解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的生產及其酶學性質研究

騰軍偉，鄭喆，梅雪洋，付琦潔，張健，楊貞耐

(北京工商大學,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心, 北京,100048)

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的生產及其酶學性質研究

騰軍偉，鄭喆，梅雪洋，付琦潔，張健，楊貞耐*

(北京工商大學,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心, 北京,100048)

采用正交試驗設計優化了解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發酵產凝乳酶的工藝條件：發酵溫度35 ℃，裝液量40%，搖床轉速180 r/min，發酵時間84 h。在此優化條件下，獲得的凝乳酶凝乳活力為558.14 Su/mL。進一步研究了該酶的酶學性質，凝乳酶最適反應溫度為55 ℃，酶活力在25～45 ℃比較穩定，60 ℃保持50 min完全失活。在pH5.5時凝乳酶活力最高，在pH 5.5～7.0范圍內，隨著pH增大，凝乳酶活力逐漸下降，pH 6.5時，凝乳酶活力穩定性最高。Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+以及Al3+均對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，其中Ca2+對凝乳活力的促進作用最為顯著，且Ca2+濃度為0.020 mol/L時凝乳酶的凝乳活力達到最大值，而Na+、K+和Cu2+對凝乳活力均有抑制作用；凝乳酶Km為2.35 g/L，Vmax=1.18 U/mL。

解淀粉芽孢桿菌；凝乳酶；正交試驗；酶學性質

凝乳酶是制作干酪時添加于原料乳中起凝乳作用的必需酶[1],其凝乳特性及蛋白水解活力會最終影響干酪的得率、風味和質構[2-4]。傳統的凝乳酶來源于未斷奶的牛犢皺胃。隨著世界干酪產業的發展,傳統凝乳酶的供應已出現世界性短缺。為此，國內外研究者進行了大量的研究以開發不同來源的凝乳酶。微生物生產凝乳酶具有周期短、產量高、提取方便、成本低、經濟效益高等優點，是目前最有發展潛力的凝乳劑[5-7]。

宮廷奶酪是我國的一種傳統乳酪產品，由江米酒凝固牛乳制作而成，口感細膩，具有良好的乳膠體穩定性。其制作過程中江米酒的凝乳作用主要與其中的凝乳酶有關[8-9]；該酶是江米酒發酵劑酒曲中微生物發酵代謝的產物[10-11]。江米酒是一種傳統安全食品,采用其中篩選得到的菌株進行發酵產凝乳酶，無須考慮非酶類代謝產物的安全性問題[12-13]。雖然細菌是酒曲中主要菌系組成之一，但國內尚無從酒曲中篩選高產凝乳酶細菌的相關報道。本實驗研究前期從甜酒曲中篩選得到1株產凝乳酶細菌，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，菌株編號為GSBa-1。本文通過對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發酵產凝乳酶條件的優化，利用乙醇分級沉淀制取凝乳酶，并研究了不同因素對其酶學性質的影響，驗證了該凝乳酶在干酪加工的潛在應用價值，為進一步研究開發食用安全的干酪加工用細菌凝乳酶奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1菌株由本實驗室分離純化并于-70 ℃冷凍保藏?；A發酵培養基(LB)：酵母提取物5 g/L，胰蛋白酶10 g/L，NaCl 10 g/L。脫脂乳粉,澳大利亞進口；酪蛋白,SIGMA公司；試驗試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

HWS 12恒溫水浴加熱鍋,上海一恒科學實驗裝備有限公司；HZQ-Q 氣浴恒溫搖床,哈爾濱東聯電子科技有限公司；高速離心機CR21GⅢ,日本日立有限公司；分光光度計U-3900,日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正交試驗設計

本試驗利用正交試驗設計4因素3水平(表1)共9個試驗點的試驗(表2)，研究解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發酵產凝乳酶的最佳條件。其中1、2、3分別代表自變量的低、中、高水平，測定每組實驗得到的發酵液凝乳酶活力。

表1 正交實驗設計因素水平表

1.3.2 菌株發酵實驗

基礎發酵LB液體培養基按不同裝液量分裝于100 mL三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫；把解淀粉芽孢桿菌GSBa-1甘油管種子(-70 ℃保存)室溫下融化，按體積分數3%(v/v)接種到30 mL已滅菌的 LB液體培養基中，搖勻培養14 h作為活化種子液；種子液按體積分數3%(v/v)接種到LB液體發酵培養基中搖勻，根據正交試驗設計因素(溫度、時間、轉速)于搖床中水平發酵。發酵完成后將發酵液于10 000 r/min離心30 min，取上清液，于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.3 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的提取

