抗氧化型發酵劑對香腸發酵過程中脂肪氧化的影響

黃露，郇延軍

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

抗氧化型發酵劑對香腸發酵過程中脂肪氧化的影響

黃露，郇延軍*

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

在傳統發酵香腸只接種戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus, P.p)的基礎上，接種產過氧化氫酶的肉糖葡萄球菌(Staphylococcus carnosus, St.c)和產超氧化物歧化酶的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae,Sa.c)作為混合發酵劑對香腸的發酵工藝進行優化。單因素實驗表明St.c和Sa.c都具有一定的抗氧化效果，在單因素的基礎上由響應面分析法模擬得到了二次多項式回歸方程的預測模型，以過氧化值(Peroxide value, POV)和硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric acid value, TBAV)為脂肪氧化指標，確定最佳發酵工藝：發酵溫度為23 ℃，St.c與Sa.c的總添加量為8 lgCFU/g，St.c與Sa.c的復配比為1∶1。在該條件下，發酵香腸的POV為(0.299 7±0.003 1) meq/kg，TBAV為(0.151 0±0.000 8) mg/kg，感官評分為(82.7±1.2)，與只添加乳酸菌的傳統工藝相比，添加抗氧化型發酵劑顯著降低了POV和TBAV，抑制了脂肪的氧化，同時保持了產品的色澤、外觀、質地、風味。

發酵劑；發酵香腸；抗氧化性；感官評價

發酵香腸是指將絞碎的肉、動物脂肪、鹽、發酵劑和香辛料等混合后灌進腸衣，在自然或人工控制條件下，經過微生物發酵產生酸或醇，使肉的pH值降低，并經或不成熟干燥使香腸的Aw下降而制成的具有較好保藏性能和典型發酵風味特性的肉制品[1-3]。脂質氧化是香腸發酵成熟過程中主要的生化反應過程，對風味物質的形成具有特殊的意義[4-5]。脂質氧化除了直接產生風味化合物外，其氧化產物還可以進一步參與美拉德反應，形成大量的風味物質[6]。適度的氧化可以產生肉的特征香味[7]，而過度的氧化會導致肉品在加工貯存過程中出現品質劣化、產生不良風味，因此控制脂肪氧化對于肉制品工業至關重要[8]。目前，市場上發酵香腸的包裝形式多樣，有散裝、一般包裝和真空包裝，其中，散裝保存時間短且氧化程度較大，一般包裝和真空包裝主要是添加了抗氧化劑，如異VC、茶多酚、迷迭香等，黃丹等[9]發現將茶多酚按0.05%的量添加到香腸中，能延緩哈喇味的產生，提高香腸的氧化穩定性。NASSUA等[10]研究發現，0.05%的迷迭香可更有效地抑制羊肉香腸的脂肪氧化。微生物調控也是抑制脂肪氧化的途徑之一[11]。研究表明某類微生物在生長代謝過程中會產生一些抗氧化酶，王永霞等[12]從中式傳統肉制品中分離、純化、篩選出能產生過氧化氫酶陽性的肉糖葡萄球菌，初步認定可作為肉用發酵劑。叢文蓉等[13]從不同來源的釀酒酵母中，篩選得到1株發酵特性優良，且抗氧化性能突出的釀酒酵母菌株。SONGISEPP等[14]證實，發酵乳桿菌ME-3具有抗氧化和抗微生物活性。LIN等[15]發現嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌的無細胞提取物都具有清除膜脂質過氧化反應產物MDA的能力。

本實驗以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus, P.p)、肉糖葡萄球菌(Staphylococcus carnosus, St.c)和釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae,Sa.c)作為混合發酵劑，通過單因素和響應面優化實驗對發酵香腸的發酵工藝進行優化，以過氧化值(Peroxide value, POV)和硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric acid value, TBAV)為指標，并對發酵香腸進行感官評定，研究在最佳發酵條件下香腸的特性，以期開發具有抗氧化功能、風味獨特的新型發酵香腸。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮豬后腿肉及豬背膘、食鹽、白糖、味精、姜粉、胡椒粉、花椒粉、八角粉、五香粉等購于當地超市。其他試劑均為分析純。P.p(編號GIM1.428)，St.c(編號GIMT1.044)，Sa.c(編號GIM2.110)，三種菌都購于廣東省微生物菌種保藏中心。MRS培養基，參照GB478912—2003；營養肉湯培養基，參照GB478912—2003；麥芽汁培養基購于廣東環凱微生物科技有限公司。

SW-CJ-2D型雙人單面垂直送風超凈臺，蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SPX型智能生化培養箱，南京金恒實驗儀器廠；紫外-可見光分光光度計(UV-2600)，上海天美科學儀器有限公司；KBF240型恒溫恒濕生化培養箱，德國Binder公司；FE20K型pH計，瑞士梅特勒-托利多。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵劑的制備

