基于發酵優化和動力學建立Levan果聚糖生產的數字化模型

于曉萌，張京良，孫永超，姜言暉，沈照鵬，王鵬，江曉路*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003) 2(中國海洋大學 醫藥學院，山東 青島，266003) 3(青島海洋生物醫藥研究院，山東 青島，266071) 4(同濟大學 數學科學學院，上海，200092)

基于發酵優化和動力學建立Levan果聚糖生產的數字化模型

于曉萌1，張京良2,3，孫永超4，姜言暉1，沈照鵬2,3，王鵬1，江曉路1*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003) 2(中國海洋大學 醫藥學院，山東 青島，266003) 3(青島海洋生物醫藥研究院，山東 青島，266071) 4(同濟大學 數學科學學院，上海，200092)

利用自動發酵罐對巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium) GJT321生產Levan果聚糖的發酵培養條件進行優化，并對發酵動力學進行研究，采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和底物消耗的物料平衡方程分別建立菌體生長、產物合成和底物消耗動力學的數字化模型，應用MATLAB軟件進行模型擬合，獲得模型的參數、方程和曲線。模型的擬合值與發酵測定的實驗值擬合良好，該模型能較好地反映BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖發酵過程中菌體生長、Levan果聚糖合成和蔗糖消耗的變化規律，為發酵過程的在線控制和預測提供理論基礎。

動力學模型；發酵優化；Levan果聚糖；巨大芽孢桿菌

微生物多糖是一種高分子聚合物，在利用微生物發酵生產多糖的過程中，發酵液粘度高、產物分子量高卻易降解、底物濃度難以控制等因素，給發酵生產帶來一定困難，完善發酵工藝需要達到培養基成分合理、參數準確，以實現快速生產的要求。Levan果聚糖是D-呋喃果糖由β-(2,6)糖苷鍵連接而成的一種同多糖，它主要由微生物產生，其生物合成通常由果聚糖蔗糖酶完成[1]，果聚糖蔗糖酶具有水解和轉果糖基雙重活性，蔗糖作為唯一底物同時作果糖基供體和果糖基受體。與存在植物體內的果聚糖相比，Levan果聚糖不能被酵母菌產生的淀粉酶或轉化酶降解[2]，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、免疫刺激[5]等藥理活性，在心血管疾病和動脈粥樣硬化方面[3]也能起到一定作用。近年來的研究表明，Levan果聚糖還有作為益生元和可溶性纖維的潛力，因此研究者們對其生產和應用的關注度逐漸提高[6]。

發酵罐發酵是實驗室搖瓶發酵的放大，為工業化放大提供依據，有利于實現成果從實驗室水平向工業化水平的轉變。搖瓶發酵與發酵罐發酵生產間的差異，通常不僅是簡單的放大，會伴隨產物合成量的變化[7]，且在發酵罐培養中，相對于搖瓶培養，通氣量的控制是其特有的，用于調控發酵罐中空氣成分，以期提高產量[8]。通過監測溶氧水平，還可了解更多發酵過程的變化情況。因此，利用發酵罐對發酵轉速與通氣量進行優化，不僅能在發酵罐水平得到優化的發酵條件，還能結合溶氧分析發酵過程。發酵動力學研究主要集中于對發酵過程中的菌體濃度、產物濃度及底物濃度隨時間的變化規律進行研究，結合數學模型的應用，對發酵過程進行模型的擬合預測，目前對生產Levan果聚糖的研究主要集中在發酵條件的優化，未見細菌生產Levan果聚糖發酵動力學的相關報道。本文在優化發酵罐培養條件的基礎上，通過建立由BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖的發酵動力學模型，探尋發酵過程中參數的變化規律，為實現規?；aLevan果聚糖提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumGJT321菌株，由中國海洋大學食品科學與工程學院應用微生物學實驗室篩選得到，已送至中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號CCTCC M 2016073。該菌株經前期實驗已證實，從發酵液中分離出的胞外多糖為Levan果聚糖。

斜面培養基：牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH為7.2；

種子培養基：蔗糖300 g，蛋白胨18 g，(NH4)2SO43 g，NaCl 1.5 g，MgSO40.1 g，CaCl20.05 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 L，pH為 7.0；

發酵培養基：蔗糖300 g，蛋白胨18 g，(NH4)2SO43 g，NaCl 1.5 g，MgSO40.1 g，CaCl20.05 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 L，pH為 7.0。

1.2 儀器與設備

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；ZWY-2102C恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；BLBIO-5GJ-4-H自動發酵罐，上海百倫生物科技有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；721型可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養方法

