復合泡菜專用菌劑的制備與發酵性能評價

李玉斌，吳華昌，鄧靜*，劉陽，吉志偉，易宇文，彭毅秦

1(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢，643000) 2(四川旅游學院,烹飪科學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都，610000)

復合泡菜專用菌劑的制備與發酵性能評價

李玉斌1，吳華昌2，鄧靜2*，劉陽2，吉志偉2，易宇文2，彭毅秦2

1(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢，643000) 2(四川旅游學院,烹飪科學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都，610000)

以實驗室保藏的1株乳酸菌與1株酵母菌為研究對象，采用真空冷凍干燥技術制作活菌制劑，并對菌劑發酵性能進行評估。結果表明：經4 ℃、6 500 r/min，13 min離心收集菌體，再以10%蛋白胨+3%維生素C為保護劑，真空冷凍干燥后，酵母菌與乳酸菌凍干存活率分別達86.3%、87.8%。將自制復合菌劑用于甘藍發酵，并與市售菌劑、自然發酵比較：添加自制菌劑發酵的甘藍pH、總酸度提前2 d趨于穩定，分別為5.4、11.05 g/100 g；亞硝酸鹽含量更低，最大值僅為7.07 mg/kg；初步認定乙醇(42.46%)、苯乙醇(13.47%)、4-乙基苯酚(6.77%)、順-3-己烯醇(4.48%)為自制菌劑發酵甘藍的主要風味物質。此復合菌劑具有較好的產酸產香能力，其在泡菜行業具有良好的應用前景。

酵母菌；乳酸菌；菌劑；發酵性能

傳統泡菜生產多采用陳泡菜水自然發酵法，此法成本低、操作簡單、風味較好，但也存在生產周期長、質量不穩定、受環境影響大等弊端。直投式菌劑因其發酵周期短、亞硝酸鹽含量低、產品質量穩定等優點受到人們的重視[1-4]。目前，泡菜菌劑的制作以乳酸菌為主，包括植物乳桿菌[5]、短乳桿菌[6]、胚牙乳桿菌、腸系膜明串珠菌[7]等，這些菌劑與傳統自然發酵泡菜相比，雖產酸速率快、亞硝酸鹽含量低，但由于菌種單一，而導致風味不足[7-8]。

目前國際上生產活菌制劑的技術主要有真空冷凍干燥、噴霧干燥等[9]。其中，真空冷凍干燥是多數微生物菌劑制作的方法[12-14]，此法生產的菌劑與噴霧干燥技術相比具有更高的活菌存活率。在真空冷凍干燥中，菌體的收集、凍干保護劑選擇及凍干條件等因素影響凍干菌劑的活菌存活率，而菌體的收集與保護劑的選擇對菌劑活菌存活率影響十分顯著。

研究以實驗室保藏的1株益生乳酸菌與1株產香酵母菌為研究對象，采用真空冷凍干燥技術，探究凍干前預處理條件(菌體收集條件、保護劑的選擇)對活菌存活率的影響，并將自制菌劑投放于結球甘藍中發酵，與市售菌劑、自然發酵的甘藍比較，對3種菌劑的發酵性能進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

二甲基亞砜(DMSO)、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘已二胺、亞硝酸鈉，以上試劑均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；MTT，美國Amresco公司。

菌種：戊糖乳桿菌、酵母菌(Kazachstaniabarnettii)，實驗室保藏(2株菌的益生、產香性能已被鑒定)；川秀泡菜乳酸菌發酵粉，市售；結球甘藍，購于自貢市某農貿市場。

酵母菌的活化與培養為YPD培養基；乳酸菌的活化與培養為MRS培養基。

1.2 儀器與設備

Thermo 1500全自動酶標儀，Thermo公司；SJIA-10N真空冷凍干燥機，寧波雙嘉儀器有限公司；Universal 320R冷凍離心機，德國Hettich公司；50/30μm DVB/AR/PDMS萃取頭，Agilent -5975氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡菜菌劑制作工藝流程

1.3.2 菌種的活化與培養

酵母菌活化與培養：挑取4 ℃斜面保存的酵母菌單菌落，于50 mL滅菌的YPD種子液培養基中，于28 ℃培養24 h。配制300 mL YPD液體培養基，均分于3個三角瓶中，滅菌后加入2%(v/v)的YPD種子液，于28 ℃靜置培養18 h。

