注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)含量測定方法的研究

陳愛萍，朱雪萍，戴云志

(南京優科生物醫藥有限公司，南京 210029)

注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)含量測定方法的研究

陳愛萍，朱雪萍，戴云志

(南京優科生物醫藥有限公司，南京 210029)

目的：建立同時測定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)中頭孢噻肟和他唑巴坦含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液(6.7 g磷酸二氫鉀，3 ml磷酸，2 ml四丁基氫氧化銨，用水溶解并稀釋至1 000 ml)(27∶73)，流速為1.0 ml/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μl。結果:頭孢噻肟和他唑巴坦的進樣量分別在0.516～4.124 μg和0.083～0.663 μg范圍內和各自峰面積積分值呈良好線性關系(r=1)；平均加樣回收率分別為100.6%和100.4%，RSD分別為0.79%和0.94%(n=9)。結論:該方法操作簡便，專屬性和耐用性好，結果準確，可同時測定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)中頭孢噻肟和他唑巴坦的含量。

高效液相色譜法，頭孢噻肟，他唑巴坦，含量測定

頭孢噻肟鈉為第三代頭孢菌素，抗菌譜廣，對大腸埃希菌、克雷伯菌屬等革蘭陰性菌有強大活性。在臨床上頭孢噻肟鈉主要用于敏感細菌所致的肺炎及其他下呼吸道感染、尿路感染、腦膜炎、敗血癥、腹腔感染、盆腔感染、皮膚軟組織感染、生殖道感染、骨和關節感染等，還可以作為小兒腦膜炎的首選藥物。但頭孢噻肟易被β-內酰胺酶水解而失去活性，衛生部細菌耐藥監測網基礎網(MOH National Antimicrobial Resistant Investigation Net，Mohnarin) 近年來對于成人感染患者的調查結果顯示[1-3]：常見致病菌，特別是產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的腸桿菌科細菌對于頭孢噻肟的耐藥率逐年增高，腸桿菌科主要致病菌對于頭孢噻肟的耐藥率基本在50%以上，最高已達70%左右。他唑巴坦鈉是目前上市的最強的β-內酰胺酶抑制劑[4]，二者聯用發揮協同抗菌作用。注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)是頭孢噻肟和他唑巴坦按6∶1(w/w)組成的復方制劑，可有效克服因ESBLs引起的耐藥，并能阻斷或延緩耐藥的繼續發展，是一個安全、有效的復方抗生素，屬于化藥1.5類新藥。本文建立反相高效液相法同時測定頭孢噻肟和他唑巴坦含量。

1 儀器與試藥

LC-1260高效液相色譜系統(含1260Quat PumpVL泵、1260ALS自動進樣器、1260TCC控溫箱、1260VWD紫外檢測器和OpenLAB色譜工作站，安捷倫)；AL204型電子分析天平(德國梅特勒儀器公司)；BP211D型電子分析天平(德國賽多利斯儀器公司)； 320-S pH計[梅特利-托利多儀器(上海)有限公司]。頭孢噻肟對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號130480-200903，含量83.7%)；他唑巴坦對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號130511-200402，含量99.1%)；注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉粉針劑(6∶1)(南京優科制藥有限公司，批號20140401、20140402、20140403)。磷酸二氫鉀、10%四丁基氫化銨和磷酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇為色譜純，購自Merck公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：甲醇-磷酸二氫鉀溶液(6.7 g磷酸二氫鉀、3 ml磷酸、2 ml四丁基氫氧化銨，用水溶解并稀釋至1 000 ml)(27∶73)；流速為1.0 ml/min；波長為220 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μl；運行時間12 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白對照溶液 以流動相做為空白對照溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 取頭孢噻肟和他唑巴坦對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml分別含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密稱取注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml分別含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗 精密量取對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。頭孢噻肟主峰保留時間為8.515，理論塔板數為9 195，峰純度為1 000；他唑巴坦主峰保留時間為4.547，理論塔板數為10 461，峰純度為1 000，兩主成分在220 nm均有最大吸收。頭孢噻肟和他唑巴坦主峰的分離度符合要求，主峰與各個雜質峰分離度也均符合要求，空白對照對檢測沒有影響。色譜圖見圖1。

