雙歧桿菌的分子生物學鑒定方法的比較

熊強，王延斌，韓浩

(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，210009)

雙歧桿菌的分子生物學鑒定方法的比較

熊強*，王延斌，韓浩

(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，210009)

利用實驗室設計的雙歧桿菌特異性引物，采用降落聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)的方法對供試菌株的16S rDNA進行擴增，比較細菌分別通用引物和雙歧桿菌特異性引物對雙歧桿菌屬不同菌株及參考菌株擴增效果的影響。實驗結果表明，細菌通用引物對不同雙歧桿菌進行擴增，擴增出來的條帶不清晰，而用雙歧桿菌特異性引物進行擴增，擴增出來的條帶清晰。因此，該方法可以準確地鑒定雙歧桿菌，為雙岐桿菌的鑒定提供了理論依據。

雙歧桿菌；聚合酶鏈式反應；分子生物學；鑒定

雙歧桿菌是1899年巴斯德研究院的TISSIER博士首先在以母乳喂養的嬰兒糞便中發現并分離出來的[1]。它是常見的人體腸道菌群中的重要成員[2]，作為一類重要的益生菌，雙歧桿菌在人體內可以維持腸道內正常微生物的菌群平衡，防止致病菌的入侵與定植；作為B類維生素的良好來源，可以在腸道中合成VB1、VB2、VB6、VK等多種維生素和各種氨基酸；其的生理和代謝特征可以在癌癥腸道疾病、糖尿病、肥胖病以及其他疾病的治療方面起到良好的效果[3-7]。

以微生物的形態結構和生理生化特征等表型特征為依據的傳統微生物分類鑒定方法存在步驟繁瑣、耗時且準確度不高的問題。20世紀90年代出現了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增16S rRNA分析的技術，16S rRNA中有多個區段具有保守性，可以根據這些保守區設計細菌通用引物，此外16S rRNA具有適宜的長度、良好的進化保守性，所以成為了細菌分子鑒定的標準標識序列[8-11]。

本研究利用實驗室自主設計的雙歧桿菌特異性引物，采用降落聚合酶鏈式反應的方法對供試菌株的16S rDNA進行擴增，比較了細菌通用引物和雙歧桿菌特異性引物對雙歧桿菌屬不同菌株及參考菌株擴增效果的影響，為雙岐桿菌分子生物學鑒定提供了依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

長雙歧桿菌(CICC6068)、短雙歧桿菌(CICC6079)、兩歧雙歧桿菌(CICC6168)、青春雙歧桿菌(CICC6070)，購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；雙歧桿菌B4，B13，B17，B21，B23，B24及大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線菌、乳雙歧桿菌為實驗室保存；細菌通用引物購自南京金斯瑞生物技術有限公司；ExTaqDNA聚合酶，DNA Marker，基因組抽提試劑盒，膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒均購自大連寶生物(TaKaRa)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR反應體系(25 μL)

基因組模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，10×ExTaqbuffer(Mg2+free) 2.5 μL，ExTaq0.3 μL，ddH2O 15.7 μL。

1.2.2 大腸桿菌感受態E.coilDH 5α的制備

將活化后的大腸桿菌E.coilDH 5α培養液按0.1%的接種量接入到新鮮的LB培養基中，37 ℃劇烈振蕩培養1～3 h；將培養的OD600值小于0.5的菌液分裝到1.5 mL的離心管中，放置于冰上約10 min，然后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min回收細菌；除盡離心管中的上清，然后每管中加入1 mL預冷的CaCl2(0.1 mol/L)洗滌細菌，混懸，并在冰上放置30 min，再次離心后回收細菌；往回收的細菌中加入0.2 mL的0.1 mol/L的CaCl2懸浮細胞振蕩，冰浴20 min后就將制備的感受態細胞懸液保存于-70 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 質粒轉化感受態細胞

向盛有50 μL感受態細胞懸液的離心管中加入5 μL的目的DNA，輕輕混勻后在冰中靜置30 min；將上述離心管放置到42 ℃的水浴中60～90 s，然后快速將離心管轉移到冰浴中2～3 min；向離心管中加入900 μL的無菌LB液體培養基(不含抗生素)，混勻后在37 ℃的搖床中以150 r/min振蕩培養45 min；培養結束后吸取100 μL的培養物涂布于含有抗生素的LB固體培養上，37 ℃，倒置培養12～16 h。

