桿菌。接著討論了在棒桿菌中構建以葡萄糖為底物發酵生產GABA的重組菌株，避免了谷氨酸為原料的附加成本，更加廉價，為工業化生產GABA的研究目標提供了新方向。但是，GABA前體谷氨酸生產條件一般控制在偏中性環境，而GAD催化的pH范圍在4～6之間，這就會因前后兩個途徑所需環境不同而導致GABA合成效率較低。為解決這一矛盾，YANG等[7]C.glutamicum和L.plantarum雙階段發酵葡萄糖合成GABA，并取得了良好的結果，但是GABA產量還無法和酶催化法相媲美。另外，發酵法由于其發酵液中成分復雜，對下游分離提取造成不小的負擔。因此，結合GAD分子改造策略，開發能在偏中性環境中高效利用葡萄糖生產GABA的生產菌株，和開發GABA簡單、有效的分離提取策略和裝置，將有望成為今后重點研究的方向。

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Genetically engineered modification of glutamate decarboxylase

JIN Chun-peng1, YANG Tao-wei2,3, XU Mei-juan2, ZHANG Xian2, RAO Zhi-ming2,3

1 (Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office, SIPO, Beijing 100190, China) 2 (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3 (Jiangnan University (Rugao) Food Biotechnology Research Institute, Rugao 226500, China)

γ-Aminobutyric acid (GABA) is a kind of important non-protein amino acid. GABA can be used as a bioactive component in pharmaceutical, food, and chemical fields. The advantages of enzymatic synthesis of GABA are mild reaction conditions, simple operational procedure and easily available raw material. So, enzymatic synthesis of GABA by glutamate decarboxylase (GAD) has attracted growing attention in recent years. This review summarizes various strategies for molecular modification of GAD and construction of genetic engineered strain.

glutamate decarboxylase; γ-aminobutyric acid; molecular modification; construction of recombinant strain

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612039

碩士,助理研究員(楊套偉為共同第一作者，饒志明教授為通訊作者，E-mail: raozhm@jiangnan.edu.cn)。

國家高技術研究發展計劃(863計劃) (2015AA021004)；江蘇省杰出青年科學基金(BK20150002)；江蘇省自然科學基金(BK20161292)；江蘇高校優勢學科建設工程

2016-06-15，改回日期：2016-07-28