將菌種活化，作為種子液。分別將P.p、St.c和Sa.c靜置培養到對數生長期，將各自的增殖培養液離心(4 000 r/min)10 min，倒掉上清液，菌體沉淀用10 mL無菌生理鹽水(0.85%)懸浮，即得到需要的液體發酵劑，經活菌計數后稀釋到所需濃度用于后續的接種。

1.2.2 豬肉發酵香腸發酵工藝流程及操作要點[16]

原料選擇(肥瘦比為1∶4)→肥肉切丁、瘦肉絞碎→添加配料→腌制(4 ℃，1 d)→接種發酵劑→灌入腸衣→發酵→成熟干燥→成品。

原料肉的預處理：選用新鮮的豬后腿肉，將肥瘦肉分開，瘦肉絞碎，肥肉切丁，瘦肉與肥肉按4∶1進行混合。

腌制：2.5%鹽、2%白糖、0.1%胡椒粉、0.1%花椒粉、0.1%姜粉、0.1%味精、0.1%五香粉、0.1%八角粉，在4 ℃條件下腌制1 d。

接種發酵劑：用滅菌的生理鹽水提前將混合發酵劑活化。

灌入腸衣：用灌腸器將腌制好的豬肉糜灌入天然豬腸衣中。

發酵：于85%～90%RH及適宜溫度的恒溫恒濕箱中發酵。

成熟干燥：于15 ℃、75%RH的恒溫恒濕箱中成熟。

1.3 單因素實驗

按傳統發酵香腸的一般工藝的將P.p接種量固定為8 lgCFU/g，分別考察發酵溫度、St.c與Sa.c復配比、St.c與Sa.c總接種量對香腸發酵過程中脂肪氧化的影響。發酵48 h后，終止發酵，取樣測定POV和TBAV。

發酵溫度對脂肪氧化的影響：將菌種配比為1∶1、總接種量為8 lgCFU/g的St.c與Sa.c添加到腌制后的豬肉糜中，灌制成香腸后分別置于15、20、25、30、35 ℃下發酵。

St.c與Sa.c總接種量對脂肪氧化的影響：將菌種配比為1∶1、總接種量分別為6、7、8、9、10 lgCFU/g的St.c與Sa.c添加到腌制后的豬肉糜中，灌制成香腸后于25 ℃下發酵。

St.c與Sa.c復配比對脂肪氧化的影響：將總接種量為8 lgCFU/g的St.c與Sa.c添加到腌制后的豬肉糜中，且St.c與Sa.c復配比分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，灌制成香腸后于25 ℃下發酵。

對照組：只接種與實驗組等量的P.p，其他條件同上。

1.4 響應面優化實驗

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理[17]，選取發酵溫度(A)、St.c與Sa.c總接種量(B)、St.c與Sa.c復配比(C)3個因素進行中心組合實驗，以最終產品的POV和TBAV作為雙響應值。利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及數據處理，實驗各因素及水平編碼見表2。

1.5 相關指標的測定方法

POV的測定：參照GB/T5009.37—2003中的比色法測定。

TBAV的測定：參考郇延軍[18]等的方法。

表1 發酵香腸感官評定指標及評分標準

感官評價：將經發酵成熟后的香腸切成1 cm×1 cm×2 cm大小在100 ℃水浴中下蒸煮15 min后，進行感官。參考文獻[19]，并改進如下：由經專門培訓與考核的10人組成評定小組，評定標準見表1，評定方法采用100分制，按色澤、外觀、質地、風味指標進行綜合評價。最后按照色澤30%、外觀20%、質地20%、風味30%的權重，評價產品的品質。

1.6 數據處理

每個樣品重復3次實驗，取平均值。實驗數據用Excel 2010、Origin 9.1、SPSS 22及Design-Expert 8.0.6進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發酵溫度對香腸脂肪氧化的影響

發酵溫度是微生物生長及微生物產酶特性的一個重要影響因素。從圖1和圖2可看出，隨發酵溫度的增高，實驗組和對照組發酵香腸的POV和TBAV逐漸上升，對照組POV和TBAV隨溫度的升高持續增加，且都高于實驗組。這與王愷[20]在16～42 ℃接種3種乳酸菌發酵劑對香腸POV和TBAV的變化趨勢是一致的。當發酵溫度達到25～30 ℃時，溫度對實驗組POV和TBAV的影響不顯著(P>0.05)，但發酵溫度高于30 ℃時，溫度對實驗組POV和TBAV的影響極其顯著(P<0.05)且增長較快，這可能是因為25～30 ℃是3種微生物的最適生長溫度，且是抗氧化酶產生的最佳溫度，此時產生的抗氧化活性物質積累較多，在一定程度上抑制了脂肪的氧化，而溫度高于30 ℃時，脂肪氧化速度加快，抗氧化活性物質生成較少，已不能起到抑制作用。故最終選取發酵溫度20、25、30 ℃進行進一步分析。