1.2.4 TA克隆

在冰盒上，將膠回收得到的PCR產物4 μL、溶液Ⅰ5 μL與pMD18-T 1 μL混合均勻，然后在Thermomixer comfort混勻器上16 ℃連接過夜，然后將質粒轉化的感受態細胞E.coilDH 5α涂布于Amp抗性平板上，在37 ℃恒溫培養箱中培養12～16 h，挑出單菌落在含有Amp的LB液體培養基中培養，用質粒抽提試劑盒提取質粒DNA并測序，將測序結果輸入NCBI中用Blast工具進行同源性分析。

2 結果與分析

2.1 利用細菌通用引物進行PCR擴增

利用通用引物對長雙歧桿菌和本實驗室篩出的雙歧桿菌進行PCR擴增，通過對PCR反應進行優化，選擇退火溫度為55 ℃，延伸溫度和時間分別為72 ℃、1 min，通用引物的序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′ ；1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，通用引物由南京金斯瑞生物技術有限公司合成，擴增結果見圖1。

1-長雙歧桿菌標準菌株；2-青春雙歧桿菌標準菌株；3-兩歧雙歧桿菌標準菌株；4-短雙歧桿菌標準菌株；5～7-分別為菌株B4、B13、B17；M-DL2000Marker圖1 利用細菌通用引物進行PCR的結果Fig.1 The result of the Bacterial universal primers for PCR

結果表明，細菌通用引物應不適合雙歧桿菌的特異性擴增，即使提高退火溫度，延長延伸時間，將ExTaq換為保真性更高的Prime STAR HS DNA Polymerase, PCR結果仍然不理想，這可能和雙歧桿菌的基因序列有關：雙歧桿菌16S rRNA基因序列的高度相似之處[12]，利用細菌通用引物容易發生錯配。因此在利用PCR方法鑒定雙歧桿菌時應根據其16S 區域或16S～23S的保守序列進行引物設計。

2.2 雙歧桿菌特異性引物設計

根據NCBI中已知的雙歧桿菌的16S rDNA特異性序列，參考文獻并利用軟件Primer Premier 5.0[13-14]，根據擴增預期結果在550 bp和1 400 bp處分別設計了相應的引物：上游引物Lm3r：5′-CGGGTGCTACCCACTTTCATG-3′，下游引物Im26：5′-GATCCTGGCTCAGGATGAACG-3′；上游引物g-Bifid-R：5′-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3′，下游引物g-Bifid-F：5′-CTCCTGGAAACGGGTGG-3′；引物由南京金斯瑞生物技術有限公司合成。

2.3 利用雙歧桿菌特異性引物進行PCR擴增

2.3.1 PCR退火溫度的確定

利用長雙歧桿菌標準菌株(CICC6068)進行梯度PCR以選擇最適退火溫度，將退火溫度分別設為49、51、53、55、57、59 ℃，其余的條件不變進行PCR擴增，結果見圖2。

1～6-菌株B4的退火溫度分別為49、51、53、55、57、59 ℃；M-DL2000Marker圖2 長雙歧桿菌梯度PCR擴增結果Fig.2 The result of the gradient PCR Methods of B.longum

結果顯示，長雙歧桿菌標準菌株在進行PCR擴增時，退火溫度在57 ℃和59 ℃能夠擴增出片段，而且片段長度在1 400 bp左右，大小與預期結果一致，因此選擇57 ℃為后續PCR試驗的退火溫度。

2.3.2 標準菌株的PCR擴增

分別通過擴增片段長度在550 bp和1 400 bp的雙歧桿菌特異性引物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線菌、雙歧桿菌B4、長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌進行PCR擴增，擴增結果見圖3。

1-大腸桿菌；2-枯草芽孢桿菌；3-乳酸菌；4-放線菌；5-乳雙歧桿菌；6-長雙歧桿菌；7-青春雙歧桿菌；8-兩歧雙歧桿菌；9-短雙歧桿菌； M-DL2000Marker圖3 利用雙歧桿菌特異性引物進行PCR擴增的結果Fig.3 The result of the Bifidobacterium specific primers for PCR

如圖3所示，已知的4種雙岐桿菌標準菌株以及乳雙歧桿菌，分別在550 bp和1 400 bp處PCR擴增出明亮條帶，而大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線菌擴增出來的條帶不明顯或沒有條帶，表明兩對引物對雙歧桿菌屬的菌株具有特異性。同時，各標準菌株在1 400 bp處擴增出的條帶更加清晰，因此選用1 400 bp處的引物對待測菌株進行后續的PCR擴增。

