茶葉中鍵合態香氣前驅物的利用

龍丹，劉曉輝*，吳函殷，劉盼盼，羅龍新

1(深圳市深寶實業股份有限公司，廣東 深圳,518040) 2(深圳市深寶華城科技有限公司，廣東 深圳,518115)

茶葉中鍵合態香氣前驅物的利用

龍丹1，劉曉輝1*，吳函殷2，劉盼盼2，羅龍新1

1(深圳市深寶實業股份有限公司，廣東 深圳,518040) 2(深圳市深寶華城科技有限公司，廣東 深圳,518115)

基礎研究表明，茶葉中的香氣物質絕大部分是以鍵合態的糖苷類香氣前體存在，難以被開發利用。為了有效將對香氣貢獻極微的前體物質有效轉化為可揮發性香氣物質，該文采用正交試驗優化酸解時間、酸解溫度、酸解pH值、提香酶添加量和酶解時間等因素。研究結果表明，對揮發性香氣物質總量影響因素從強到弱依次為：酸解時間、酶解時間、酶用量、酸解溫度、酸解pH值。獲得最多量的茶葉揮發性香氣總量的最優參數為：在溫度為60 ℃、pH=3.0條件下酸解0.5 h，隨后添加質量分數0.5%的提香酶在45 ℃中處理0.5 h。對比空白組，處理組的揮發性香氣總量提升89%，其中萜烯醇類糖苷物質提升11.1倍。

茶葉；鍵合態香氣前驅物；酸解；酶解；正交設計

香氣是決定茶葉品質的重要因子之一，在茶樹生長過程中，所形成的香氣物質一部分呈游離態的芳香性揮發物，但絕大部分是以鍵合態的香氣前體形式存在[1]。鍵合態香氣前體多以糖苷類為主，其糖基部分主要是β-D-葡萄糖、β-櫻草糖、β-巢菜糖，配基部分(即苷元)主要是萜烯醇類、芳香醇類和脂肪醇類。其中，芳樟醇、苯乙醇、苯甲醇等萜烯醇類化合物是具有典型花香和果香的物質[2](如圖1)。糖苷類鍵合態物質本身無味，但在采摘、水分虧缺、葉片損傷等脅迫環境下，或者是萎凋、揉捻、做青等加工過程中，易水解釋放出苷元(即香氣物質)，從而構成了茶葉香氣品質的物質基礎[3]。多篇文獻陸續確定了茶葉中多種揮發性香氣組分中的呈香成分及其與糖苷類香氣前體的密切關系[4]。

圖1 烏龍茶中分離得到的芳樟醇、苯甲醇、苯乙醇結構Fig.1 Structures of (S)-Linalyl, 2-Phenylethyl, and Benzyl DisaccharideGlycosides Isolated fromOolong Tea Leaves

在茶葉深加工領域，香氣寡淡是速溶茶產品普遍存在的瓶頸問題。如何將茶葉中鍵合態香氣前體物質轉化為游離態揮發性香氣物質加以利用一直備受關注。目前，主要技術手段有超高壓法、酶解法、酸解法。超高壓法依賴于高壓設備，一次性投入較大，一直以來僅停留于實驗室階段。相比之下，酶解法和酸解法的原輔料成本較低，對加工設備無特殊要求，增香效果明顯且操作簡便，是茶葉深加工中優先考慮的方法?，F有文獻多集中在使用酶解法增加茶葉香氣，添加酶制劑種類較多且酶解耗時較長，而利用“先酸解”快速釋放香氣，結合“后酶解”塑造香型，實現高效短時的增香方法基本未曾涉及。本文運用單因素實驗和正交實驗，試從酸解結合酶解共同釋香的角度，重點闡述其對茶葉香氣的改善。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

