硫胺素水平對團頭魴幼魚生長、肝組織沉積量及血液生化指標的影響

李鵬飛 王 瑩 蔣廣震 王 菲 劉文斌

(南京農業大學動物科技學院, 江蘇省水產動物營養重點實驗室, 南京 210095)

硫胺素水平對團頭魴幼魚生長、肝組織沉積量及血液生化指標的影響

李鵬飛 王 瑩 蔣廣震 王 菲 劉文斌

(南京農業大學動物科技學院, 江蘇省水產動物營養重點實驗室, 南京 210095)

為研究硫胺素對團頭魴幼魚生長、組織沉積量和血液生化指標的影響, 試驗采用單因素濃度梯度設計,配制了6組等氮等能的半純合飼料, 各組硫胺素含量分別為0、0.51、0.98、1.59、2.13和2.68 mg/kg。選取團頭魴幼魚720尾[初重為(0.30±0.01) g], 按隨機原則分為6組, 每組4重復, 各重復30尾, 日投餌3次, 飼喂8周后采集樣品。結果表明, 與對照組相比, 0.98、1.59、2.13、和2.68 mg/kg添加組的增重率和特定生長率均顯著提高(P＜0.05)。1.59和2.13 mg/kg硫胺素添加組的成活率顯著高于對照組(P＜0.05)。隨著飼料中硫胺素含量的升高, 血漿葡萄糖含量呈現先下降后上升的趨勢, 血漿葡萄糖水平在1.59 mg/kg時為最小值(P＜0.05)。對照組與0.51 mg/kg硫胺素組相比血漿中丙酮酸含量差異不顯著, 但顯著高于其他試驗組(P＜0.05)。以團頭魴幼魚的增重率和肝臟硫胺素沉積量為評價指標, 進行雙折線回歸分析, 飼料中硫胺素適宜添加水平分別為1.48和1.84 mg/kg。

團頭魴; 硫胺素; 生長; 肝臟硫胺素沉積量; 血液生化

硫胺素, 也稱維生素B1, 以焦磷酸硫胺素(TPP)的形式參與動物體內碳水化合物氧化分解及其轉化為脂類等代謝反應[1], 是水生動物所必需的水溶性維生素之一, 如對鯉魚(Cyprinus carpio)[2]、虹鱒(Salmo gairdneri)[3]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[4]和斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[5]等的研究表明, 當飼料中硫胺素滿足不了需求時, 魚類會有厭食、生長緩慢、運動失常、鰭出血和體色異常等癥狀。已有的關于魚類對硫胺素需求量的研究表明硫胺素的最適需求量大菱鲆[4]為0.6—2.6 mg/kg、虹鱒[3]為1.0 mg/kg、斑點叉尾鮰[5]為1.0 mg/kg、奧尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[6]為3.5 mg/kg、建鯉(Cyprinus carpio var. Jian)[7]為1.02 mg/kg、軍曹魚(Rachycentron canadum)[8]為6.80—8.56 mg/kg、草魚(Ctenopharyngodon idella)[9]為1.16—4.49 mg/kg、吉富羅非魚(GIFT Oreochromis niloticus)[10]為1.16—2.06 mg/kg。參照以往的試驗方法, 通常將增重率[9]、血液或者血清中的乳酸和丙酮酸含量[3,6,10]等血液生化指標, 和組織中硫胺素的沉積量[10]作為評價水產動物硫胺素缺乏癥的一些指標。

近年來, 團頭魴的養殖量已經攀升到我國淡水魚類養殖的第六名[11,12], 團頭魴以其肉質鮮嫩深受人們喜愛, 因此隨著團頭魴養殖規模的繼續擴大,全價配合飼料的開發刻不容緩。目前, 有關團頭魴基本營養素需求的研究已有部分報道[13], 本實驗室前期對團頭魴飼料蛋白、脂肪和糖[14—16]等大量營養素需求量進行了研究, 并考察了團頭魴對常見飼料原料的消化率。關于團頭魴對維生素需求量的研究已有報道的包括生物素[17]、吡哆醇[18]、膽堿[19]等, 目前仍未見關于團頭魴對硫胺素需求量的研究。本試驗通過研究飼料中添加不同水平的硫胺素對團頭魴幼魚生長、血漿生化指標和肝臟硫胺素沉積量的影響, 以得出團頭魴幼魚的適宜硫胺素需求量, 為開發出團頭魴全價配合飼料提供理論依據, 并為團頭魴幼魚營養素需求量提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