2.4 線性范圍考查 精密稱取頭孢噻肟對照品和他唑巴坦對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml約含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為線性對照品溶液。分別取溶液5、10、20、30和40 μl依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣量(μg)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸。頭孢噻肟回歸方程為：Y=1 357.2X+5.215 2(r=1)，線性范圍為0.516～4.124 μg。他唑巴坦回歸方程：Y= 883.65X+ 0.973 2(r=1)，線性范圍為0.083～0.663 μg。

1.他唑巴坦 2.頭孢噻肟

2.5 定量限 取頭孢噻肟對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml約含頭孢噻肟100 μ g的溶液，逐級稀釋，進行測定，按信噪比10∶1，確定頭孢噻肟的最小定量限為0.11 ng。取他唑巴坦對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 ml約含他唑巴坦17 μ g的溶液，逐級稀釋，進行測定，按信噪比10∶1，確定他唑巴坦的最小定量限為0.23 ng。

2.6 精密度試驗 取線性試驗項下的對照品溶液，精密量取20 μl依次注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄峰面積，頭孢噻肟和他唑巴坦峰面積的RSD分別為0.06%和1.04%。試驗結果表明，本法進樣精密度良好。

2.7 溶液穩定性試驗 取本品(批號20140401)，加流動相制成每1 ml含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為供試品溶液，置于溫度為5 ℃自動進樣器上，分別于0、2、4、6、8、10和12 h進樣測定。頭孢噻肟和他唑巴坦峰面積RSD分別為0.53%和0.44%，表明供試品溶液在5 ℃條件下12 h 內相對穩定。

2.8 重復性試驗 取本品(批號20140401)適量，精密稱定，加流動相溶解并制成每1 ml含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為供試品溶液，共配制6份，進樣測定。結果按無水物計，頭孢噻肟和他唑巴坦標示量的含量分別為101.4%和102.1%，RSD分別為0.38%和0.49%。

2.9 回收率試驗 按照供試品溶液80%、100%、120%的濃度配制高、中、低三個樣品溶液，每個溶液配制三份，進樣測定，計算回收率。結果見表1和表2。頭孢噻肟和他唑巴坦的平均回收率分別為100.6%和100.4%，RSD分別為0.79%和0.94%。

表1 頭孢噻肟回收率試驗結果(n=9)

表2 他唑巴坦回收率試驗結果(n=9)

2.10 耐用性試驗 分別考查了鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動相比例和波長在±5%范圍內變化，及采用不同的色譜柱對本品的含量測定的影響。上述不同條件下，頭孢噻肟和他唑巴坦的平均含量分別為100.7%和101.6%，RSD(n=15)分別為0.77%和0.82%。表明本法耐用性良好，微調鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動相比例和波長，及更換不同廠家的色譜柱，對本品含量測定結果無影響。

2.11 含量測定 取注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)三批(批號20140401、20140402、20140403)，按“2.1”項下色譜條件分別測定頭孢噻肟和他唑巴坦的含量，結果見表3。