乳酸菌活化與培養：乳酸菌活化與培養的步驟同酵母菌，但乳酸菌活化、培養于MRS培養基中，培養溫度為37 ℃，培養時間為18 h。

1.3.3 MTT法測定菌體存活率

按文獻[15]方法，略有修改。取100 μL酵母菌菌懸液于96孔細胞培養板中，每個樣做3組平行，以不接菌的培養基做空白對照，加入MTT溶液20 μL，混勻后避光置于28 ℃(乳酸菌為37 ℃)培養箱中，2 h后取出，加入二甲基亞砜100 μL，充分溶解，測定OD500 nm。

1.3.4 離心收集條件對菌體離心存活率的影響

以乳酸菌、酵母菌離心存活率為指標，分別對離心轉速、溫度、時間進行考察，設計L9(34)正交實驗，確定2菌體的最佳離心收集條件。

1.3.5 保護劑對菌體凍干存活率的影響

1.3.5.1 單一保護劑的選擇

分別以5%海藻糖、10%葡萄糖、5%甘油、5%谷氨酸鈉、5% Vc、10%蛋白胨作為保護劑，0.22 μm的微孔濾膜過濾備用。按1.3.2、1.3.4小節活化培養與收集菌體，加入1 mL PBS溶液混勻，形成菌懸液，以1∶2體積比添加上述7種保護劑，放置30 min后，-20 ℃預凍2 h。預凍完成后，轉移至真空冷凍干燥機中進行凍干，凍干條件為：-80 ℃，真空度1 999.8，時間12 h。以凍干菌體存活率為檢測指標，確定最佳單因素凍干保護劑。

1.3.5.2 復合保護劑配比的確定

根據單一保護劑篩選結果，選擇凍干效果較好的低分子與高分子保護劑作為復合保護劑進行凍干實驗，復合保護劑添加體積比為1∶2，以菌體凍干存活率為檢測指標，確定最佳保護劑配比。

1.3.6 泡菜制作

將甘藍去桿、去壞葉后洗凈瀝干，稱約3 kg結球甘藍至4 L泡菜壇中，加入4%的鹽水至2/3壇，再添加菌劑(0.1%自制復合菌劑、0.1%市售菌劑發酵、自然發酵)，補充鹽水至壇滿，加蓋密封發酵。每種發酵方式做3組平行。自制菌劑混合比例為1∶2(乳酸菌∶酵母菌)，活菌數達到106CFU以上。

1.3.7 泡菜理化指標測定

pH：酸度計測定；總酸度：按GB 5009.7—2008測定[16]；亞硝酸鹽含量：按GB 5009.33—2010測定[17]。

1.3.8 泡菜揮發性風味物質測定

1.3.8.1 樣品處理

稱取適量3種方式發酵7 d的泡菜，制作勻漿，準確稱取勻漿5.0 g裝入15 mL樣品瓶中，備用。

1.3.8.2 頂空固相微萃取(Headspace SPME)條件

將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，70 ℃平衡30 min、吸附10 min后，將萃取頭取出并插入GC進樣口，同時啟動儀器采集數據，解吸3 min。

1.3.8.3 GC-MS分析條件

HP 5890/5975 GC/MS聯用儀, 色譜柱：HP-5MS型(30 m×0.250 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣；進樣溫度：230 ℃；進樣量: 1 μL；升溫程序: 初溫45 ℃保持2 min，5 ℃/min上升至180 ℃，保持1 min，25 ℃/min升到230 ℃，保持5.5 min。

1.3.8.4 數據處理

由計算機質譜系統NSIT與RTLPEST檢索未知化合物，匹配度大于800(最大1 000)的結果將予以報告，面積歸一法計算各成分的含量。

1.3.9 感官評價

10位品評人員對泡菜感官特征進行描述，包括香氣、質地滋味及色澤體態等[19]，對各項指標進行權重與尺度建立，評價標準見表1。

表1 感官評價標準

2 結果與分析

2.1 菌體最佳離心收集條件的確定

2.1.1 菌體離心收集單因素試驗

由于酵母菌與乳酸菌細胞壁結構的差異，使兩菌對離心剪切力承受能力不同，影響菌劑的活菌存活率，后序研究中將兩菌分開進行離心與凍干。實驗分別固定離心轉速9 000 r/min、時間15 min、溫度5 ℃，考察離心轉速(3 000、5 000、7 000、9 000、11 000 r/min)、離心溫度(0、5、10、15、20 ℃)、離心時間(5、10、15、20、25 min)對酵母菌與乳酸菌離心存活率的影響，結果如圖1～3：酵母菌與乳酸菌最佳單因素離心條件為轉速7 000 r/min、溫度5 ℃、時間15 min。

圖1 不同離心條件下各菌體的存活率Fig.1 Survival rate of thallus under different conditions of centrifugation