向4 ℃的粗酶液中加入預冷的無水乙醇，使混合后的乙醇體積分數為60%，離心后取上清繼續加入無水乙醇使乙醇體積分數為70%，迅速攪拌均勻，于4 ℃冰箱中靜置過夜，10 000 r/min 離心30 min，離心溫度4 ℃，收集沉淀，沉淀用0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解，用透析袋(8 000～14 000 Da)于4 ℃條件下透析48 h，之后冷凍干燥成凝乳酶凍干粉，于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.4 凝乳酶活力(milk-clotting activity, MCA)的測定

活力測定根據改進的MAGDA[14]方法，將脫脂乳粉溶于0.01 mol/L的CaCI2溶液配制成10%的脫脂乳溶液，室溫放置30 min；于35 ℃中保溫5 min，35 ℃下，準確量取待測酶液0.2 mL加入2 mL 10%的脫脂乳溶液中，迅速混勻，開始計時，準確記錄至絮狀凝集顆粒出現為止。凝乳酶活力的定義：在40 min內凝固100 g/L的脫脂乳1 mL所要的凝乳酶量規定是1個索氏單位(Soxhelt unit，Su)，計算公式見式(1)：

(1)

式中：MCA為發酵液酶活力，Su/mL；T為凝乳時間，s； D為酶液稀釋倍數。

式中：A為所測的凝乳酶活力,Su/mL；A0為對照的凝乳酶活力,Su/mL。

1.3.5 蛋白水解活力(proteolyticactivity,PA)測定方法[15]

取2mL1.5%酪蛋白溶液于35 ℃保溫5min，加入0.5mL預熱好的待測酶液混勻后繼續水浴恒溫放置60min，然后加入2mL8%的三氯乙酸終止反應，將沉淀過濾出去測定濾液在280nm處的吸光度A280。制備空白樣品時，先取0.5mL待測酶液直接與8%的三氯乙酸混合，使其立刻終止反應，后加入2mL1.5%酪蛋白溶液，重復過濾步驟，濾液作為空白對照，測定其在280nm處的吸光度A280＇。

本實驗條件下,60min引起A280增加0.001單位所需的酶量為1個酶活力單位，計算公式見式(2)：

1mL酶液的蛋白水解活力(U/mL)=2(A280-A280＇)

(2)

1.4 不同因素對凝乳酶的影響

1.4.1 溫度對凝乳酶活力的影響

分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃測定凝乳酶的凝乳活力和蛋白水解活力,重復3次。將55 ℃時測定的MCA和C/P值(即酶的凝乳活力與蛋白水解活力的比值)定義為100%,分別計不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力和C/P值。

1.4.2 凝乳酶的熱穩定性

將酶液分裝于試管中,分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴中溫育60min,在此期間，每隔10min取樣,迅速冷卻。在35 ℃條件下測定殘余凝乳酶的活性,重復3次。將未處理酶液的酶活力定義為100%,分別計算不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力。

1.4.3pH值對凝乳酶活力的影響

將酶液以及10%的脫脂乳用0.1mol/LHCI溶液和0.1mol/LNaOH溶液分別調pH值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,分別測定凝乳酶凝乳活力和蛋白水解活力，重復3次。將pH5.5條件下測定的MCA和C/P值定義為100%，分別計算不同值條件下凝乳酶的相對酶活力和C/P值。

1.4.4 凝乳酶的pH穩定性

用0.1mol/LHCI溶液和0.1mol/LNaOH溶液將酶液的pH調到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,在4 ℃下放置1h后,再用0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH將酶液的pH值統一調至6.5,在35 ℃下測定凝乳酶的殘余酶活,重復3次。將最高酶活力定義為100%，分別計算不同pH值條件下凝乳酶的相對酶活力。

1.4.5 金屬離子對凝乳酶活力的影響

在脫脂乳和1.5%的酪蛋白中，分別添加NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、ZnCl2、CuCl2FeCl2、AlCl3，使其濃度為5mmol/L，在35 ℃條件下分別測定凝乳酶的凝乳活力和蛋白水解活力，設定以不添加金屬離子的底物溶液(空白對照)測定的酶活力和C/P值為100%，分別計算不同條件下凝乳酶的相對酶活力和C/P值。

