超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚

張艷霞，朱彩平，鄧紅，張曉，李云，張揚，翟希川

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚

張艷霞，朱彩平*，鄧紅，張曉，李云，張揚，翟希川

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

采用超聲輔助雙水相法提取石榴皮多酚，在單因素試驗的基礎上，選取超聲時間、超聲溫度、(NH4)2SO4用量和液料比為自變量，石榴皮多酚得率為響應值，通過Box-Behnken試驗設計及響應面分析法，研究各單因素及其交互作用對多酚得率的影響，優化石榴皮多酚的提取工藝條件。研究結果表明:最佳的提取工藝參數為,超聲時間32 min、超聲溫度40 ℃、(NH4)2SO4用量0.36 g/mL、液料比為37∶1(mL∶g)，在此條件下提取，多酚的得率為(10.63±0.28)%(n=3)，與模型的預測值10.708 6%有較好的擬合性，表明超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚的方法可行。

石榴皮；多酚；超聲輔助雙水相；響應面分析

石榴，又名安石榴，是傳統的藥食同源食品,其藥用和食用價值的發掘日益受到全球相關領域的重視[1]。據記載，石榴皮作為我國傳統的中藥材，具有澀腸止瀉、止血、驅蟲的功效，可以用于治療久瀉、久痢、便血、脫肛、崩漏、帶下、蟲積腹痛等疾病[2]。隨著中國果汁加工產業的快速發展，每年會產生大量的石榴皮副產物，其中除去一小部分用作中藥材之外，剩余的或作為牛的飼料，或直接被廢棄[3]。

石榴皮中含有大量的多酚類物質，是其發揮藥理作用的主要活性成分，目前對石榴皮多酚提取的方法有多種[4]。近幾年，隨著“綠色化學”概念的提出，環境友好型的提取工藝備受青睞[5]。超聲輔助提取是目前應用最廣泛的一種提取技術，不僅可以提高產品的得率，縮短提取時間，還可以減少化學與物理危害[6]；雙水相提取是根據被分離物質在上下相中的分配系數不同，從而實現分離的一種方法[7]，近年來，醇-鹽雙水相體系已經被廣泛用于提取和分離草本植物中的天然小分子物質[8-9]，其優點為形成雙水相的溶劑成本低，而且有利于醇類的回收和目標物的分離[10]。在本研究中，選擇室溫溶解度高、溫度效應低的(NH4)2SO4為鹽析相，依據其水化作用與乙醇形成穩定的雙水相體系，并首次將超聲輔助與雙水相2種方法相結合進行石榴皮多酚的提取，并采用響應面分析法進行工藝參數的優化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

石榴：產自臨潼，凈皮甜品種，購于西安水果市場，要求新鮮無斑，除去病果和裂果，洗凈，進行手工剝皮；石榴皮經自然干燥，粉碎過40～60目篩，避光保存，備用。

試劑：無水乙醇，(NH4)2SO4，福林酚試劑，無水Na2CO3，以上均為分析純；沒食子酸(標品)。

儀器：高速萬能粉碎機，BS 224 S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；KQ5200DE數控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環水多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；Multiskan Go全波長酶標儀，美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系的建立與石榴皮多酚提取

稱取1.00 g的石榴皮粉末于100 mL錐形瓶中，分別加入25 mL體積分數為30%～70%的乙醇溶液，然后分別加入用量為0.2～0.5 g/mL (NH4)2SO4(每毫升水加入硫酸銨的質量)，搖勻靜置30 min，在超聲溫度60 ℃、功率150 W條件下提取30 min，抽濾，將溶液移入分液漏斗中靜置分層，研究發現，當乙醇體積分數為40%時能較好地形成雙水相體系，(NH4)2SO4量在0.325～0.45 g/mL內形成的雙水相體系較穩定，因此，本試驗將固定乙醇的體積分數在40%進行后續研究。取上層溶液1 mL于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即石榴皮粗多酚稀釋溶液，備用。

1.2.2 沒食子酸標準溶液的配制

準確稱取0.100 0 g沒食子酸標準品，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，搖勻，制備成1 000 mg/L的沒食子酸標準溶液。用移液槍分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL標準液于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，得到濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 mg/L的沒食子酸標準溶液。