圖1 發酵溫度對發酵豬肉香腸POV的影響Fig.1 Effects of different fermentation temperature on POV of fermented pork sausage

圖2 發酵溫度對發酵豬肉香腸TBAV的影響Fig.2 Effects of different fermentation temperature on TBAV of fermented pork sausage注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.1.2St.c與Sa.c總接種量對香腸脂肪氧化的影響

如圖3和圖4所示，隨著St.c與Sa.c總接種量的增大，對照組POV和TBAV變化不顯著，而實驗組兩者都呈減小的趨勢，隨著接種量的逐漸增大脂質的氧化程度逐漸減小，可能是St.c與Sa.c生長繁殖代謝過程中產生的抗氧化活性物質對脂質的氧化起到了一定的抑制作用，兩者的變化趨勢與王燚等[21]的研究結果一致。接種量在6～8 lgCFU/g范圍時，St.c與Sa.c總接種量對POV和TBAV的影響極其顯著(P<0.05)。這可能是因為隨著接種量的增大，St.c代謝產生的CAT積累較多，Sa.c生長代謝的SOD積累較多，即兩者產生的總抗氧化物質較多，對脂肪氧化的抑制增強，即POV和TBAV減小。但當St.c與Sa.c總接種量大于8 lgCFU/g時，兩菌總接種量對POV和TBAV的影響不顯著(P>0.05)。故最終選取St.c與Sa.c總接種量為7、8、9 lgCFU/g進行響應面進一步分析。

圖3 St.c與Sa.c總接種量對發酵豬肉香腸POV的影響Fig.3 Effects of different inoculum size of St.c and Sa.c on POV of fermented pork sausage

圖4 St.c與Sa.c總接種量對發酵豬肉香腸TBAV的影響Fig.4 Effects of different inoculum size of St.c and Sa.c on TBAV of fermented pork sausage

2.1.3St.c與Sa.c復配比對香腸脂肪氧化的影響

如圖5和圖6所示，對照組的POV和TBAV在發酵過程中不變，而實驗組POV和TBAV隨St.c與Sa.c復配比的增大而減小，當其復配比從1∶3增加到1∶1時，POV和TBAV減小極其顯著(P<0.05)，其原因可能是酵母菌生長時耗盡了腸餡空間中殘存的氧，不飽和碳鏈不能夠吸收氧形成過氧化物，從而降低氧化值；另外隨著酵母菌比例的增加，酵母菌產生的SOD酶增多，在一定程度上抑制了脂肪的氧化，使得POV和TBAV減小。這與LEE等[22]的研究結果類似，即酵母菌的添加提高了冷藏牛肉抗氧化酶活性，延緩了脂質的過氧化，延長了貨架期。當兩菌的復配比大于2∶1時，復配比對POV和TBAV的影響不顯著(P>0.05)，即隨著復配菌株中酵母菌含量增加較多時，St.c總數較小，酵母菌的酒精發酵降低了乳酸菌活性，即St.c產CAT受到了抑制，總抗氧化活性物質變化不大。故最終選取St.c與Sa.c復配比為1∶2、

1∶1、2∶1進行響應面進一步分析。

圖5 St.c與Sa.c復配比對發酵豬肉香腸POV的影響Fig.5 Effects of different compositeratio of St.c and Sa.c on POV of fermented pork sausage

圖6 St.c與Sa.c復配比對發酵豬肉香腸TBAV的影響Fig.6 Effects of different compositeratio of St.c and Sa.c on TBAV of fermented pork sausage

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面實驗結果

表2 響應面實驗設計方案及結果

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析

以發酵溫度(X1)、St.c與Sa.c總接種量(X2)、St.c與Sa.c復配比(X3)為自變量，分別以POV、TBAV為應變量Y1、Y2，利用Design-Expert8.0.6統計軟件對響應面實驗數據進行二次多項回歸擬合，分別獲得Y1、Y2的多元回歸方程：Y1=17.622-0.376A-3.465B+0.448C-0.004AB-0.030AC-0.121BC+0.010A2+0.240B2+0.545C2；Y2=8.640-0.192A-1.679B+0.235C-0.002AB-0.016AC-0.060BC+0.005A2+0.116B2+0.278C2。