1.4.6Ca2+濃度對凝乳酶活力的影響

在脫脂乳中添加CaCl2，使其濃度分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mol/L，于35 ℃下測定凝乳酶的凝乳活力,重復3次。將最高酶活力定義為100%，分別計算不同條件下凝乳酶的相對酶活力。

1.4.7 酶動力學特性研究

1.4.7.1 酪蛋白底物濃度對凝乳酶活力的影響

分別配制0、2、4、6、8、10、12、14、16、18g/L的酪蛋白底物濃度，按照1.3.5蛋白酶活性測定方法，測得凝乳酶蛋白水解活性。

1.4.7.2 米氏常數和最大反應速率的測定

分別將不同酪蛋白底物濃度下測得的蛋白水解活力與底物濃度取倒數作圖，求米氏常數Km和最大反應速率Vmax。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的生產[16-18]

本研究采用4因素3水平的試驗即選用L9(34)正交表來設計實驗優化解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發酵產凝乳酶條件。正交試驗結果見表2。

表2 正交實驗優化設計及結果

由表2可知，4個因素對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發酵產凝乳酶凝乳活力的影響大小依次為溫度>裝液量>搖床轉速>發酵時間。由k值大小可知各因素選取水平及最優組合為A2B2C3D3，即發酵溫度35 ℃，裝液量40%，搖床轉速180 r/min，發酵時間84 h。根據最優組合條件，得到解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發酵產凝乳酶凝乳活力為558.14 Su/mL，高于試驗組5(試驗組最高)的凝乳活力533.33 Su/mL，且結果重復性好。由此優化發酵條件下，采用乙醇分級沉淀制備獲得的凝乳酶用于后續酶學性質的研究。

2.2 不同因素對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶酶學性質的影響

2.2.1 溫度對酶活力的影響

由圖1可知，當溫度低于25 ℃時，酶反應進行較慢，相對酶活力較低。在25～55 ℃，隨著反應溫度的上升，凝乳酶相對活力逐漸增大，當反應溫度為55 ℃時凝乳酶相對活力達到最大值；當溫度高于55 ℃時，相對酶活力下降明顯，到65 ℃時凝乳酶完全失活。因此該酶的最適凝乳溫度為55 ℃。韋薇等報道，小牛凝乳酶的最適反應溫度為50 ℃[19]。從米黑毛霉菌中得到的凝乳酶的最適溫度為60 ℃[20]，高于該酶的最適溫度。本實驗條件下，溫度對凝乳酶的C/P值影響與酶活力的影響趨勢一致, 凝乳酶的C/P值也在55 ℃時達到最大。

圖1 溫度對凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

在實際干酪加工中，干酪的苦味和其他不良風味大多是由凝乳酶的蛋白水解力較強降解酪蛋白產生的苦味肽物質所致[8]。因此蛋白水解活力低的凝乳酶，即C/P比值高的酶更適用于干酪加工中良好風味的形成。

2.2.2 酶的熱穩定性

由圖2所示，凝乳酶在25～45 ℃有較好的熱穩定性，此溫度區間溫育60 min后，均保持較高的相對酶活力。但繼續升高溫度，當達到50℃時保持40 min后，相對酶活力明顯降低；當溫度上升到55℃時，保持20 min后，相對酶活力持續性顯著損失，60 min后殘留的相對酶活力為40.77%；當溫度為60 ℃保持20 min，殘留的酶活只剩33.46%，保持50 min后酶活力完全喪失。韋薇等[19]報道的小牛凝乳酶 55 ℃保溫90 min，相對酶活力為 36.7%；60 ℃保持60 min酶完全失活。KUMAR等[21]發現Rhizopusoryzae凝乳酶60 ℃保持20 min，相對酶活力仍為48%。說明該凝乳酶的熱穩定性低于小牛和Rhizopusoryzae兩種凝乳酶。由于在干酪加工時需經過凝乳酶的滅酶環節(大約50 ℃)[22]，以減少殘留的凝乳酶作用產生苦味肽物質，因此該凝乳酶在干酪制作時有一定優勢。

圖2 凝乳酶的熱穩定性Fig.2 Thermal stability ofthe rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.3 pH值對酶活力的影響