2.1.2 乳酸菌與酵母菌最佳離心收集條件的確定

根據單因素試驗結果，設計L9(34)正交試驗，結果如表2和表3所示。對乳酸菌離心存活率影響大小為A(轉速)>B(溫度)>C(時間)，最佳離心條件為轉速7 500 r/min、離心時間13 min、離心溫度4 ℃；對酵母菌離心存活率影響依次為C (溫度)> B (時間)> A (轉速)，最佳離心條件為離心轉速7 000 r/min、時間15 min、溫度4 ℃。

表2 乳酸菌離心收集的正交實驗結果

表3 酵母菌離心收集的正交實驗結果

2.2 保護劑對菌體凍干存活率的影響

2.2.1 單一保護劑對酵母菌與乳酸菌凍干存活率的影響

菌劑制備中，冷凍和干燥兩個過程都會造成菌體的細胞膜破裂，從而使微生物活性降低甚至消失，通過添加一定量的保護劑，可使菌體的存活率大大提高。凍干保護劑可分為低分子保護劑與高分子保護劑[22]。低分子保護劑可與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或菌體蛋白質極性基團形成氫鍵，保護細胞膜和蛋白質結構與功能的完整性[20]。而高分子保護劑則通過“包埋”形式保護菌體，同時促進低分子保護劑發揮作用[21-22]。實驗選取一種高分子保護劑(蛋白胨)與六種低分子保護劑(海藻糖、葡萄糖、甘油、谷氨酸鈉、Vc、PBS溶液)進行凍干(見圖2)。

圖2 七種保護劑下乳酸菌與酵母菌的凍干存活率Fig.2 The survival rate of freeze-dry of LAB and yeast protected by seven protective agents

圖2可知，7種保護劑對乳酸菌凍干保護效果依次為：海藻糖> Vc >蛋白胨>甘油>谷氨酸鈉>葡萄糖>PBS，其中，海藻糖、蛋白胨和Vc效果最佳，凍干存活率分別為54.58%、42.55%、44.65%，甘油和谷氨酸鈉效果類似，PBS保護效果最差，凍干存活率僅為24.75%；7種保護劑對酵母菌凍干保護效果依次為：海藻糖>蛋白胨>Vc>谷氨酸鈉>甘油>葡萄糖>PBS，以海藻糖、蛋白胨和Vc效果最好，凍干存活率分別為59.14%、56.28%、52.90%，PBS保護效果最差，凍干存活率為24.87%。由于海藻糖成本高、保護優勢不明顯，因此選擇保護效果良好且成本較低的蛋白胨與Vc作為復合保護劑。

2.2.2 復合保護劑對酵母菌與乳酸菌凍干存活率的影響

與復合保護劑相比，單一保護劑對菌體的保護效果較差，不能滿足菌體抵抗外界惡劣的條件，一般按一定配比制作復合保護劑，保護劑之間形成優勢互補，提高菌體的凍干存活率。實驗選用單一保護效果較佳的蛋白胨與Vc(8%蛋白胨+3%Vc、8%蛋白胨+5%Vc、8%蛋白胨+7%Vc、10%蛋白胨+3%Vc、10%蛋白胨+3%Vc、10%蛋白胨+3%Vc、12%蛋白胨+3%Vc、12%蛋白胨+3%Vc、12%蛋白胨+3%Vc)進行復合保護劑配比優化，研究其保護效果(圖3)。

1-8%蛋白胨+3%Vc；2-8%蛋白胨+5%Vc；3-8%蛋白胨+7%Vc；4-10%蛋白胨+3%Vc；5-10%蛋白胨+3%Vc；6-10%蛋白胨+3%Vc；7-12%蛋白胨+3%Vc；8-12%蛋白胨+3%Vc；9-12%蛋白胨+3%Vc圖3 復合保護劑保護效果Fig.3 Effect of protection by compound protective agents

由圖3可知：對于乳酸菌，保護劑配比為10%蛋白胨+3%Vc時保護效果最佳，菌體凍干存活率達87.8%，8%蛋白胨+7%Vc效果最差，僅為63.1%。對于酵母菌，復合保護劑配比為8%蛋白胨+5%Vc保護效果最好，凍干存活率達86.8%，12%蛋白胨+3%Vc保護效果最差，其凍干存活率僅為65.5%。綜合乳酸菌與酵母菌在9種不同配比復合保護劑下的凍干存活率，選擇復合保護劑配比為10%蛋白胨+3%Vc，此時酵母菌與乳酸菌凍干存活率分別達到86.3、87.8%。