本試驗采用單因素試驗設計, 配制6組半純合飼料, 分別添加硫胺素(Sigma-Aldrich公司)含量為0、0.5、1、1.5、2和2.5 mg/kg。試驗飼料中蛋白源為酪蛋白、明膠和魚粉, 糖源為玉米淀粉, 填充物為微晶纖維素, 以魚油∶豆油按照1∶1添加量為脂肪源配制等氮等能的半純合飼料(即基礎飼料), 其營養成分按照團頭魴幼魚的適宜需求量進行配制[13,14]。并以羧甲基纖維素鈉為黏結劑, 添加部分水, 將粉碎后的原料逐級混勻, 后用小型制粒機制粒, 將飼料顆粒風干后避光保存于-20℃冰箱冷藏備用。在飼料制作完成后, 測定各試驗組飼料的硫胺素實際含量分別為0、0.51、0.98、1.59、2.13和2.68 mg/kg。飼料組成及營養成分見表 1。

1.2 試驗用魚及飼養管理

試驗魚購自江蘇揚州國家級良種場, 飼喂于江蘇省淡水水產研究所祿口基地。馴化1周, 期間投喂不含硫胺素的基礎日糧。馴化后進行分組, 挑選身體健壯、規格整齊的團頭魴720尾[初重為(0.30± 0.01) g], 按隨機原則分為6組, 每組4重復, 各重復30尾。試驗魚采用室內流水水族箱(規格為3 m× 0.8 m×0.8 m)飼養, 每日投飼3次, 飽食投喂, 30min后觀察攝食情況并吸取殘餌, 養殖周期為8周。試驗期間全程使用經過濾、紫外滅菌的池塘水, 24h充氧, pH為7.2—7.4, 水溫為(28±4)℃, 流水速度為2 L/min, 溶氧＞5.0 mg/L, 氨氮含量＜0.5 mg/L,亞硝酸鹽＜0.05 mg/L。

1.3 指標測定與方法

生產性能統計和樣本采集 在養殖試驗完成后, 將魚饑餓24h, 統計每個水族箱的尾數并稱總重, 從中隨機取6尾魚, 然后采用濃度為100 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222, Sigma-Aldrich公司)將魚麻醉。用一次性注射器從尾靜脈采血,采集的血液置于肝素抗凝管中, 于4℃下3500 r/min離心10min, 收集血漿, 保存于-20℃待測。肝臟用0.85%生理鹽水沖洗, 用濾紙吸干, 迅速放入液氮罐中, 后轉移至-70℃冷凍保存, 用于測定肝臟硫胺素的含量。

表 1 基礎飼料配方及營養組成(% 以風干樣為基礎)Tab. 1 Formulation and proximate composition of the basal diet (% air-dry basis)

生長性能的計算公式如下:增重率(Weight gain, WG, %)=(Wt-W0)×100/W0特定生長率(Specific growth rate, SGR, %/d)= [ln(Wt)-ln(W0)]×100/t

飼料系數(Feed conversion ratio, FCR)=F/(Wt-W0)

式中W0為魚體初重(g); Wt為魚體末重(g); F為攝食量(g); t為飼養天數(d)。

樣品測定飼料中粗蛋白采用全自動凱氏定氮儀測定; 粗脂肪采用索氏抽提法測定; 粗纖維采用纖維分析儀測定; 灰分采用高溫灼燒法測定;總能采用氧彈法測熱儀測定。飼料和肝臟中硫胺素的含量采用高壓液相色譜法測定[20], 具體步驟如下: 稱取0.5 g左右飼料和肝臟樣品, 加入3 mL 0.01 mol/L鹽酸(HCL)后勻漿, 再加入1 mL 10%三氯乙酸沉淀蛋白, 后將混合液離心10min (4℃, 12500×g)。用乙醚將上層清液清洗3遍, 然后將乙醚蒸發除去。經0.21 μm濾膜過濾后, 然后用高壓液相色譜系統(HP 1100)檢測, 色譜柱為OSD Hypersil柱(5 μm, 4 mm× 160 mm)。流動相由25 mmol/L磷酸氫鉀和甲醇按85∶15組成, 流速為1.0 mL/min。檢測系統為熒光檢測器, 激發光360 nm, 發射光425 nm。每次進樣前,需先加入0.1%鐵氰化鉀和15%氫氧化鈉進行柱前衍生。取適量硫胺素樣品溶解在0.01 mol/L鹽酸中作為標準樣品。