1.2.3 最佳測定波長的確定

分別吸取上述濃度為20 mg/L的沒食子酸標準溶液和石榴皮粗多酚稀釋溶液1 mL于10 mL離心管中，分別加入蒸餾水5 mL，Folin-Ciocalteu試劑(加水稀釋10倍)1 mL，搖勻，再加入7.5% Na2CO3溶液3 mL，充分混合后在室溫下避光靜置2 h，用酶標儀分別對沒食子酸及石榴皮多酚反應液在波長400～900 nm內進行光譜掃描，最終得出在750 nm處有最大吸收峰，如圖1所示。

圖1 沒食子酸反應液與石榴皮多酚反應液光譜掃描Fig.1 Scanning spectra of pyrogallic acid and pomegranate peel polyphenols

1.2.4 標準曲線的繪制

分別取不同濃度的沒食子酸溶液1 mL于10 mL的離心管中，按上述1.2.3方法操作，在750 nm處測其吸光值，重復3次，取平均值。以沒食子酸標準溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.004 4x+0.007 0，R2=0.996 0，式中：y，吸光度；x，沒食子酸標準溶液質量濃度(mg/L)。

1.2.5 石榴皮多酚含量的測定

稱取2.00 g石榴皮粉末于100 mL錐形瓶中，加入硫酸銨試劑，再按一定的液料比加入一定體積的雙水相溶液，在超聲輔助提取。抽濾，靜置分層，記錄上層溶液體積，按1.2.4操作，得出吸光值，根據回歸方程得出多酚的質量濃度，由公式(1)計算多酚得率：

(1)

式中：c,由回歸方程中算得的多酚質量濃度,mg/L；V,乙醇層提取液總體積mL；n,稀釋倍數,100；m,稱取石榴皮粉末質量,g。

1.2.6 試驗因素的確定

影響超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚的因素很多，如超聲時間、(NH4)2SO4用量、超聲溫度及液料比等。因此本試驗固定石榴皮粉末2.00g，選擇雙水相體系中乙醇的體積分數為40%，超聲功率150W。通過改變超聲時間(10、20、30、40、50、60min)，超聲溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)，(NH4)2SO4用量(0.30、0.325、0.35、0.375、0.40、0.425g/mL)和液料比[20、25、30、35、40、45)∶1(mL∶g)]來研究各單因素對多酚得率的影響。

1.2.7 響應面試驗

在單因素的基礎上，綜合考慮各單因素對石榴皮多酚得率的影響，根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇超聲時間、超聲溫度、硫酸銨用量、液料比進行4因素3水平的響應面分析，來確定石榴皮多酚最佳提取條件，因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平及編碼

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間對多酚得率的影響

由圖2可看出，在超聲時間低于30 min時，石榴皮多酚得率隨著時間的延長而迅速增大。這是因為隨著時間的延長，可以使多酚充分的溶解到乙醇中，當到達30 min時得率達到最大，說明已完全溶解，再延長超聲時間，多酚得率反而下降，可能是由于多酚的不穩定，在氧氣和光照條件下發生氧化、聚合等反應才導致得率的下降，因此，超聲提取的時間不宜過長。

圖2 超聲時間對多酚得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.2 超聲溫度對多酚得率的影響

圖3顯示，隨著溫度的增加多酚得率增大，當溫度升高到40 ℃時，石榴皮多酚得率最高，但繼續升高溫度多酚得率迅速下降。因為溫度升高，分子內能增大，分子運動加快，有利于分子滲透進入細胞內破壞疏水鍵，同時，也有利于被提取物向溶液中擴散，多酚得率增大，但隨著溫度升高使能量消耗增大、成本增加，同時較高的溫度使多酚的化學結構遭到破壞，此外在高溫條件下也會導致乙醇揮發，使液料比改變，從而影響多酚的得率[11-12]，并且當溫度高于40 ℃，雙水相體系穩定性變差，導致多酚物質的氧化加快，因此，多酚得率下降。

圖3 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic temperature on the yield of polyphenols

2.1.3 (NH4)2SO4用量對多酚得率的影響

從圖4可看出，當(NH4)2SO4用量較小時，多酚得率隨著(NH4)2SO4用量的增大迅速上升，當用量為0.35 g/mL時，多酚得率最高，再增大濃度得率反而下降。因為隨著(NH4)2SO4用量的增加，(NH4)2SO4對水的束縛能力增強，乙醇從(NH4)2SO4水相中游離出來，而水分子也離開乙醇相。其結果是上相中乙醇的相對體積分數增加，下相中乙醇的相對體積分數則減少。因此，(NH4)2SO4用量的改變可影響到上相的極性，最終影響到多酚在其中的分配[13]。