2.3 菌劑發酵性能評價

2.3.1 不同菌劑發酵甘藍pH值與總酸度變化

pH值是泡菜發酵的一個重要指標，一般認為當pH≤4時即為發酵終點。實驗比較自制菌劑、市售菌劑與自然發酵泡菜pH值與總酸度變化(見圖4和圖5)：隨著發酵進行，甘藍的pH值逐漸降低，在3.5左右趨于穩定，總酸度先增大后趨于穩定。但同時自制菌劑、市售菌劑、自然發酵甘藍的pH值與總酸度變化速率不同，pH值分別在第3、5、7 d后保持穩定，總酸度分別于第5、7、7天趨于穩定，為11.05、12.38、12.44 g/100 g。自制菌劑有顯著的產酸能力，這一研究結果與余文華等人在研究直投式菌劑發酵泡菜時所得結論一致[4]。泡菜pH值與總酸度最后趨于穩定，是由于乳酸菌大量繁殖產酸，使乳酸積累過量，抑制了乳酸菌的生長[23]。

圖4 不同菌劑發酵甘藍的pH值變化Fig.4 The pH changes of cabbage fermented by different inocula

圖5 不同菌劑發酵甘藍的總酸變化Fig.5 The total acid changes of cabbage fermented by different inocula

2.3.2 不同菌劑發酵甘藍亞硝酸鹽含量的變化

腌制蔬菜制品中的亞硝酸鹽主要是由部分革蘭氏陰性菌的硝酸還原酶將細胞質中的硝酸鹽還原而來，可造成人體急性或慢性中毒[24]。目前我國醬腌菜衛生標準(GB2714—2003)中規定亞硝酸鹽含量不超過20 mg/kg。實驗比較不同菌劑發酵甘藍亞硝酸鹽含量的變化情況(見圖6)

圖6 不同菌劑發酵甘藍亞硝酸鹽含量的變化Fig.6 The nitrite content changes of cabbage fermented by different inocula

由圖6可知：自然發酵、市售菌劑、自制菌劑的泡菜亞硝酸鹽含量均呈先增大后減小的趨勢，分別在第5、2、2天達到最大值27.75、19.44和7.07 mg/kg，于第7天后基本趨于穩定，分別為4.36、3.56、2.66 mg/kg。自然發酵泡菜在第2～5天亞硝酸鹽含量超過20 mg/kg，市售菌劑發酵泡菜亞硝酸鹽含量于第2天時接近20 mg/kg，而自制菌劑發酵的泡菜亞硝酸鹽含量遠低于20 mg/kg。因此從安全性上來說自制菌劑比市售菌劑好，而自然發酵最差，這一研究結果與袁亞等人在研究人工接種乳酸菌對泡菜亞硝酸鹽含量影響時得到的結論一致[25]。

2.4 不同菌劑發酵甘藍揮發性風味成分比較

由不同菌劑發酵甘藍的理化指標變化可知：發酵7 d后泡菜的酸度、pH值與亞硝酸含量趨于穩定，泡菜基本成熟。準確稱取發酵7 d的泡菜勻漿各5.0 g，經頂空固相微萃取后進行GC-MS分析，揮發性風味物質的相對含量見表4。

表4 不同菌劑發酵甘藍的揮發性風味成分比較

異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯、順-3-己烯醇是新鮮青菜中的主要香味物質，相對含量分別為71.92、10.27、4.24%。異硫氰酸烯丙酯與3-丁烯基異硫氰酸酯具有辛辣味，廣泛存在于芥菜、山葵、辣根等十字花科蔬菜及其制品中[29]。新鮮甘藍發酵7 d后，自制菌劑發酵甘藍中未檢測出異硫氰酸烯丙酯，市售菌劑、自然發酵甘藍中異硫氰酸烯丙酯相對含量分別減少到6.89%和12.09%，降低了90.42%和83.19%；3種菌劑發酵的甘藍中均未檢測出3-丁烯基異硫氰酸酯；這兩種硫氰酯的減少或消失有效降低了青菜的辛辣感，是微生物代謝活動的結果。順-3-己烯醇，又稱葉醇，是一種重要的不飽和脂肪醇，具有清新的草香味。新鮮甘藍經自制菌劑、自然發酵，葉醇的相對含量分別增加到4.48%和12.24%，上升了5.37%和188.68%，市售菌劑發酵泡菜相對含量減少到0.56%，下降了86.79%，這可能是菌種代謝特性不同造成的。