炒青綠茶由浙江泰龍制茶有限公司提供；提香酶由天野阿瑪諾公司提供。試劑：檸檬酸、癸酸乙酯。

1.2 儀器與設備

SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海博訊實驗有限公司醫療設備廠；R201D旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；Abbemat 300折光儀，Anton Paar；GC-MS(GC:7890A,MS:5977A)，安捷倫科技有限公司。手動SPME進樣器、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydime thylsiloxane, DVB/ CAR / PDMS)萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酸解處理

在酸解單因素試驗中，首先以80～90 ℃熱水按1∶15茶水比沖泡茶葉，隨后分別按照不同pH值(pH=2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；80 ℃下酸解1 h)、不同溫度(50、60、70、80 ℃；pH=4.0酸解1 h)、不同時間(1、3 h；80 ℃下pH=4.0)，在水浴恒溫環境中進行酸解處理。處理結束后，進行湯渣分離，收集茶湯待香氣檢測。

1.3. 2 酶解處理

在酶解試驗中，首先以80～90 ℃熱水按1∶15茶水比沖泡茶葉，隨后冷卻至40～50 ℃，用檸檬酸調節茶湯pH=4.5(酶解最適pH值)，按占茶葉重量0.3%添加提香酶制劑，在45 ℃水浴恒溫環境中酶解處理1 h。處理結束后，進行湯渣分離，收集茶湯待香氣檢測。

1.3.3 酸解酶解正交設計

在單因素試驗的基礎上，采用L16(45)正交試驗設計，因素水平隨機編號如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.4 香氣成分檢測方法

采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用法(HS-SPME/GC-MS)，添加癸酸乙酯為內標輔助定量分析。將茶湯稀釋至統一濃度(brix=0.5%)，取30 mL茶湯于60 mL頂空瓶中，加入6 g NaCl及已知量的癸酸乙酯后，立即放入50 ℃水浴鍋中平衡10 min，隨后推出SPME萃取頭吸附40 min，隨即插入GC儀進樣口解吸附3 min，同時收集數據。

GC條件：HB-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度240 ℃；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min。升溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min。

MS條件：電子電離源：電子能量70 eV；質量掃描范圍50～450 u；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；質譜傳輸線溫度280 ℃。

2 結果與討論

2.1 酸解

據文獻報道[5-7]，稀酸處理能有效催化水解植物細胞內糖苷類物質的糖苷鍵(縮醛結構)，使之生成相應的糖和配基(呈香物質)。前期預試驗發現：酸解反應釋放茶香的效果是與酸解時間、酸解pH值、酸解溫度3個因素密切相關。

2.1.1 酸解不同時間后茶葉釋放香氣情況

如圖2、表2所示，在pH=4，水浴80 ℃的環境下，酸處理茶葉1 h后的香氣物質總量由對照組的21.8 μg/L增至91.1 μg/L，酸處理3 h后增至93.1 μg/L，提高近3倍。從香氣組分上分析，醇類物質經由酸處理后增長近8倍，是拉動香氣總量上升的主要物質，其中，以芳樟醇、香葉醇為代表性萜烯醇類苷元，在酸解1 h后含量分別增加11倍和3.8倍；以苯甲醇為代表的芳香族醇類苷元在酸處理1 h后被釋放。從香氣的感官審評上看，對照組以清香為主，酸處理20 min后熟栗香明顯，40 min后熟栗香伴隨水果香，60 min后水果香濃郁。隨著酸處理時間的延長，香氣的馥郁程度隨之升高，香型由“清香型”向“花果香型”轉變，是酸水解糖苷釋放呈香苷元的又一證明。

從酸解時間對揮發性香氣的影響看，由1 h延長至3 h在香氣總量和組分上沒有顯著差別，說明酸解法能在1 h內極大程度地水解釋放出大部分的香氣物質。

圖2 酸解不同時間對香氣組分的影響Fig.2 The effect of acidhydrolysisduration on aroma constituents

