帶魚腸道中抑菌性乳酸菌的篩選和抑菌效應分析

董韓博，謝晶，錢韻芳，劉永吉

(上海海洋大學 食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)

帶魚腸道中抑菌性乳酸菌的篩選和抑菌效應分析

董韓博，謝晶*，錢韻芳，劉永吉

(上海海洋大學 食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)

為尋找海產品源生理性狀優良、抑菌效果明顯的乳酸菌，采用牛津杯法以熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)為指示菌，研究從帶魚腸道中初篩出的18株乳酸菌的抑菌效果，其中有6株乳酸菌抑菌效果明顯，LB4、LB10、LB18、LBb1、LBb3屬于肉食桿菌屬，為Carnobacterium maltaromaticm，而LB1和Carnobacterium gallinarum有較高的同源性。以水產品中常見的腐敗菌和致病菌檢測這6株菌的抑菌譜，研究發現這6株菌對熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、肉食桿菌(Caronbacterium sp.)有明顯的抑菌效果，但對腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophytics)和大腸桿菌(Escherichia coli)的抑制效果不顯著。研究中篩選到的帶魚腸道肉食桿菌屬乳酸菌對水產品中部分常見的腐敗菌和致病菌有明顯的抑菌效果，可作為一種潛在的生物拮抗保鮮菌劑應用于水產品低溫貯運過程中。

帶魚；腸道；抑菌活性；肉食桿菌；篩選

乳酸菌是目前廣泛應用于食品，被普遍認為安全的一類微生物(generally recognized as safety, GRAS)。近幾年來作為一種新穎的微生物源生物保鮮劑，乳酸菌的應用價值引起公眾廣泛的關注，其在代謝過程中能夠產生乳酸、苯乳酸、環二肽、H2O2、抗菌肽等物質，能明顯抑制銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等水產品中常見腐敗菌和致病菌的生長繁殖[1-2]。鑒于乳酸菌產生的抗菌物質天然、強抗菌性、安全等特點[3]，開發其為微生物源生物保鮮菌劑具有潛在優勢。目前國內乳酸菌的篩選來源主要為陸生生物、腌菜、牛奶等，從海生生物中篩選乳酸菌的研究較少，SOLTANI等[4]通過生理生化和16S rRNA分子生物學分析從波斯鱘腸道中分離得到的47株乳酸菌，其中乳球菌屬是優勢乳酸菌，包括格式乳球菌和乳酸乳球菌，其他還有戊糖片球菌、糞腸球菌等。海生生物與陸生生物相比，由于生活環境的差異，兩者具有許多不同的生理特性，進而其腸道內微生物的代謝途徑不同，因此探索和發現海生生物腸道中作用獨特、效果良好的產抗菌物質的乳酸菌源，以應用于水產品低溫貯藏運輸方面，具有很廣闊的市場應用前景[5]。

帶魚(Trichiurus haumela)是中國最重要的海洋經濟魚種之一，肉質細膩、味道鮮美，具有很高的營養價值[6]。由于營養豐富，在運輸和貯藏加工過程中，很容易引起腐敗變質。其中腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌等是引起帶魚腐敗變質的主要腐敗菌[7]。目前，添加食品防腐劑是降低微生物和酶活性、延長水產品保質期的重要途徑之一，但是人工合成的防腐劑不僅對水產品的風味、品質帶來不良影響，并且可能隨水產品一起被人體攝取，而過量攝入可能會對人體健康產生不良影響。乳酸菌是一類國際公認安全微生物及歐盟認定的具有安全推廣資質微生物，具有潛在的抑菌保鮮功能，在天然防腐的商業領域具有巨大的開發潛力[1,2,8]。然而以乳酸菌作為生物拮抗保鮮劑應用在水產品保鮮中的研究還鮮有報道。本實驗以帶魚腸道為來源篩選乳酸菌，并研究其抑菌效果和抑菌譜，為開發新型耐低溫乳酸菌保鮮劑提供研究思路和理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和菌株