在實驗條件下，當脫脂乳的pH調至5.0時，脫脂乳呈現出凝集狀態，因而無法測定凝乳活力。從圖3可以看出，凝乳酶在pH 5.5時，表現出最高的凝乳活力和C/P值；此后在pH為5.5～7.0之間，隨著pH的增大，相對凝乳酶活力和相對C/P值逐漸減小，當pH 7.5時酶活力完全喪失。據文獻[23]報道，毛霉菌Mucorbaciliformis產生的凝乳酶在pH值5.5時表現出最大的凝乳活力，與本結果一致。

圖3 pH對凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.4 酶的pH穩定性

由圖4所示，隨著pH升高相對凝乳酶活力逐漸增大，在pH6.5時，該凝乳酶相對酶活力達到最大值即凝乳酶活力穩定性最好；此后繼續升高pH，凝乳酶相對酶活力逐漸減小，當pH為8.5時，相對酶活力只剩38.32%。有研究表明在中性或弱堿性條件下，凝乳酶的凝乳活力會顯著損失，可能在這種條件下凝乳酶的構象發生了不可逆轉的變化[24]。還有文獻指出，因為pH對酶促凝乳的機理是復雜的，它不僅影響酶的穩定性而且影響酶的活性中心必需基團的解離程度、空間結構和底物的解離狀態[25]。

圖4 凝乳酶的pH穩定性Fig.4 pH stability of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.5 金屬離子對酶活力的影響

由圖5可知，與對照組相比，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+以及Al3+均對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，同時使C/P值也有不同程度的升值，其中添加Ca2+的作用最為明顯，為空白對照的1.57倍。而Na+、K+、Cu2+對凝乳酶的凝乳活力和C/P值均有抑制作用。

圖5 金屬離子對凝乳酶活力的影響Fig.5 Effect of metal ions on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

一般認為，由于Ca2+可與H+之間進行交換從而降低了底物的pH值，間接加快了酶促反應的速率。由于Ca2+可與酪蛋白膠束中的膠體磷酸鈣進行離子交換，使κ-酪蛋白膠束的表面電荷進一步減少，使膠束間的空間排斥力減小，導致大量的膠束互相靠近而凝聚，形成了交聯網狀結構。凝乳酶的來源不同，金屬離子也會對凝乳作用有不同的影響。吳進菊等[26]報道，Ca2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、K+和Mg2+對根霉F34凝乳酶活力具有促進作用，而Na+和Cu2+具有明顯的抑制作用。李玉秋[27]等研究表明，Ni2+和Fe2+對重組微小毛霉凝乳酶有抑制作用，Cu2+對凝乳酶活力沒有影響。在干酪加工過程中，鹽類一般具有防腐作用，并能增加干酪的功能性和感官效果，因此選擇合適種類的鹽類可以達到最佳的凝乳效果。

2.2.6 Ca2+離子濃度對酶活力的影響

由圖6可知，隨著Ca2+濃度增大，凝乳酶相對酶活力逐漸增大；當Ca2+濃度為0.020 mol/L時，相對酶活力達到最大值；此后繼續增加Ca2+濃度，相對酶活力持續降低。因此，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的最適Ca2+濃度為0.020 mol/L。當Ca2+濃度為0.020 mol/L時凝乳速度最快，凝固效果也最好，對凝乳酶凝乳活力的促進作用也最為顯著。因此在乳中添加適量的CaCl2以促進乳凝固，這也是西式干酪制作時添加的CaCl2原因，但CaCl2添加量不宜過大，否則會影響干酪的硬度、口感和風味。

圖6 CaCl2對凝乳酶活力的影響Fig.6 Effect of CaCl2 on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.7 酶動力學特性研究

2.2.7.1 底物濃度對酶活力的影響

由圖7可以看出，隨著底物濃度增大,凝乳酶對酪蛋白水解活性逐漸增大,當底物濃度小于8 g/L時,隨底物濃度增加,反應速度迅速隨之增大；當底物濃度大于8 g/L時,反應速度趨于穩定,繼續增大底物濃度,反應速度幾乎不受底物濃度的影響,這一結果符合米氏規律。

2.2.7.2 米氏常數和最大反應速率的測定

圖8 底物濃度倒數與酶活性倒數關系圖Fig.8 Relationship between the reciprocal of substrate concentration and the reciprocal of enzyme activity