圖4 硫酸銨用量對多酚得率的影響Fig.4 The effect of ammonium sulfate dosage on the yield of polyphenols

2.1.4 液料比對多酚得率的影響

由圖5可知，在液料比較小時，石榴皮多酚得率隨著液料比的增大而迅速增大，當液料比大于35∶1(mL∶g)時，多酚得率增加速度明顯降低。主要原因可能是，溶劑用量越多，傳質動力越大，擴散到溶劑里的多酚類化合物就越多[14]。但是在固液兩相之間，除了擴散溶解平衡外，還存在吸附平衡，低溫有利于吸附。由于液料比的增大，在產生相同熱量的條件下，提取液溫度下降，吸附作用增強導致得率下降[15]。

圖5 液料比對多酚得率的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the yield ofpolyphenols

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 試驗結果

響應面結果見表2。

表2 響應面試驗結果

續表2

試驗號ABCD多酚得率(Y)/%920400353095210404003530933112040035401003124040035401037133030032535937143050032535100215303003753510341630500375359781720400325351001184040032535101919204003753510252040400375351027213030035309432230500353092723303003540980243050035401007253040035351066263040035351074273040035351056283040035351043293040035351065

注：表2中多酚得率數據為3 次重復試驗的平均值。

如表2所示，共29個試驗點，其中24個為析因點，5個為零點，析因點為自變量取值在A、B、C、D所構成的三維頂點；零點為區域的中心點，其中零點試驗重復5次，用以估算試驗誤差。

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗

將表2所得的試驗數據采用Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸分析，得到石榴皮多酚得率(Y)對超聲時間(A)、超聲溫度(B)、(NH4)2SO4用量(C)和液料比(D)的二次多項回歸模型如下：

Y=10.61+0.081A+0.028B+0.14C+0.31D+0.22AB-0.040AC+0.13AD-0.30BC+0.11BD+0.11CD-0.25A2-0.49B2-0.20C2-0.50D2

(2)

對回歸模型進行方差分析，得到結果如表3。

表3 響應面試驗方差分析

注：*為差異顯著(P<0.05)，**為差異高度顯著(P<0.01)，***為差異極度顯著(P<0.000 1)。

2.2.3 石榴皮多酚提取工藝的響應面分析

對響應面方差分析結果做響應曲面及等值線圖(圖6～圖11)，響應曲面圖是任意2個變量在零水平時，其余2個變量對多酚得率交互作用的影響?？梢钥闯?，任意2個單因素之間都存在交互作用，最佳落點均在試驗考察的區域內。等值線圖越圓，說明對多酚得率的影響越小，等值線圖越扁平，表示因素間的相互影響越大。

圖6為(NH4)2SO4用量0.35 g/mL，液料比35∶1(mL∶g)時，超聲時間與超聲溫度交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應面圖和等值線圖。由圖6可看出，當超聲時間一定時，隨著超聲溫度的增加，多酚得率呈現先增大后減小的趨勢，而當超聲溫度一定時，隨著超聲時間的增大，多酚得率也呈現先增大后減小的趨勢，但是變化幅度較超聲溫度小，因此，等值線呈現橢圓形狀，超聲時間與超聲溫度交互作用對多酚得率影響高度顯著。

圖6 超聲時間與超聲溫度交互影響多酚得率的響應面圖與等值線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of polyphenols

圖7為超聲溫度40 ℃、液料比35∶1(mL∶g)時，超聲時間與(NH4)2SO4用量交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應面圖與等值線圖。由圖7可知，當超聲時間一定時，多酚得率隨著硫酸銨用量的增加呈現先增大后減小的趨勢；當(NH4)2SO4用量一定時，隨著超聲時間的增大，石榴皮多酚的得率呈現先上升后下降的趨勢，但變化不顯著；由表3可知，超聲時間與硫酸銨用量交互作用對石榴皮多酚得率影響不顯著。在超聲時間為30～35 min，(NH4)2SO4用量0.35～0.36 g/mL時，響應值最大。

圖7 超聲時間與(NH4)2SO4用量交互影響多酚得率的響應面圖與等值線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic time and ammonium sulfate dosage on the yield of polyphenols

圖8為超聲溫度40 ℃，(NH4)2SO4用量0.35 g/mL時，超聲時間與液料比交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應面圖與等值線圖。由圖8可看出，當超聲時間一定時，隨著液料比的增加，多酚得率呈現先增加后降低的趨勢，變化較明顯；當液料比一定時，多酚得率隨著超聲時間的增加先增大后減小，變化幅度較??；當超聲時間在30～35 min時，液料比為(35～38)∶1(mL∶g)時，響應值最高，即多酚得率最高。