表2 酸解不同時間對香氣組分的影響

2.1.2 不同溫度下酸解茶葉釋放香氣情況

如圖3所示，在50～70 ℃范圍內，揮發性香氣物質總量隨酸處理溫度上升而上升，80 ℃條件下香氣總量較70 ℃略有下降，可能與高溫加速香氣物質揮發逸散和熱劣變有關。從香氣組分上看，無論在何種溫度下酸處理，所得茶湯揮發性成分含量由高到低依次為：醇類、醛類、酮類、酯類。隨著酸處理溫度的上升，醇類物質進一步升高，主要包括(含量由高到低)：芳樟醇、萜品醇、香葉醇、α-雪松醇。當酸解溫度升高至時70 ℃，出現反-氧化芳樟醇、脫氫芳樟醇、萜烯醇等新增香氣物質，其中前兩者是芳樟醇的氧化或還原產物，也呈類似花果香型，增量較為迅速。

圖3 不同溫度下對香氣組分的影響Fig.3 The effect of different temperatures on aroma constituents

2.1.3 不同pH下酸解茶葉釋放香氣情況

圖4表明，茶葉在pH=3.0的酸解條件下，揮發性香氣物質總量最高，其中醇類物質提高較為顯著，當pH上升至3.5時基本沒有起到酸解釋香的作用。與此類似的是，水果中的鍵合態香氣物質在不同pH值調節條件下酸解釋香程度也存在顯著差異[8-9]。在溫和的酸性環境中，葡萄、樹莓、煙草等植物材料中的部分鍵合態香氣物質會自發地進行緩慢水解進而逐步釋放香氣物質，隨著人為降低酸解環境的pH值，鍵合態香氣物質的種類急劇增多，在pH值極低的劇烈酸性環境中甚至能夠發生化學變化而生成新物質，如萜烯類物質的分子重排等[10]。

圖4 不同pH環境對香氣組分的影響Fig.4 The effect of different pH on aroma constituents

2.2 酶解

如圖5所示，提香酶處理后揮發性香氣總量在原有基礎上提升60.29%，特別有助于醇類、醛類和酯類香氣物質的釋放。

圖5 提香酶對香氣組分的影響Fig.5 The effect of flavoring enzyme on aroma constituents

2.3 酸解結合酶解正交試驗

由表3得知，對茶葉揮發性香氣物質總量影響因素強弱依次為：B(酸解時間)>E(酶解時間)>D(酶用量)>A(酸解溫度)>C(酸解pH值)。在所選因素水平范圍內，理論上最佳提香工藝為A1B1C2D4E1，即在溫度為60 ℃、pH=3.0下酸解0.5 h，隨后在45 ℃下添加0.5%提香酶1酶解0.5 h，得到茶葉揮發性香氣物質總量最大。

表3 正交試驗處理結果

經由最佳提香工藝(A1B1C2D4E1)處理后，茶湯呈顯濃郁的水果香。如表4所示，處理組香氣總量較對照提升89%，其中醇類芳香物質，特別是萜烯醇類香氣物質在酸解酶解復合工藝下得以有效釋放，提升11.1倍。在這一過程中，不僅具有花果香氣的芳樟醇(增長32倍)、α-萜品醇(增長21倍)、香葉醇(增長6.9倍)增量顯著，而且新增了具有典型綠茶清香的“反-3-己烯醇”以及具有花果香的橙花叔醇、橙花醇、苯甲醇等芳香物質。

表4 醇類香氣物質釋放

3 討論

自1969 年FRANCIS[11]從玫瑰花瓣中分離得到糖苷形式的單萜醇以來，糖苷類鍵合態香氣物質的相關研究開始進入人們的視野。目前，已從茶葉中鑒定出二十多種糖苷類香氣前體[12-13]，主要是以芳樟醇及其氧化物、香葉醇、橙花醇、苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇和水楊酸甲酯等為配基的糖苷, 上述糖苷水解釋放后, 配基成為游離態茶葉香氣成分, 是高檔茶葉呈現花、果香的重要物質基礎, 能顯著提速溶茶制品的香氣品質[14-15]。