將BacillusmegateriumGJT321菌株從斜面培養基接種至種子培養基中，在搖床轉速32 ℃、160 r/min條件下培養24 h，將種子液以體積分數為7.5%的接種量接種至裝有4 L發酵培養基的5 L發酵罐中，控制適宜的轉速和通氣量，于32 ℃條件下發酵培養。

1.3.2 發酵培養條件優化

在其他條件相同的條件下，分別考察發酵罐轉速(200、400、600 r/min)和通氣量(2、4、8 L/min)對發酵體系的溶氧量(dissolved oxygen，DO)、Levan果聚糖產量和生物量的影響，篩選最適轉速和通氣量。

1.3.3 發酵動力學數字化模型的建立

1.3.3.1 發酵過程曲線的制作

選擇優化后的轉速和通氣量，根據1.3.1的方法進行發酵培養。從接種后發酵開始，每小時取樣，對pH、生物量、Levan果聚糖濃度、葡萄糖濃度和蔗糖濃度進行測定，并制作BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖的發酵過程曲線。

1.3.3.2 菌體生長動力學模型的建立

采用Logistic方程建立BacillusmegateriumGJT321的菌體生長動力學模型，描述其菌體生長速率的Logistic微分方程為:

(1)

從方程(1)中可以看出，發酵初期X接近于0，且X/Xmax的值很小，dX/dt接近于0；之后X開始增大，X小于Xmax，dX/dt即菌體生長速率先升高后降低，菌體生長進入對數期；由于細菌在發酵體系中的生長環境是有限的，X越大，菌體間的競爭越激烈，當X達到最大值時，X=Xmax，會使dX/dt降至0。

初始條件t=0時，得X=X0，積分式為:

(2)

1.3.3.3 產物合成動力學模型的建立

采用Luedeking-Piret方程建立BacillusmegateriumGJT321的產物合成動力學模型，描述Levan果聚糖合成速率的Luedeking-Piret微分方程為:

(3)

由方程(3)可以看出，產物合成速率可能與菌體生長速率和菌體濃度有關。α≠0、β=0時，產物合成與菌體生長相偶聯，即產物合成速率與菌體生長速率有關，菌體生長伴隨產物合成，與菌體濃度無關；α≠0、β≠0時，產物合成為菌體生長部分偶聯，即產物合成速率與菌體生長速率和菌體濃度都有關；α=0、β≠0時，產物合成與菌體生長非偶聯，即產物合成速率與菌體生長速率無關，只與菌體濃度有關。

初始條件t=0時，得P=P0，積分式為:

(4)

1.3.3.4 底物消耗動力學模型的建立

在發酵過程中，底物消耗主要用于菌體的生長、細胞維持基本生命活動和產物合成[9]，根據基質平衡原理，建立BacillusmegateriumGJT321的底物消耗動力學模型，描述底物消耗的物料平衡微分方程為:

(5)

初始條件t=0時，得S=S0，積分式為:

(6)

1.3.3.5 參數說明

X、X0、Xmax分別為菌體濃度、起始菌體濃度和最大菌體濃度，g/L；P、P0分別為Levan果聚糖濃度和起始Levan果聚糖濃度，g/L；S、S0分別為蔗糖濃度和起始蔗糖濃度，g/L；t為時間，h；μmax為最大比生長速率，h-1；α為與菌體生長速率相關聯的Levan果聚糖合成系數；β為與菌體濃度相關聯的非生長耦聯系數；YX/S為菌體對蔗糖的得率，g/g；YP/S為Levan果聚糖對蔗糖的得率，g/g；m為菌體的維持系數，h-1。

1.3.3.6 模型擬合

采用MATLAB軟件進行數據與模型的擬合，將實驗值與模型擬合值進行比較分析。

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 生物量測定

發酵條件優化實驗中，以600 nm的吸光值(OD600nm)表示生物量。

建立動力學模型實驗中，取20 mL發酵液，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入10 mL蒸餾水將沉淀均勻分散，再次離心后收集沉淀，于100 ℃烘干至恒重，以菌體干重表示生物量。

1.3.4.2 Levan果聚糖濃度測定

將發酵液于10 000 r /min離心10 min，在上清液加入1.5倍體積的乙醇，同樣條件下離心棄上清液，向沉淀中加入蒸餾水復溶，采用苯酚-硫酸法[10]測定糖濃度，以葡萄糖為標準品繪制標準曲線。