由圖8可知，X軸上的截距即為-1/Km，Y軸上的截距即為1/Vmax，根據方程式求得Km=2.35 g/L，Vmax=1.18 U/mL。Km值是反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度，單位與底物濃度的單位一樣，是衡量酶與底物親和力大小的一個指標，從Km值的大小可以評價反應達到飽和的速度快慢。由于凝乳酶酶促凝乳作用并非簡單的酶學反應,因而無法直接用牛乳作為底物測定其Km，因此,在研究凝乳酶動力學特性時,通常選擇酪蛋白或血紅蛋白作為底物,以蛋白水解活性為指標進行研究[28]。高維東等[1]研究表明，微小毛霉凝乳酶的Km=0.023 8 mol/L，Vmax=1.122 7 mg/min。從本實驗結果來看，Km值較小，該凝乳酶酶解酪蛋白活性容易達到飽和，即在較高的底物濃度時，該凝乳酶對酪蛋白水解速度較慢，主要表現凝乳作用，從前面研究結果也能得出該凝乳酶具有較高的C/P值，這正是干酪生產中所需要的特性。

3 結論

本研究針對1株分離自酒曲的高產凝乳酶解淀粉芽孢桿菌GSBa-1菌株，獲得其產凝乳酶的最佳條件為發酵溫度35 ℃，裝液量40%，搖床轉速180 r/min，發酵時間84 h。在此最優發酵條件下菌株產凝乳酶活力為558.14 Su/mL。解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的最適反應溫度為55 ℃，在25～45 ℃之間酶活性穩定性較好。酶的最適反應pH為5.5，在pH<7.0之間，隨著pH的增大，凝乳酶活力逐漸降低；當pH>7.0時，凝乳酶活力完全失活。在pH6.5時，凝乳酶活力保持最為穩定。金屬離子對凝乳酶活性的影響研究顯示，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+以及Al3+均對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，其中Ca2+對凝乳活力的促進作用最為顯著，而Na+、K+和Cu2+對凝乳活力有抑制作用。酶水解酪蛋白底物的最大反應速度為1.18 U/mL，米氏常數為2.35 g/L。上述研究表明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶具有較高的凝乳活力和C/P比值，可作為傳統牛凝乳酶的替代品，具有潛在干酪生產應用價值。

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Production of rennet byBacillusamyloliquefaciensGSBa-1 and its enzymological characteristics

TENG Jun-wei, ZHENG Zhe, MEI Xue-yang, FU Qi-jie, ZHANG Jian, YANG Zhen-nai*

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology & Business University (BTBU)，Beijing 100048, China)

In this paper, fermentation conditions for the rennet production fromBacillusamyloliquefaciensGSBa-1 were optimized by the orthogonal experimental design method. The optimal conditions were as follows: fermentation temperature of 35 ℃, liquid loading volume of 40%, shaking speed of 160 r/min, fermentation time of 84 h. The milk-clotting activity of the enzyme produced under the optimal condition was 558.14 Su/mL. The rennet fromBacillusamyloliquefaciensGSBa-1 was prepared and further studies were carried out on factors affecting enzymological characteristics of the rennet. Results showed that the optimum reaction temperature was 55 ℃, the enzyme activity was stable between 25-45 ℃, and incubation at 60 ℃ for 50 min resulted in complete loss of enzyme activity. The rennet presented the highest enzymatic activity at pH5.5, then it gradually decreased with the increase of pH from 5.5 to 7.0, and the enzyme activity of rennet was the most stable at pH 6.5. The rennet activity was positively affected by Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+and Al3+, of which Ca2+showed the most significant promoting effect, and the milk-clotting activity reached maximum at Ca2+concentration of 0.02 mol/L, while Na+, K+and Cu2+showed inhibition effect on the milk-clotting activity. ThekmandVmaxof the enzyme were 2.35 g/L and 1.18 U/mL, respectively.

Bacillusamyloliquefaciens; rennet; orthogonal experimental design method; enzymological characteristics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612015

碩士研究生(楊貞耐教授為通訊作者，E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn)。

國家自然科學基金面上項目(編號：31371804)；北京市百千萬人才工程資助項目(B類)；2016年北京工商大學研究生科研能力提升計劃項目

2016-06-30，改回日期：2016-08-08