血漿生化指標的測定血糖、丙酮酸和乳酸, 均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒檢測。血糖測定采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法, 丙酮酸測定采用丙酮酸-氧化酶法, 乳酸測定采用LAC酶顯色法測定, 具體操作方法參見試劑盒說明書。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用采用SPSS 16.0軟件分析, 試驗結果以平均值±標準誤(Mean±SE)表示, 單因素方差分析方法(One-way ANOVA), 并用Duncan氏多重比較法對數據進行顯著性檢驗, 顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果

2.1 飼料中硫胺素含量對團頭魴幼魚生長性能的影響

由表 2可知, 飼料硫胺素含量為0時, 相比添加量為0.98、1.59、2.13和2.68 mg/kg添加組的增重率顯著降低(P＜0.05), 當硫胺素含量進一步升高時,變化不顯著(P＞0.05)。飼料硫胺素0添加組的特定生長率顯著低于0.98、1.59、2.13和2.68 mg/kg添加組(P＜0.05), 當硫胺素含量繼續升高時, 差異不顯著(P＞0.05)。飼料硫胺素含量為2.13 mg/kg組的飼料系數最低, 且顯著低于0組(P＜0.05), 但和其余組之間差異不顯著(P＞0.05)。1.59和2.13 mg/kg硫胺素添加組成活率顯著高于0和0.51 mg/kg硫胺素添加組(P＜0.05), 但和其他各組差異不顯著(P＞0.05)。

根據增重率與飼料中硫胺素含量的關系, 以飼料中硫胺素含量為橫坐標, 增重率為縱坐標, 進行雙折線回歸分析得出Y=1287.13-163.6(X-1.48)(R2= 0.958), 對其求解, 當飼料硫胺素水平為1.48 mg/kg時, 團頭魴幼魚增重率最大(圖 1)。

2.2 飼料中硫胺素含量對團頭魴幼魚肝臟硫胺素沉積量的影響

肝臟硫胺素沉積量隨著飼料中硫胺素含量的增加而上升, 當硫胺素含量為2.13 mg/kg時達到最大值, 顯著高于0添加組(P＜0.05), 相比其余各組差異性不顯著(P＞0.05)。以飼料中硫胺素添加量為橫坐標, 肝臟硫胺素沉積量為縱坐標, 進行雙折線回歸分析, 得出Y=563.01-52.87(X-1.84)(R2=0.931), 故團頭魴幼魚對硫胺素的適宜需求量為1.84 mg/kg (圖 2)。

表 2 不同硫胺素含量對團頭魴幼魚增重和飼料轉化率的影響Tab. 2 Effects of dietary thiamin levels on weight gain and feed conversion ratio of juvenile Megalobrama amblycephala

圖 1 飼料中硫胺素含量與團頭魴幼魚增重率之間的關系Fig. 1 The relationship between dietary thiamin levels and WG of juvenile Megalobrama amblycephala

圖 2 飼料中硫胺素與團頭魴幼魚肝臟硫胺素含量之間的關系Fig. 2 The relationship between dietary thiamin levels and liver thiamin contents of juvenile Megalobrama amblycephala

2.3 飼料中硫胺素添加量對團頭魴幼魚血漿生化指標的影響

由表 3可知, 隨著飼料中硫胺素含量的升高, 血漿葡萄糖水平先下降后上升, 在1.59 mg/kg飼料組時達到最小值, 其次是2.13 mg/kg組, 兩組間差異性不顯著(P＞0.05), 相比其他各組差異顯著(P＜0.05)。0 和0.51 mg/kg組血漿中丙酮酸含量較高, 且0組顯著高于0.98—2.68 mg/kg各組(P＜0.05), 但0.98—2.68 mg/kg這幾組之間差異性不顯著(P＞0.05)。血漿中乳酸含量各組間差異性不顯著(P＞0.05)。