1.3.4.3 葡萄糖濃度測定

生物傳感器測定葡萄糖濃度[11]。

1.3.4.4 蔗糖濃度測定

2 結果與分析

2.1 培養條件優化結果

2.1.1 轉速對Levan果聚糖發酵過程的影響

由圖1可以看出，發酵初期生物量即增長迅速，消耗大量氧氣，溶氧在發酵初期均呈迅速下降趨勢，轉速越高，溶氧下降越慢，溶氧最低值越高，低溶氧期越短。當生物量(OD600nm)開始下降，即菌體代謝減弱，進入衰亡期后，耗氧能力下降，溶氧上升恢復至發酵初期水平。在轉速為200 r/min的發酵罐中，溶氧始終保持極低的水平，溶氧不足導致菌體生長緩慢，Levan果聚糖合成延滯，導致Levan果聚糖在發酵前16 h中上升趨勢較平緩，16 h時才達到最高點。而在轉速為400 r/min和600 r/min的2個發酵罐中，生物量和Levan果聚糖濃度的變化情況幾乎相同，其發酵合成產物的速度和最大值也幾乎相同，都能夠在6 h時達到Levan果聚糖濃度最大值。雖然在轉速為400 r/min的發酵罐中，溶氧在產物合成期保持較低水平，但是沒有影響菌體的生長和Levan果聚糖的合成。由于轉速為400 r/min的條件轉速較低，節省能源，選擇400 r/min作為BacillusmegathriumGJT321菌株發酵合成Levan果聚糖的最適轉速。

圖1 轉速對Bacillus megaterium GJT321生產Levan果聚糖發酵過程的影響Fig.1 Effect of mixing speed on fermentation process of Bacillus megaterium GJT321 producing levan

2.1.2 通氣量對Levan果聚糖發酵過程的影響

實驗結果如圖2，通氣量越大，溶氧低水平期越短，但對生物量和Levan果聚糖濃度影響不大。通氣量為2 L/min的條件下，生物量總體偏低，Levan果聚糖達到最大值的時間也略延遲；通氣量為8 L/min條件下，生物量最早達到最大值，說明氧氣供應充足的條件下，菌體生長快；通氣量為4 L/min時，生物量總體偏高，說明菌體長勢好，雖然在4～12 h間溶氧偏低，但是沒有影響菌體的長勢，且Levan果聚糖產量相對較高，在第6 h達到最大值。從產量和節省能源兩方面考慮，選擇4 L /min作為BacillusmegathriumGJT321發酵生產Levan果聚糖的最適通氣量。

圖2 通氣量轉速對Bacillus megaterium GJT321生產Levan果聚糖發酵過程的影響Fig.2 Effect of mixing speed on fermentation process of Bacillus megaterium GJT321 producing levan

2.2BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖發酵過程曲線及分析

BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖發酵生產Levan果聚糖過程曲線如圖3所示。蔗糖濃度曲線表現為先快速下降后平穩，在4 h后降低的速率減緩，6 h后穩定在20 g/L以下。Levan果聚糖濃度曲線和葡萄糖濃度曲線在發酵過程中變化趨勢一致，在發酵初期的1 h內，Levan果聚糖和葡萄糖濃度略有上升，在1～6 h內迅速升高，6 h時分別達到最大值為123.1、130.0 g/L，其后保持平穩。上述數據表明發酵前期蔗糖被迅速分解為葡萄糖和果糖，葡萄糖游離在培養基中，果糖則被迅速連接合成Levan果聚糖，蔗糖濃度降低過程與Levan果聚糖濃度升高過程相吻合，說明底物消耗與產物合成幾乎同步進行。pH在Levan果聚糖合成期呈明顯下降趨勢，說明菌株在合成Levan果聚糖的同時產酸；當Levan果聚糖濃度達到最高點時，pH下降至最低點，此后pH和Levan果聚糖濃度均達到穩定。菌體生長曲線在發酵初期的1 h內上升緩慢，其后迅速上升，上升趨勢與Levan果聚糖濃度基本一致，10 h時達到生物量最高點，最大生物量為1.62 g/L。

圖3 Bacillus megaterium GJT321生產Levan果聚糖的發酵曲線Fig.3 Fermentation curve of Bacillus megaterium GJT321 producing levan

2.3BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖發酵動力學數字化模型參數值及方程

采用MATLAB軟件建立BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖發酵動力學方程，其參數見表1。

表1 發酵動力學模型參數值

將模型參數值代入(2)、(4)、(6)式，得到菌體生長、產物合成和底物消耗動力學方程分別為：

(7)

P(t)= 8.643 9+66.634 6X(t)+0.640 1ln

(8)

S(t)= 226.440 9-122.792 1X(t)-1.497 2ln

(9)

2.4BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖的發酵動力學數字化模型曲線

BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖的發酵動力學模型曲線如圖4～圖6。

圖4 菌體生長動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.4 Fitted values and experimental values of cell growth kinetic model comparison

圖5 產物合成動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.5 Fitted values and experimental values of product synthesis kinetic model comparison

圖6 底物消耗動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.6 Fitted values and experimental values of substrate consumption kinetic model comparison