鮮帶魚：2015年7月、10月購于上海市浦東新區蘆潮港碼頭水產市場，捕獲后立即冰藏條件下30 min內送到實驗室進行實驗。解剖時體表完好，腸道完整，無明顯食糜。

指示菌株：革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、肉食桿菌(Caronbacterium sp.)；革蘭氏陰性菌：腐敗希瓦氏菌(Shewanellu putrefaciens)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大腸桿菌(Escherichia coli)，均為本實驗室保存。

培養基：MRS固體培養基、MRS肉湯、TSB培養基、TSA培養基、TSB-YE培養基。

1.1.2 主要試劑和藥品

革蘭氏染色液試劑盒，青島海博生物技術有限公司；細菌DNA基因組提取試劑盒，青島海博生物技術有限公司；過氧化氫，青島海博生物技術有限公司；常規生化鑒定管，青島海博生物技術有限公司；溴甲酚紫；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離

帶魚腸道的處理：無菌取帶魚腸道，用無菌手術剪刀充分剪碎，加入含有5 mL的生理鹽水和玻璃珠的50 mL的錐形瓶中，搖床振蕩30 min混勻，靜止一段時間，制成原液，吸取1 mL用作梯度稀釋。

乳酸菌的分離：取原液和10-1，10-2二個稀釋梯度涂布于添加了溴甲酚紫的MRS固體培養基中，每個稀釋度涂布4個平板，分別在有氧和無氧條件下，30 ℃培養72 h，挑取能夠使平板由紫色變為黃色的單菌落，在MRS平板和TSA平板上劃線分離，傳代劃線培養3～4次直至純化。對每株菌進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗后，選擇革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌株，-20 ℃保存。

1.2.2 抑菌性乳酸菌的初篩

采用牛津杯法初步篩選具有抑菌活性的乳酸菌[9-10]。將活化后菌種以2%接種量接種于TSB-YE液體培養基中，在30 ℃下靜止培養32 h。接2 mL發酵液12 000 r/min離心10 min，取上清液4 ℃保存，備用。在TSB液體培養基中分別接種熒光假單胞菌、金黃色葡萄球菌，30 ℃過夜培養。取1 mL培養液梯度稀釋，取500 μL稀釋度為10-3的菌液均勻涂布在TSA平板中，再在無菌條件下將牛津杯(內徑為6 mm，外徑為8 mm)均勻放置在平板上，稍微輕輕下壓，使其與平板培養基接觸面無空隙，然后吸取0.2 mL發酵液于杯中，30 ℃培養24 h，觀察其是否有抑菌圈，明確其抑菌能力。

1.2.3 活性菌株的抗菌譜作用

以水產品中常見的致病菌和腐敗菌：腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等為指示菌，通過牛津杯法檢測活性菌株的抑菌作用，方法參考1.2.2。

1.2.4 活性菌株的生理生化鑒定

參照凌代文[11]主編的《乳酸菌分類鑒定和實驗方法》中的生理生化實驗，對所獲得的活性菌株進行生理生化實驗以鑒定其種屬。

1.2.5 活性菌株的分子生物學鑒定和分析

DNA的提?。簩⒒钚跃暧肨SB液體培養基活化兩次，用液體培養基培養到對數期。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌種的DNA，提出后的DNA，放置-20 ℃備用。

乳酸菌16S rDNA的PCR擴增與測序：以提取的細菌基因組DNA為模板，利用擴增細菌16S rDNA的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA)，對乳酸菌的16S rDNA進行PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；然后94 ℃變性45 s、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后，將目標條帶進行純化后送生物生工工程(上海)有限公司進行測序[11]。

活性菌株的同源性分析：將所得序列在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對分析。

2 結果和分析

2.1 乳酸菌的分離與純化

從帶魚腸道中共分離得到26株乳酸菌疑似菌株(如圖1所示)，然后分別采用MRS平板和TSA平板對26株菌進行劃線分離純化，獲得純化的乳酸菌疑似菌株。對分離得到的疑似乳酸菌進行編號：LB1～LB18，LBb1～LBb9。經過革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，其中18株疑似乳酸菌接觸酶實驗陰性、革蘭氏染色實驗呈現陽性，其中革蘭氏染色結果：16株桿菌(88.9%)，2株球菌(11.1%)，桿菌占主導地位，排列方式為單個、成對或短鏈(表1)。為進一步地篩選活性菌株，對這18株菌進行下一步抑菌活性篩選實驗。