表 3 不同硫胺素含量對團頭魴幼魚血漿生化指標的影響Tab. 3 Effects of dietary thiamin levels on plasma biochemical parameters of blunt snout bream

3 討論

3.1 飼料硫胺素添加量對團頭魴幼魚生長指標和肝臟沉積量的影響

以增重率為評價指標, 通過折線回歸模型分析,得到團頭魴幼魚適宜硫胺素需求量為1.48 mg/kg。這與草魚(1.16—1.19 mg/kg)[9]和大菱鲆(0.6—2.6 mg/ kg)[4]的需求量接近, 高于鯉魚(0.5 mg/kg)[2]、建鯉(1.02 mg/kg)[7]、虹鱒(1.0 mg/kg)[3]等的需求量, 但低于軍曹魚(6.80—8.56 mg/kg)[8]、奧尼羅羅非魚(3.5 mg/kg)[6]的需求量。有研究表明, 魚類的硫胺素需求量與飼料中的糖水平有關[21], 當日糧糖水平較高時, 魚類硫胺素的需求量會相應升高。團頭魴作為淡水草食性魚類, 對飼料中糖類的利用率較高[15],飼料糖水平在淡水魚類中處于較高水平, 這可能是團頭魴幼魚對硫胺素的需求量在各種魚中處于較高水平的原因。此外, 這種需求量的差異還可能與魚的種類、生長階段、食性、試驗日糧的營養水平、養殖條件和評價指標等有關。在本次實驗中,特定生長率和增重率在不同硫胺素添加水平表現出了相同的變化趨勢, 硫胺素0添加的對照組生長緩慢, 特定生長率顯著低于添加適量硫胺素的實驗組, 這和趙智勇[9]的研究相似, 出現這種情況可能是因為對照組缺乏硫胺素導致團頭魴幼魚體內糖代謝受阻, 不能正常氧化供能和合成脂肪, 加快了體內蛋白的供能消耗, 從而表現出生長緩慢。另外,適宜水平的硫胺素添加能夠降低團頭魴幼魚的飼料系數, 可能是因為硫胺素使得魚體能夠有效地利用飼料中的糖類, 而糖分解的產物能夠使魚體更好地利用飼料中脂類和蛋白質[9], 從而提升飼料的利用率, 降低飼料系數。

肝臟硫胺素沉積量也通常作為確定水產動物硫胺素需求量的評價指標[9,10], 本試驗結果表明隨著飼料中硫胺素添加量的升高, 肝臟組織中的硫胺素沉積量先升高后基本穩定, 試驗結果與趙智勇[9]和任春等[10]一致。通過雙折線回歸分析得出的團頭魴幼魚對硫胺素需求量為1.84 mg/kg, 高于通過增重率得出的結果, 這與前人在維生素需求量中的研究相似[7,19], 有研究表明, 魚類由外界攝取的維生素大部分用在穩定該維生素在體內狀態的平衡[22],而為了達到魚體內部該種維生素的穩定, 必須能攝取到比魚類達到最大生長所需要的更多的維生素的濃度才能用于維持內部的穩定[23], 因此利用肝臟硫胺素沉積量來評價魚類的適宜硫胺素需要量比以增重率為評價的需求量偏大。

3.2 飼料硫胺素含量對團頭魴幼魚成活率的影響

在本試驗中, 從第四周開始, 0硫胺素組試驗魚開始出現厭食, 游動緩慢, 體色加深, 死亡率增加等癥狀, 這可能揭示硫胺素是團頭魴幼魚生長所必需的營養物質, 缺乏硫胺素對團頭魴幼魚攝食、活動、體色均產生嚴重影響。硫胺素在魚體內被合成焦磷酸硫胺素, 作為輔酶促進糖類分解和糖的異生作用, 在葡萄糖代謝過程中發揮重要作用, 當飼料中缺乏硫胺素時可引起體內糖代謝受阻, 導致氧化供能和脂肪合成功能異常, 魚體分解蛋白質供能,這可能是本試驗中缺乏硫胺素組團頭魴幼魚生長緩慢的原因之一。相關研究表明, 硫胺素缺乏使斑點叉尾鮰[3]、虹鱒[5]和建鯉[7]等出現生長緩慢、厭食、死亡率升高等情況, 和本試驗結果相吻合。