擬合曲線兩側虛線間的范圍為95%置信區間，從圖中可以看出，擬合值與實驗值較為接近，實驗值大部分在95%置信區間內，且曲線擬合度R2分別為0.995 3、0.977 8和0.997 5，平均誤差分別為9.19%、8.11%和9.39%，說明擬合的模型能夠較好地反映BacillusmegateriumGJT321菌株實際的液體深層發酵過程。延滯期菌體濃度和產物濃度的擬合值與實驗值之間的相對誤差大于對數增長期和穩定期，可能是由于種子液的狀態對發酵前期菌體濃度和Levan果聚糖濃度的影響較大。

3 討論

發酵工程的相關理論已廣泛應用于工業化微生物產品的生產和控制，使得現代微生物發酵產業發展迅速，產品品質也得到提升[12]。能夠生產Levan果聚糖的微生物種類不同，其產量也相差較大。地衣芽孢桿菌8-37-0-1[13]發酵24 h生產Levan果聚糖，優化后產量為41.7 g/L?？莶菅挎邨U菌54A-42通過紫外線-LiCl復合誘變獲得的突變株Z-49[14]，發酵52 h生產Levan果聚糖產量為16.1 g/L。多粘類芽孢桿菌BD3526[15]生產的分子質量為2.6×106Da的果聚糖，產量為36.25 g/L。本文利用BacillusmegateriumGJT321在自動發酵罐中發酵生產Levan果聚糖，優化培養條件后，確定最適轉速400 r/min和通氣量4 L/min，在優化條件下發酵6 h產量達123.1 g/L，遠高于目前已報道的細菌生產Levan果聚糖的產量，該菌株易于培養，發酵周期短、產量高，具有大規模工業化生產的潛力。經過發酵動力學模型的擬合，建立了基于發酵動力學的BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖的數字化模型，探尋了其發酵過程中菌體生長、產物合成和底物消耗的規律，且模型的擬合值與發酵測定的實驗值十分接近，模型擬合良好，實現了對BacillusmegateriumGJT321生產Levan果聚糖發酵過程參數變化的預測。從模型中可以看出，發酵6 h時達到Levan果聚糖產量最高點，即6 h時結束發酵能夠獲得產物濃度最大化，且節約了生產時間和成本；還可根據所需產量輸入模型，得到對應的發酵時間，便于提前終止發酵，針對性地獲得既定產量，對Levan果聚糖發酵生產過程的動態在線控制和預測具有指導性意義。還可根據此發酵動力學數字化模型開發相應的在線控制設備，實現發酵過程自動化，并對早期污染作出指示，及時終止發酵過程，減少損失。

由于BacillusmegateriumGJT321在發酵生產Levan果聚糖的過程中，Levan果聚糖濃度在6 h處便達到了最高點，底物能夠被快速轉化利用，產物合成十分迅速，而發酵體系中的葡萄糖濃度在達到最高值后穩定，消耗極少。因此在今后的研究中，可以考慮進行補料分批發酵實驗，作為一種進行高密度發酵的重要技術手段，補料發酵既可以補充充足的營養，短時間內促進更多Levan果聚糖合成，又能夠將發酵液中的葡萄糖放出體系，處理后可作其他用途，同時減少培養過程中高濃度抑制性副產物的積累[16]。

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Establishment of digital model for levan production based on fermentation optimization and kinetics

YU Xiao-meng1, ZHANG Jing-liang2,3, SUN Yong-chao4, JIANG Yan-hui1, SHEN Zhao-peng2,3, WANG Peng1, JIANG Xiaolu1*

1(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China) 2(School of Medicine and Pharmacy, Ocean University, Qingdao 266003, China) 3(Marine Biomedical Research Institute of Qingdao, Qingdao 266071, China) 4(School of Mathematical Sciences, Tongji University, Shanghai 200092, China)

The culture optimization and kinetics ofBacillusmegateriumGJT321 fermentation producing levan in automatic fermentor was studied in this paper. Logistic equation, Luedeking-Piret equation and material balance equation of substrate consumption were employed to establish cell growth, product synthesis and substrate consumption kinetics digital models. The parameters, equations and curves were determined by using MATLAB software. The model indicated a good correlation between fitted values and experimental values, and reflected the change rules of cell growth, levan synthesis and sucrose consumption during the production of levan byBacillusmegateriumGJT321. The establishment of fermentation kinetics digital models could provide fundamental basis for following production process control and prediction.

kinetics model; fermentation optimization; levan;Bacillusmegaterium

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612004

碩士研究生(江曉路教授為通訊作者,E-mail：jiangxl@ouc.edu.cn)。

國家自然科學基金(U1406402-5)

2016-07-25，改回日期：2016-08-15