圖1 含溴甲酚紫MRS平板篩選疑似乳酸菌Fig.1 Screening and isolating the suspected lactic acid bacteria by the method of the MRS plate with bromocresol purple

菌株編號菌落形態鏡檢結果LB1白色光滑、扁平、邊緣整齊、圓形φ=1～3mmG+桿菌LB3乳白色、邊緣整齊、凸起有光澤、圓形φ=1～2mmG+桿菌LB4白色透明、有光澤、圓形φ=1～3mmG+桿菌LB9黃色光滑凸起、有光澤、圓形φ=1～2mmG+桿菌LB10灰白色光滑凸起、有光澤、圓形φ=1～25mmG+桿菌LB11乳白色光滑、邊緣整齊、有光澤、圓形φ=3～4mmG+桿菌LB12乳白色光滑、有光澤、圓形φ=2～3mmG+桿菌LB13白色光滑凸起、有光澤、透明、不規則圓形φ=2～3mmG+桿菌LB16灰白色凸起、邊緣整齊、圓形φ=1～2mmG+桿菌LB17白色光滑凸起、有光澤、邊緣整齊φ=4～5mmG+桿菌LB18白色圓形、有光澤、透明、邊緣整齊φ=1～25mmG+桿菌LBb1白色光滑凸起、整齊、透明、不規則圓形φ=1～3mmG+桿菌LBb2灰白色光滑、透明、邊緣整齊φ=1～2mmG+桿菌LBb3乳白色光滑、邊緣整齊、有光澤φ=1～3mmG+桿菌

2.2 抑菌活性疑似乳酸菌的篩選

從18株乳酸菌中初步篩選有抑菌活性的菌株。如圖2所示。18株菌中大部分疑似乳酸菌對金黃色葡萄球菌(S. aureu)有明顯的抑菌效果，對熒光假單胞菌(P. fluorescens)的抑菌效果微弱。其中6株乳酸菌株LB1、LB4、LB10、LB18、LBb1、LBb3對熒光假單胞菌(P. fluorescens)和金黃色葡萄球菌(S. aureu)都具有明顯的抑制效果，其中以LB1的抑制效果最為明顯。

2.3 具有抑菌活力疑似乳酸菌的鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

根據凌代文的《乳酸菌分類鑒定和實驗方法》，確定對水產品中常見腐敗菌有明顯抑菌效果的LB1、LB4、LB10、LB18、LBb2、LBb3這6株乳酸菌的種屬關系。這6株菌在MRS平板上菌落微小，生長不良，在TSB平板上生長良好，結合部分生理生化實驗初步判定這6株菌屬于肉食桿菌屬，LB10為游動肉食桿菌(Caronbacterium mobile)，其他5種菌株為魚肉食桿菌(Caronbacterium piscicola)，見表2。

表2 生理生化鑒定結果

2.3.2 16S rRNA分子生物學鑒定和同源性分析

根據以上抑菌活性菌株初篩結果，選取對水產品中腐敗菌有明顯抑菌能力的疑似乳酸菌株LB1、LB4、LB10、LB18、LBb1、LBb3等進行16S rRNA分子鑒定。圖3為6株疑似菌株的16S rDNA擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。從圖3中可以觀察到，該6株菌在1 500 bp均出現了1條熒光亮帶，并且無明顯拖尾現象，符合測序要求。

圖3 部分疑似乳酸菌株16S rRNA PCR擴增圖譜Fig.3 16S rRNA amplification patterns of the suspected Lactic acid bacteria