建立豬肉發酵香腸發酵工藝參數回歸模型，對該模型進行方差分析，對模型系數進行顯著性檢驗，分析結果分別見表2和表3。

表3 響應面方差分析結果(POV和TBAV為響應值)

注：**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)，—表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2.3 各因素對POV與TBAV的影響

響應面分析根據回歸的各單項指標方程，繪制各交互作用圖，對交互作用影響不顯著的未繪出。

圖7和圖8分別給出了發酵溫度、St.c與Sa.c復配比之間交互作用對香腸發酵結束后POV和TBAV的響應面曲線圖。圖7反映出香腸發酵結束后POV隨發酵溫度的升高而增加，隨St.c與Sa.c復配比的增大而增大。圖8反映出香腸發酵結束后TBAV隨發酵溫度的升高而增加，隨St.c與Sa.c復配比的增大而增大。

圖7 A與C之間的交互作用對POV的影響Fig.7 Interactions between A and C on POV

圖8 A與C之間的交互作用對TBAV的影響Fig.8 Interactions between A and C on TBAV

2.3 模型的驗證及感官評定

由Design-Expert8.0.6軟件分析得到發酵香腸的最佳發酵條件為：發酵溫度22.73 ℃，St.c與Sa.c總接種量為7.67 lgCFU/g，St.c與Sa.c復配比為1.06∶1。

考慮到實際操作，將參數調整為發酵溫度23 ℃，St.c與Sa.c總接種量為8 lgCFU/g，St.c與Sa.c復配比為1∶1。為驗證響應面法所得結果的可靠性，采用上述參數做3次驗證試驗，與傳統工藝只添加乳酸菌的對照組進行比較并進行感官分析。實驗結果顯示，對照組POV和TBAV分別為(0.337 4±0.002 5) meq/kg和(0.182 3±0.000 6) mg/kg，優化后產品的POV和TBAV分別為(0.299 7±0.003 9) meq/kg和(0.151 0±0.000 5) mg/kg，顯著降低了POV和TBAV，與預測值0.301 8 meq/kg和0.158 3 mg/kg相差較小。感官評分結果(表4)表明優化后的發酵香腸具有較高的評分(82.7±1.2)，說明優化后的產品具有良好的外觀、色澤、質地及香腸特有的風味。

表4 發酵香腸感官評定結果

注：用SPSS軟件對感官評定中各項目進行兩組獨立樣品t檢驗的顯著性分析。其中， *表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異顯著(P<0.01)，***表示差異極顯著(P<0.001)。

3 小結

抗氧化型發酵劑對香腸發酵過程中的脂肪氧化起到了一定的抑制作用。通過響應面實驗建立了POV和TBAV與3個因素之間的數學模型，模型分析確定發酵溫度為23 ℃，St.c與Sa.c總接種量為8 lgCFU/g，St.c與Sa.c復配比為1∶1。在該條件下表現出較好的抗氧化效果，感官評分為(82.7±1.2)，保持較好的感官品質；香腸的POV和TBAV分別為(0.299 7±0.003 9) meq/kg和(0.151 0±0.000 5) mg/kg，與傳統工藝相分別降低了12.5%和20.7%，說明微生物發酵劑在一定程度上可以抑制脂肪的氧化。

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Effect of antioxidant starter cultures on lipid oxidation of sausage during fermentation

HUANG Lu, HUAN Yan-jun*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In this study, based addition of lactic acid bacteria in traditional fermented sausage,Staphylococcuscarnosus(St.c) producing catelase andSaccharomycescerevisiae(Sa.c) metabolizing superoxide dismutase were used as mixed starter cultures to optimize fermentation process conditions of fermented sausage. The single factor experiments showed thatSt.candSa.chad certain antioxidant effect. Then based on response surface optimization design of experiment, orthogonal tests combining peroxide value (POV) and thiobarbituric acid value (TBAV) of sausage were used as indices to determine the optimum fermentation process. The results showed that the best fermentation temperature was 23 ℃, the inoculum size ofP.pwas 8 lgCFU/g, the inoculum size ofSt.candSa.cwere 8 lgCFU/g, and the composite ratio ofSt.atoSa.cwas 1∶1. Under these conditions, POV was (0.297 5±0.003 1), TBAV was (0.151 0±0.000 8) mg/kg, and the sensory score was (82.7±1.2). Compared with the blank control group, adding starter culture not only resulted in significant decrease of POV and TBAV, but also inhibited lipid oxidation and retained color, appearance, texture and flavor of the product.

starter culture; fermented sausage; antioxidant activity; sensory evaluation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612007

碩士研究生(郇延軍教授為通訊作者，E-mail：huanyanjun@jiangnan.edu.cn)。

江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心資助項目

2016-06-01，改回日期：2016-07-13