2.3.3 待測菌株的PCR擴增

利用本實驗設計的雙歧桿菌特異性引物分別對菌株B4、B13、B17、B21、B23、B24以及乳桿菌、大腸桿菌進行PCR擴增，從擴增結果(圖4)來分析：菌株B13、B17、B20、B23、B24和長雙歧桿菌標準菌株在同一位置1 400 bp處均出現清晰條帶，實驗選取的對照組乳桿菌和大腸桿菌均無目的條帶的產生，說明本實驗設計的引物對雙歧桿菌具有一定的特異性。菌株B4沒有擴增出預期條帶，可能是菌株本身或PCR條件的原因。

1～6-分別為菌株B4、B13、B17、B21、B23、B24；7-長雙歧桿菌標準菌株；M-DL2000Marker；8-乳桿菌；9-大腸桿菌圖4 在57 ℃條件對菌株進行PCR擴增的結果Fig.4 The result of the strains for PCR in 57℃

2.3.4 利用降落PCR(touch-down PCR，TD-PCR)對菌株B4進行擴增

在常規的PCR中，若所選擇的退火溫度較低，就會造成引物與模板之間的錯配，使引物與位點的結合不正確，難以獲得理想的擴增效果，利用TD-PCR可以減少這種錯配，因此，在無法得到目標產物時可以選擇TD-PCR進行擴增[15-17]。由于菌株B4在梯度PCR時無法擴增出目的基因片段，本文嘗試用降落PCR對菌株B4進行擴增。本實驗設計引物的Tm值在50 ℃左右，在進行TD-PCR時退火溫度可以從55 ℃開始設置，降落到43 ℃，每2個循環降1 ℃，最后在43 ℃上做10個循環。

1-長雙歧桿菌標準菌株； 2-菌株B4； 3-乳桿菌；4-大腸桿菌； M-DL2000Marker圖5 利用TD-PCR的方法對菌株進行PCR擴增Fig.5 The result of the strains for the TD-PCR

從實驗結果(圖5)來看，利用TD-PCR長雙歧桿菌和菌株B4在1 400 bp處均能擴增出明亮的條帶，與預期一致，而大腸桿菌和乳桿菌均未能擴增出相應的條帶。

2.3.5 質重組子的獲得及質粒的提取與測序分析

將膠回收產物與pMD18-T在16 ℃連接過夜，第2天連接產物轉化感受態細胞E.coilDH 5α，涂布于有Amp的LB平板上，37 ℃培養12～16 h，挑取單菌落于盛有1 mL LB液體培養基的無菌離心管中進行增殖培養12 h，隨機挑取重組子提取質粒，送至南京金斯瑞公司測序，將測序結果輸入NCBI用blast工具進行分析，結果表明：菌株B4、B13、B17、B23與動物雙歧桿菌乳亞種的同源性高達99%，菌株B21與長雙歧桿菌的同源性達到98%，B24與兩歧雙歧桿菌的同源性也達98%。菌株B4與動物雙歧桿菌乳亞種的同源性高達99%。其中，菌株B21和B24已經申請中國典型培養物保藏中心(CCTCC)進行專利保藏，保藏編號為M2014467和M2014468。因此，該方法可以用作雙歧桿菌屬間的分子生物學鑒定。

3 討論

由于傳統的生理生化鑒定容易受培養條件、培養環境等影響，對于微生物的鑒定存在一些誤差，因此可以結合分子生物學的手段，對微生物進行進一步的鑒定，以保證實驗結果的準確性。

(1)雙歧桿菌屬16S rRNA區域具有高度相似性，在利用通用引物對雙歧桿菌16S rRNA區域進行擴增時，由于通用引物對雙歧桿菌16S rRNA區域沒有特異性，因此，在擴增的過程中容易發生錯配的現象，導致PCR結果不理想，目的條帶不明確，無法得到目的DNA。

(2)利用新合成的雙歧桿菌特異性引物進行擴增時，梯度PCR和降落PCR相結合的方法能夠快速擴增出目的片段，而作為比對的大腸桿菌和乳桿菌不能擴增出任何條帶，這說明了我們所設計的引物對雙歧桿菌具有特異性。將擴增產物與pMD18-T載體相連接，進行克隆提取質粒測序，結果證明了所篩選出的菌株均為雙歧桿菌，同源性均在98%以上。

(3)利用雙岐桿菌特異性引物對已知菌株和待測菌株進行PCR擴增，通過在550 bp和1 400 bp的條帶比對可以快速、準確的鑒定雙歧桿菌，為雙岐桿菌分子生物學鑒定提供了依據。

[1] 張明江, 孟祥晨, 王麗群. 雙歧桿菌用于腫瘤基因治療的研究現狀[J]. 中國微生態學雜志, 2006, 18(2):145-146.