測序結果及相似性觀察。登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)官網，選取明顯抑菌效果的LB1、LB4、LB10、LB18、LBb1、LBb3等6種菌株的16S rRNA測序結果與數據庫進行BLAST同源性相似分析，比對結果顯示LB4、LB10、LB18、LBb1、LBb3和Carnobacterium maltaromaticm有99%的同源性，而LBb1和Carnobacterium gallinarum有99%的同源性。從GenBank中選取有代表菌株的16S rDNA序列，用N-J法進行系統發育樹分析(圖4)，確定這6株具有明顯抑菌效果的菌屬分類。LB4和Carnobacterium maltaromaticm LMA28處于同一個分支上面，LB4、LB10、LB18、LBb1、LBb3和Carnobacterium maltaromaticm有較高的相似性，因此這5株菌可能是同一種菌株。趙鴨美等[13]研究水產品腸道中乳酸菌的抑菌特性時，采用牛津杯法以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等為指示菌，抑菌活性菌株中乳球菌屬、腸球菌屬占主導地位，分別占41.9%、27.9%。但是本研究篩選出的抑菌性菌株主要為肉食桿菌屬。

圖4 菌株LB1、LB4、LB10、LB18、LBb2、LBb3依據16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of LB1，LB4，LB10，LB18，LBb2，LBb3 constructed based on 16S rDNA sequence analysis

2.4 活性菌株的抑菌譜作用

本研究又進一步檢測了從帶魚腸道中得到的6株抑菌活性菌株對水產品中部分主要腐敗菌的抑制效果。由下表3可知，乳酸菌對不同的指示菌有不同程度的抑制效果。6株屬于肉食桿菌屬的LB1、LB4、LB10、LB18、LBb2、LBb3對水產品中的常見腐敗菌熒光假單胞菌(P. fluorescens)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、肉食桿菌(Caronbacterium sp.)等具有明顯的抑制效果，LB1的抑菌活性最為顯著，而對腐敗希瓦氏菌(S. putrefaciens)、大腸桿菌(E. coli)、腐生葡萄球菌(Staph. saprophytics)抑制效果不明顯，與RING等[14]的研究結果相似。

表3 株疑似乳酸菌的抗菌活性

注：牛津杯內徑 6.0 mm外徑 8.0 mm； +++：抑菌圈直徑﹥20 mm；++：抑菌圈直徑：14～20 mm；+：抑菌圈直徑：<14 mm；-：無抑菌活性

3 討論

3.1 水產品腸道肉食桿菌的分離

乳酸菌往往被認為是水產品的亞優勢種群，種類豐富。從水產品腸道中分離乳酸菌，國內外有很多報道，繆璐歡等[15]從鯉魚、草魚等6種淡水魚腸道中分離到44株乳酸菌，采用牛津杯打孔法以大腸桿菌為指示菌篩選出兩株拮抗活性較強的2株乳酸菌，經生理生化和分子生物學鑒定為清酒乳桿菌(Lb. sakei)和植物乳桿菌(Lb. Plantarum)。鄧梅等[16]研究新疆冷水魚腸道耐低溫乳酸菌的多樣性時，從新疆冷水魚中篩選出43株疑似乳酸菌株，經過16S rRNA分子生物學分析，其中腸球菌屬是優勢菌屬占總菌數比例最大。RING等[14]從大西洋鮭魚、嘉魚等四種魚腸道中篩選出11株乳酸菌株，經過表型分析和16S rRNA分析鑒定，其中7株為肉食桿菌屬中的C. piscicola，3株為C. divergens，并且分析了它們對水產品致病菌的抗菌特性。肉食桿菌能夠產生許多有效拮抗水產品中腐敗菌和致病菌的I-類抗菌肽和II-抗菌肽。但國內關于水產品中分離篩選有抑菌效果的肉食桿菌的研究還較少。本實驗2次從帶魚腸道中共篩選出26株疑似乳酸菌株，以熒光假單胞菌和金黃色葡萄球菌為指示菌初篩出18株有一定抑制效果的疑似乳酸菌，根據16S rRNA分子鑒定結果，其中肉食桿菌屬占主導，還包括乳球菌屬、腸球菌屬等。不同水產品中分離到的優勢乳酸菌菌屬存在差異，這可能與品種及目標魚種生長環境(帶魚)有關[14-15]。