新鮮甘藍經自制菌劑、市售菌劑、自然發酵，苯乙醇相對含量分別增加到13.47和8.06、4%，其中，自制菌劑發酵與其他2種發酵方式相比，苯乙醇含量分別上升了67.12%和236.75%。苯乙醇是酵母菌將L-苯丙氨酸經脫氨酶、脫羧酶、還原酶作用產生，具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[30]，有助于增加泡菜風味。4-乙基苯酚是新鮮青菜經自制菌劑、市售菌劑、自然發酵產生的香味物質，相對含量分別為6.77%、2.52%和5.56%，該物質具有特殊的香氣[28]，是由酵母菌將乙烯基分解產生，在葡萄酒和郫縣豆瓣醬中均有檢出[29]。

3種發酵方式相比，自制菌劑既可有效地降解新鮮甘藍中辛辣物質(異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯等)，又可顯著增加泡菜中特殊風味成分的含量(順-3-己烯醇、苯乙醇、4-乙基苯酚等)，是一種可提高泡菜風味的菌劑。

2.5 不同菌劑發酵甘藍的感官評價

新鮮甘藍經自制菌劑、市售菌劑、自然發酵7 d后，各取適量泡菜進行感官評價，結果如表5所示，自制菌劑發酵泡菜感官評價最優為91分，市售菌劑發酵泡菜次之，自然發酵泡菜最差。自制菌劑發酵泡菜色澤、香味、滋味、質地均高于其余二者，是由于自制菌劑產酸能力強，發酵初期大量產酸，鈍化了使蔬菜組織軟化的酶的活性，賦予產品清脆的質地[30]。香味上，自制菌劑發酵泡菜具有明顯的玫瑰香味，香味得分最佳，為28分。

表5 不同菌劑發酵甘藍的感官評價

3 結論

(1)研究采用正交設計確定了混合菌體最優離心收集條件為轉速6 500 r/min、時間13 min、溫度4 ℃，此條件下酵母菌與乳酸菌離心存活率分別達到88.1、92.4%。以10%蛋白胨+3%Vc為凍干保護劑，凍干12 h后，酵母菌與乳酸菌凍干存活率可達到86.3、87.8%。

(2) 3種菌劑發酵甘藍相比：自制菌劑在產酸速率上具有明顯的優勢，其pH值在第3天達到3.5，總酸度于第5天達到11.05 g/100 g，與其他2種發酵方式相比縮短了2 d；自制活菌制劑發酵泡菜的亞硝酸鹽含量最大值僅為7.07 mg/kg，遠低于國標規定的最大值20 mg/kg，安全性更好；風味上，自制菌劑發酵泡菜的風味物質在第7天時達到6種，初步認定乙醇(42.46%)、苯乙醇(13.47%)、4-乙基苯酚(6.77%)、順-3-己烯醇(4.48%)是其主要的風味物質；感官上，自制菌劑泡菜最優(91分)。研究結果可為優質泡菜菌劑的工業化生產提供一定的參考。

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Preparation of a complex bacteria agent for pickles and evaluation of fermentation performance

LI Yu-bin1, WU Hua-chang2, DENG Jing2*, LIU Yang2, JI Zhi-wei2, YI Yu-wen2, PENG Yi-qin2

1(College of Bioengineering, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong 643000, China) 2(Cooking Science Key Laboratory, Sichuan Tourism University, Chengdu 610000, China)

In this study, a lactic acid bacteria strain and a yeast strain preserved in laboratory were used to prepare live bacteria agent by vacuum freeze-drying technology, and fermentation performance of live bacteria agent was evaluated. Results showed that bacteria were collected by centrifugation (4 ℃, 6 500 r/min, 13 min) with 10%peptone and 3% vitamin C as protective agent, the survival rates of yeast and lactic acid bacteria after vacuum freeze-drying were 86.3% and 87.8%, respectively. Fermentation using self-made bacteria agent was compared with commercial bacteria agent and natural fermentation. The pH and total acid of cabbage fermented by self-made bacteria agent were 5.4 and 11.05 g, which showed stronger acid-producing capability than others. The maximum content of nitrate from fermentation using self-made bacteria agent was lower than that from other fermentation, which was only 7.07 mg/kg. Ethanol (42.46%), benzene ethanol (13.47%), 4-ethyl phenol (6.77%) and cis -3-hexenol (4.48%) were preliminarily identified as the main volatile flavor compounds of self-made bacteria agent. The self-made bacteria agent with stronger acid production and aroma-producing ability would have good application prospects in the pickle industry.

yeast; lactic acid bacteria; bacteria agent; fermentation performance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612018

碩士研究生(鄧靜教授為通訊作者,E-mail：79190096@qq.com)。

四川省教育廳自然科學基金(15ZA0315);四川省科技廳(2016NZ0018);四川省科技廳(2016FZ0027);成都市科技局(2015-NY02-00360-NC)

2016-03-25，改回日期：2016-07-15