圖8 超聲時間與液料比交互影響多酚得率的響應面圖與等值線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic time and material/liquid ratio on the yield of polyphenols

圖9為超聲時間30 min，液料比35∶1(mL∶g)時，超聲溫度與(NH4)2SO4用量交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應面圖與等值線圖。從圖9中可看出，當超聲溫度一定時，多酚得率隨著(NH4)2SO4用量的增加而呈線性增大，最終趨于平穩，而當(NH4)2SO4用量一定時，隨著超聲溫度的增加多酚得率呈現先迅速增加后緩慢降低，當(NH4)2SO4用量處于較低水平時，超聲溫度的響應拋物曲線的最高點也處于較低水平，而隨著(NH4)2SO4用量的增大，超聲溫度的響應拋物曲線最高點也向高水平移動，等值線呈橢圓形；同時由表3可知，超聲溫度與(NH4)2SO4用量交互作用對多酚得率影響極顯著；響應值在超聲溫度為40 ℃左右，(NH4)2SO4用量為0.36 g/mL左右，響應值最高。

圖9 超聲溫度與(NH4)2SO4用量交互影響多酚得率的響應面圖與等值線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic temperature and ammonium sulfate dosage on the yield of polyphenols

圖10為超聲時間30 min，(NH4)2SO4用量0.35 g/mL時，超聲溫度與液料比交互作用對多酚得率影響的響應面圖與等值線圖。由圖10可知，當超聲溫度一定時，液料比處于低水平時，多酚得率呈現線性增加，當液料比一定時，隨著超聲溫度的增加，多酚得率呈現先增后降的趨勢，但變化不明顯，且變化幅度稍低于液料比；由表3可知，超聲溫度與液料比交互作用對多酚得率影響不顯著。超聲溫度為40 ℃左右，液料比為(36～38)∶1(mL∶g)時，多酚得率最大。

圖10 超聲溫度與液料比交互影響多酚得率的響應面圖與等值線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic temperature and material/liquid ratio on the yield of polyphenols

圖11為超聲時間30 min，超聲溫度40 ℃時，(NH4)2SO4用量與液料比交互作用對多酚得率影響的響應面圖與等值線圖。從圖11可知，當(NH4)2SO4用量一定時，隨著液料比的增加，多酚得率先呈線性增加后緩慢降低。由表3可知，(NH4)2SO4用量與液料比交互作用對多酚得率的影響不顯著；響應值在(NH4)2SO4用量為0.36 g/mL左右，液料比為37∶1(mL∶g)左右，響應值最大。

圖11 (NH4)2SO4用量與液料比交互影響多酚得率的響應面圖與等值線圖Fig.11 Response surface and contour plots for the effects of ammonium sulfate dosage and material/liquid ratio on the yield of polyphenols

2.3 工藝優化及驗證實驗

根據所建立的模型進行參數最優化分析，得到石榴皮多酚得率最高的工藝參數為：超聲時間32.22 min，超聲溫度39.83 ℃，(NH4)2SO4用量0.36 g/mL，液料比36.97∶1(mL∶g)，在此條件下，石榴皮多酚得率的預測值為10.708 6%，為方便試驗操作，將工藝參數修正為：超聲時間32 min，超聲溫度40 ℃，(NH4)2SO4用量0.36 g/mL，液料比37∶1(mL∶g)，此時，多酚的得率為(10.63±0.28)%(n=3)，與模型預測值誤差0.73%。

3 結論

本文選取超聲輔助雙水相法提取石榴皮多酚，通過試驗確定了形成穩定雙水相的乙醇體積分數為40%，以石榴皮多酚得率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法對超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚的工藝進行優化，得出最佳工藝參數為：超聲時間32 min、超聲溫度為40 ℃、(NH4)2SO4用量為0.36 g/mL(每毫升水(NH4)2SO4用量為0.36 g)、液料比37∶1(mL∶g)，在此條件下，石榴皮多酚得率為(10.63±0.28)%(n=3)，與模型預測值誤差0.73%，說明該模型是可靠的，能較好地預測石榴皮多酚的實際得率。

[1] 暢靜,田莉.石榴多酚的提取工藝和檢測方法研究進展[J].中國中醫藥信息雜志,2014,12(21):133-136.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:87.