3.2 肉食桿菌的抗菌特性

耐低溫的乳酸菌在低溫儲藏條件下有更好的生長活性，能夠產生有明顯抑菌效果的抗菌肽，在食品的低溫保藏中具有很廣的應用前景[17-19]。MARTIN等[20]研究表明，Carnobacterium maltaromaticum UAL307的發酵液對一些革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、李斯特菌屬等有不同程度的抑制，試驗中表示其主要有效成分為IIa類細菌素，其中2種被稱為piscicolin 126和carnobacteriocin BM1。TULINI等[21]研究從魚中篩選出的Carnobacterium maltaromaticum C2所產的抗菌肽的提純和特征描述時，所獲得的肉食桿菌素和肉食細菌溶素能夠有效地抑制Pseudomonas aeruginosa ATCC 14502、Staphylococcus aureus ATCC 29213和Listeria innocua ATCC 33090等腐敗菌和致病菌的生長。

本文研究了帶魚腸道源乳酸菌的抑菌活性和抑菌譜，從篩選出的26株疑似乳酸菌中共分離到6株具有明顯抑菌活性的菌株： LB1、LB4、LB10、LB18、LBb2、LBb3。通過部分生理生化實驗可以初步判斷LB10為游動肉食桿菌(Caronbacterium mobile)，其他5種菌株為魚肉食桿菌(Caronbacterium piscicola)。經16S rRNA分子鑒定和同源性相似分析結果，LB4、LB10、LB18、LBb1、LBb3和Carnobacterium maltaromaticm有99%的同源性，而LBb1和Carnobacterium gallinarum有99%的同源性。分子鑒定結果和生理生化結果存在一定的差異，根據細菌鑒定原則，當分類鑒定出現差異時，以分子鑒定結果為主，形態、生理生化鑒定結果為輔[22]。6株菌對熒光假單胞菌(P. fluorescens)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、肉食桿菌(Caronbacterium sp.)有明顯的抑菌效果；對腐敗希瓦氏菌(S. Putrefaciens)、腐生葡萄球菌(Staph. saprophytics)等沒有明顯的抑菌效果，其中LB1的抑菌效果更好。因此篩選出能夠具有明顯抑菌效果的耐低溫乳酸菌應用于生物保鮮是一種必要。肉食桿菌能夠在0 ℃生長，最適宜的生長溫度為25～30 ℃，能夠產生抑制水產品中常見致病菌和腐敗菌的抑菌物質，可作為潛在有效的乳酸菌拮抗保鮮劑。

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Screening and identification of lactic acid bacteria with antibacterial activity derived fromTrichiurushaumelaintestine

DONG Han-bo, XIE Jing*, QIAN Yun-fang, LIU Yong-ji

(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In order to obtain Lactic acid bacteria which may display antibacterial effects against the spoilage and pathogenic bacteria and can be used as preservatives for the preservation of aquatic products, six strains with significant antagonistic effects againstPseudomonasfluorescensandStaphyloccocusaureuswere isolated from eighteen suspected strains of lactic acid bacteria. Strains LB1, LB4 and LB18 were identified asCaronbacteriummaltaromaticm, while strains LB10, LBb1 and LBb3 had high similarities withCarnobacteriumgallinarumvia the physiological and biochemical analysis and 16S rRNA sequencing. The results of antibacterial spectrum showed that the six bacterial strains had obvious antagonistic effects against Pseudomonas fluorescens, Staphyloccocus aureus and Caronbacterium sp., but their antagonistic effect against Shewanella putrefaciens, Staphylococcus saprophytics and Escherichia coli were not obvious. Therefore, theCarnobacteriumspp. from theTrichiurushaumelaintestine has obvious antagonistic effects against the spoilage and pathogenic bacteria in aquatic products, which may be used as potential biological-source antagonistic preservatives during low-temperature storage and transportation of aquatic products.

Trichiurushaumela; intestine; antibacterial activity;Caronbacteriumsp.; screening

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612006

碩士研究生(謝晶教授為通訊作者，E-mail：jxie@shou.edu.cn)。

2014年國家農業成果轉化資金項目(2014GB2C000081)；上海市科委平臺能力提升項目(16DZ2280300)

2016-05-10，改回日期：2016-08-05