3.3 飼料硫胺素添加量對團頭魴幼魚血液生化的影響

本試驗考察了試驗魚血漿葡萄糖、丙酮酸和乳酸水平, 發現缺乏硫胺素組血漿丙酮酸含量較高,而適宜的硫胺素水平組血漿丙酮酸含量低, 這與Morito等[3]、 Lim等[6]和任春等[10]得出的結果一致。本實驗可能揭示了硫胺素對丙酮酸的影響, 當飼料中硫胺素不足時, 可能造成團頭魴幼魚體內丙酮酸氧化脫羧酶的合成量降低, 使得丙酮酸無法正常轉化為乙酰輔酶A, 導致三羧酸循環障礙, 糖的有氧氧化異常[24], 故血漿丙酮酸含量升高。在本實驗中硫胺素缺乏組團頭魴幼魚血糖水平顯著高于其他組, 這與趙智勇[9]的研究結果相似, 可能原因是硫胺素缺乏造成的三羧酸循環障礙抑制了血糖的有氧氧化過程, 進而導致血糖堆積。

綜上所述, 以團頭魴幼魚的增重率和肝臟硫胺素沉積量為評價指標, 進行雙折線回歸分析, 飼料中硫胺素適宜添加量分別為1.48和1.84 mg/kg, 添加硫胺素1.59—2.13 mg/kg能夠提高團頭魴幼魚的成活率。

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EFFECTS OF DIETARY THIAMIN LEVELS ON GROWTH, HEPATIC THIAMIN CONTENTS AND PLASMA BIOCHEMICAL INDEXES OF JUVENILE BLUNT SNOUT BREAM, MEGALOBRAMA AMBLYCEPHALA

LI Peng-Fei, WANG Ying, JIANG Guang-Zhen, WANG Fei and LIU Wen-Bin
(Key Laboratory for Aquaculture Nutrition of Jiangsu Province, College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

This study was conducted to determine the optimal dietary thiamine requirement of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) on the basis of growth parameters, hepatic thiamine contents and plasma biochemical indexes. 720 fishes [average initial weight: (0.30±0.01) g] were fed six isonitrogenous and isoenergetic diets containing different thiamine levels (0, 0.51, 0.98, 1.59, 2.13and 2.68 mg/kg) 3 times daily for 8 weeks, respectively. Each diet was tested in four replicates, and each replicate holds 30 fish. The results showed that both the weight gain and specific growth rate of fish at 0.98, 1.59, 2.13 and 2.68 mg/kg groups were significantly higher than the control group (P＜0.05). Survival rate increased significantly as dietary thiamin levels increased from 0 to 2.13 mg/kg (P＜0.05). Plasma glucose level decreased significantly (P＜0.05) as dietary thiamine levels increased from 0 to 1.59 mg/kg, but it increased significantly (P＜0.05) with further increased thiamine levels. The addition of thiamine except 0.51 mg/kg group significantly increased plasma pyruvate level (P＜0.05). On the basis of the broken-line analysis of weight gain rate and hepatic thiamin contents, the optimal dietary thiamin requirement of juvenile blunt snout bream was 1.48 and 1.84 mg/kg, respectively.

Megalobrama amlycepala; Thiamin; Growth; Hepatic thiamin contents; Plasma biochemical indexes

S963.73

A

1000-3207(2017)01-0108-06

10.7541/2017.14

2016-01-26;

2016-06-15

現代農業產業技術體系建設專項-國家大宗淡水魚類產業技術體系資金(No: CARS-46-20); 農業公益性行業科研專項-水產養殖動物營養需求與高效配合飼料開發(No: 201003020)資助 [Supported by the National Technology System for Conventional Freshwater Fish Industries of China (CARS-46-20); Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of Ministry (201003020)]

李鵬飛(1990—), 男, 河南開封人; 碩士研究生; 主要從事水產動物營養與飼料研究。E-mail: 2014805092@njau.edu.cn

劉文斌(1966—), 教授, 博士生導師; 主要從事水產動物生理與營養學。E-mail: wbliu@njau.edu.cn