表3 含量測定結果

3 討論

頭孢噻肟和他唑巴坦都是穩定性較差的內酰胺類化合物，在生產、貯藏、運輸和使用過程中易產生較多的雜質，會干擾頭孢噻肟和他唑巴坦的含量測定，且在研究過程中發現磷酸鹽的離子濃度和四丁基氫氧化銨的濃度對頭孢噻肟的保留時間、理論板數和峰型都有很大的影響。本文參考《中國藥典》他唑巴坦的含量測定方法進行色譜條件的摸索[5]，采用Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-10% 四丁基氫氧化銨溶液(190∶795∶15)(用磷酸調節pH值至4.0)；流速為1.0 ml/min；波長為230 nm；柱溫為30 ℃，進樣量為20 μl。結果頭孢噻肟保留時間為29.245 min，理論板數為1 285；頭孢噻肟峰較寬，且出現肩峰，峰型很差，柱效低。隨后稍微增加磷酸二氫鉀的量，減少四丁基氫氧化銨的量，采用報道中的色譜條件，得到了較為滿意的分離效果：頭孢噻肟峰和他唑巴坦峰在10 min全部洗脫出來，兩個主峰之間、兩個主峰和雜質之間都達到了基線分離。

在選擇檢測波長時，因為要同時測定頭孢噻肟和他唑巴坦的含量，檢測波長需要滿足兩個成分均有吸收的條件。本文分別取頭孢噻肟對照品、他唑巴坦對照品適量，加流動相配制成50 μg/ml的溶液，照紫外分光光度法，在190～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，頭孢噻肟的最大吸收波長為254 nm，由于他唑巴坦在254 nm處無吸收，故選擇頭孢噻肟和他唑巴坦吸收均較強的220 nm作為檢測波長。

綜上所述，該方法靈敏度高、專屬性強、操作簡便，能夠同時測定本品中頭孢噻肟和他唑巴坦的含量。

1 劉根焰，童明慶，梅亞寧,等. Mohnarin 2009年度報告：青壯年(14-65歲) 來源菌株耐藥監測[J]. 中國臨床藥理學雜志，2011，27(7):508-516

2 梅亞寧，童明慶. 2010年度衛生部全國細菌耐藥監測網報告：青壯年來源菌株耐藥監測結果[J]. 中華醫院感染學雜志,2012，22(1)：44-49

3 梅亞寧，童明慶.2011年度衛生部全國細菌耐藥監測網報告：成年患者分離菌的耐藥監測[J]. 中國臨床藥理學雜志，2014，30(2)：94-99

4 熊自忠,朱德妹,汪復，等.CTX-M-12編碼基因的克隆、表達及序列分析[J]. 中國傳染病雜志，2003，21(2)：110-113

5 中國藥典[S].二部.2010:169-170

Determination of cefotaxime sodium and tazobactam sodium in injection

Chen Aiping, Zhu Xueping, Dai Yunzhi

(Nanjin Yoko bio-Pharmaceutical co ltd，Nanjing 210029 )

Objective： To establish a new method for quantitative determination of cefotaxime and and tazobactam simultaneously in the injection preparation with cefotaxime sodium and tazobactam sodium at a ratio of 6 to 1. Methods： An RP-HPLC method was adopted. The analysis was performed on Agilent Eclipse Plus C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of methanol-potassium dihydrogen phosphate buffer (6.7 g potassium dihydrogen phosphate dissolved in water with 3ml of phosphoric acid and 2ml of butyl ammonium hydroxide and diluted to 1 000 ml) (27∶73).The flow rate of of the mobil phase was 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 220nm; and column temperature was 30 ℃；Injection volume was 20ul. Results： Cefotaxime and tazobactam were well-separated with resolution of 7.89. Cefotaxime and tazobactam was also separated from other impurities. The linear range of cefotaxime and tazobactam were 0.516～4.124 μg and 0.083～0.663 μg(r=1) respectively with RSD less than 1.04%; LOQs were 0.11 ng and 0.23 ng, respectively; The average recoveries of cefotaxime and tazobactam were 100.6% (RSD was 0.79%,n=9) and 100.4%( RSD was 0.94%,n=9),respectively. Conclusions： This method was proved to be simple, specific, accurate, and can be used to simultaneous determination of cefotaxime and tazobactam in cefotaxime sodium and tazobactam sodium (6∶1) for injection.

high performance liquid chromatography (HPLC)， cefotaxime，tazobactam，content determination

2016-07-19

R927.2

A

1006-5687(2016)05-0023-03