在傳統茶類的加工過程中，不同的工藝流程會不同程度地釋放糖苷類物質[16]，但絕大部分糖苷類物質依然保留在葉底中，難以得到有效釋放和利用?，F階段，促使茶葉糖苷類鍵合態香氣物質釋放游離態香氣物質的常用方法主要有酸解法[6]或酶解法[17]。從原理上看，糖苷鍵屬于縮醛鍵，能被酸催化水解，生成相應的糖和配基物質(香氣物質)，向茶葉中添加外源酸會加速這一轉化過程，是一種簡單可行的水解方式。而酶解法水解糖苷時，糖基部分變為活性較高的半椅式構象，糖苷鍵上的氧原子從酶分子上獲得質子(H)，并以ROH的形式脫落，游離成為香氣物質[18]。從反應的特點看，酸解法反應條件較為劇烈，且對底物不具有選擇性，能短時間內徹底打開糖苷鍵，釋放大量香氣物質，增加速溶茶制品的香氣的濃度。酶解法反應條件較為溫和，產物種類較為豐富，香型較為愉悅。2種方法結合的優勢在于，一方面，酸解法能在短時間內大大增加香氣的濃度和馥郁程度，在此基礎之上，繼續酶解茶葉，能豐富茶葉香氣物質的種類，有利于香型的塑造；另一方面，酸解處理后茶葉組織軟化破碎，有利于下一步酶解的進行。

本文以炒青綠茶作為原料，以揮發性香氣物質總量為指標，在單因素實驗中，酸解的最適 pH=3，溫度為70 ℃、時間為1 h。在酸解結合酶解的正交實驗中，得到最佳提香工藝參數為：茶葉在60 ℃水浴、pH=3.0下酸解0.5 h，隨后在45 ℃下添加0.5%提香酶酶解0.5 h，得到揮發性香氣物質總量在空白的基礎上提升89%，萜烯醇類糖苷物質在酸解酶解復合工藝下得以有效釋放，提升11.1倍。上述因素對指標影響強弱依次為：B(酸解時間)>E(酶解時間)>D(酶用量)>A(酸解溫度)>C(酸解pH值)。實驗證明，利用”酸解酶解”串聯反應，能有效水解糖苷態前體物質，從而提高速溶茶制品香氣物質總量，顯著豐富香氣組分及改善綠茶香型，且所用輔料(檸檬酸、單一酶制劑)成本較低，處理溫度較低(60 ℃以下)，處理時間較短(約1 h)，整個工藝流程操作較簡單，具有一定的應用價值。

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The utilization of bound aroma precursors in tea

LONG Dan1, LIU Xiao-hui1*, WU Han-yin2, LIU Pan-pan2, LUO Long-xin1

1(Shenzhen Shenbao Industrial Co. Ltd., Shenzhen 518040, China) 2(Shenzhen Shenbao Huacheng Tech. Co. Ltd., Shenzhen 518115，China)

Most of the tea aroma substances are bound glycosidic precursors that are difficult to be utilized. To transform unscented aroma precursors into volatile aroma substances, we optimized parameters such as the time, pH, temperature of acid hydrolysis and the time, addition of enzyme hydrolysis by orthogonal array design. Our study found that the factors influencing on total volatile aroma substances were as follows in order of strong to weak: acid hydrolysis time, enzyme hydrolysis time, enzyme addition amount, acid hydrolysis temperature and acid hydrolysis pH. For obtaining most of total tea aroma substances, the optimal treatments were 30 min infusion at 60 ℃ and pH=3.0, and then 30 min enzymolysis with 0.5% (w/w) flavor-enhancing enzyme at 45 ℃. Compared to that of the control sample, the volatile aroma content increased 89% after treatment, terpene glycosides increasing 11.1 fold.

tea; bound aroma precursors; acid hydrolysis; enzyme hydrolysis; orthogonal array design

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612022

碩士，研發工程師(劉曉輝為通訊作者,E-mail：liuxiaohui@sbsy.com.cn)。

深圳市戰略新興產業發展專項(CXZZ20120612142335998)

2016-01-12，改回日期：2016-04-27