[3] ZHU Cai-ping,ZHAI Xi-chuan,LI Lin-qiang,et al.Response surface optimization of ultrasound-assisted polysaccharides extraction from pomegranate peel[J].Food Chemistry,2015,177:139-146.

[4] 朱彩平,張艷霞,張曉,等.石榴皮多酚提取方法研究進展[J].食品與發酵工業,2015,41(11):243-248 .

[5] TABARAKI R,NATEGHIA.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of natural antioxidants from rice bran using response surface methodology[J].Ultrasonics Sonochemistry,2011,18:1 279-1 286.

[6] CHEMATF,HUMA Zill,KHAN M K.Applications of ultrasound in food technology: Processing, preservation and extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2011,18(4):813-835.

[7] KWON Y J,KAUL R,MATTIASSONB.Extractive lactic fermentation in poly(ethleneimice)-based aqueous-phase system[J]. Biotechnology and Bioengineering,1996,50:280-290.

[8] ZHI Wen-bo,DENG Qiu-yun.Purification of salvianolic acid B from the crude extract of Salvia miltiorrhiza with hydrophilic organic/salt-containing aqueous twophase system by counter-current chromatography[J].Journal of Chromatography,2006,16(11): 149-152.

[9] SHEN S F,CHANG Z D,LIU J,et al.Separation of glycyrrhizic acid and liquiritin fromGlycyrrhizauralensisFisch extract by three-liquid phase extraction systems[J].Separation and Purification Technology,2007,53:216-223.

[10] GUO Y X,HAN J,ZHANG D Y,et al.Aqueous two-phase system coupled with ultrasound for the extraction of lignans from seeds ofSchisandrachinensis(turcz.) Baill[J].Ultrasonics Sonochemistry,2013,20(1):125-132.

[11] 令博,王捷,吳洪斌.葡萄皮渣多酚超聲波輔助提取工藝響應面法優化及抗氧化活性研究[J].食品科學,2011,32(18):24-29.

[12] PRASAD K N,YANG E,YI C, et al.Effects of high pressure extraction on the extraction yield,total phenolic content and antioxidant activity of longan fruit pericarp[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2009,10:155-159.

[13] 周安存,喻祖文,馮務群,等.乙醇-硫酸銨雙水相體系與微波集成提取石榴皮多酚的實驗研究[J].光明中醫,2011,26 (4):689-692.

[14] BENDAHOU A,DUFRESNE A,KADDAMIH,et al.Isolation and structural characterization of hemicelluloses from palm of Phoenix dactylifera L.[J].Carbohydrate Polymers,2007,68(3):601-608.

[15] 馮年平,郁威.中藥提取分離技術原理與應用[M].北京:中國醫藥科技出版社,2005.

Optimization of ultrasound assisted aqueous two-phase extraction of polyphenols from pomegranate peel by response surface methodology

ZHANG Yan-xia, ZHU Cai-ping*, DENG Hong, ZHANG Xiao, LI Yun, ZHANG Yang, ZHAI Xi-chuan

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

The method of ultrasonic assisted aqueous two-phase system was used to extract polyphenols from pomegranate peel. On the basis of single-factor experiment, the best extraction technology was optimized by selecting ultrasonic time, ultrasonic temperature, ammonium sulfate dosage and liquid/material ratio as independent variables, and the yield of pomegranate peel polyphenols as the response value. Box-Behnken design and response surface analysis method were applied to evaluate the effects of each single-factor and its interaction on the polyphenols yield. The results showed that the best extraction conditions were ultrasonic time 32 min, ultrasonic temperature 40 ℃, the dosage of ammonium sulfate 0.36 g/mL (ammonium sulfate dosage 0.36 g per milliliters of water), liquid/material ratio 37(mL/g). Under these conditions, the polyphenol yield was (10.63±0.28)%(n=3), which fitted well to the predicted value of 10.708 6%. So the technology of ultrasonic assisted aqueous two-phase extract polyphenols from pomegranate peel is feasible.

pomegranate peel; polyphenols; ultrasonic assisted aqueous two-phase system; response surface analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612027

碩士研究生(朱彩平副教授為通訊作者,E-mail：zcaiping@snnu.edu.cn)。

國家自然科學基金項目(31301598)；陜西省自然科學基金項目(2012JQ3014)；中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目(GK201402042)；國家留學基金項目(201406875010)

2016-04-21，改回日期：2016-05-17