[2] HADADJI M, SAIDI N. Identification of cultivable Bifidobacterium species isolated from breast-fed infants feces in West-Algeria[J]. African Journal of Biotechnology, 2005, 4(5):422-430.

[3] MEDEIROS, ADJA Cristina Lira de. Structural characterisation and cell viability of a spray dried probiotic yoghurt produced with goats′milk andBifidobacteriumanimalissubsp. lactis (BI-07)[J]. International Dairy Journal,2014,39:71-77.

[4] STENMAN L K, WAGET A, GARRET C, et al. Potential probioticBifidobacteriumanimalisssp. lactis 420 prevents weight gain and glucose intolerance in diet-induced obese mice.[J]. Beneficial Microbes, 2014, 5(4):437-45.

[5] 李正義, 肖敏, 盧麗麗等. 轉糖基β-半乳糖苷酶生產含低聚半乳糖的低乳糖牛奶[J]. 食品科學, 2007, 28(5):241-244.

[6] 程茜,劉作文.雙歧桿菌防治鼠傷寒沙門菌感染的實驗研究[J].中國微生態學雜志,1999,11(5):260-263.

[7] FUJIMORI M, AMANO J, TANIGUCHI S. The genus Bifidobacterium for cancer gene therapy[J]. Current Opinion in Drug Discovery & Development, 2002, 5(5):200-203.

[8] 張翠所. 藥品微生物控制菌檢查及菌種鑒定/基因分型方法的研究[D]. 石家莊：河北醫科大學, 2015.

[9] 陳茶, 屈平華, 顧全,等. 基于細菌16S rRNA基因的PCR擴增與測序分析在臨床不常見菌鑒定中的應用[J]. 中華檢驗醫學雜志, 2012, 35(7):612-619.

[10] 張華香. 分子生物學技術在微生物鑒定和分類中的應用[J]. 科技視界, 2015(13):199-199.

[11] WOO P C Y, TENG J L L, YEUNG J M Y, et al. Automated identification of medically important bacteria by 16S rRNA gene sequencing using a novel comprehensive database, 16SpathDB[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2011, 49(5):1 799-1 809.

[12] YOUN S Y, SEO J M, JI G E. Evaluation of the PCR method for identification ofBifidobacterium, species[J]. Letters in Applied Microbiology, 2008, 46(1):7-13.

[13] 吳擁軍, 王嘉福. 應用16S rDNA鑒定食品中的雙歧桿菌[J]. 食品科學, 2009, 30(18):359-361.

[14] 沈永才, 袁佩娜. 雙歧桿菌的遺傳學分類方法研究進展[J]. 中國微生態學雜志, 2000, 12(3):171-173.

[15] 李玉恒, 趙明慧, 趙紫陽,等. 利用梯度PCR和降落PCR擴增CIRP基因的比較[J]. 黑龍江八一農墾大學學報, 2011, 23(5):46-49.

[16] 黃留玉. PCR最新技術原理、方法及應用[M]. 北京：化學工業出版社, 2011.

[17] SHAN T D, DENG Z Y, ZHANGF X, et al. Comparative study of molecular biology on acute high altitude and plain intestinalBifidobacteriumin rats[J]. Chinese Journal of Microecology, 2011, 23(3):197-200.

The molecular identification of bifidobacterium

XIONG Qiang*, WANG Yan-bin, HAN Hao

(College of Food Science and Light Industry, Nanjing Tech University, Nanjing 211800，China)

In this paper, the specific primers for bfidobacterium designed by our laboratory was combined the touch-down PCR to amplify 16S rDNA of test strains. The amplification effects of the universal primers for bacteria and the specific primers for bifidobacterium on different strains of the genus bifidobacterium and reference strains were compared. The experimental results showed that the amplification of sample from different bifidobacteria using universal primers for bacteria resulted in unclear bands, while amplification with specific primers for bifidobacterium gave rise to very bright bands. Therefore, this method can accurately identify the bifidobacterium and our work provides a theoretical basis for the identification of bifidobacterium.

bifidobacterium; Polymerase Chain Reaction(PCR); molecular biology; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612008

副教授(本文通訊作者,E-mail:xiongqiang@njtech.edu.cn)。

2016-07-18，改回日期：2016-08-28