產四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的應用

王曉丹，雷安亮，王婧，班世棟，邱樹毅*

(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州遵義387000）

產四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的應用

王曉丹1,2，雷安亮1,3，王婧1,2，班世棟1,2，邱樹毅1,2*

(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州遵義387000）

利用高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）提高粹沙酒醬香風格特征。將地衣芽孢桿菌FBKL1.0199添加到窖池中層的糟醅中，與空白糟醅作對比，按照粹沙工藝制酒取樣，考察了不同菌株添加量對白酒中四甲基吡嗪含量的影響，采用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）對酒醅及酒樣中揮發性物質成分進行分析，同時進行感官評定。結果表明，最佳菌株添加量為5%，發酵后的酒醅四甲基吡嗪含量達6.81 μg/g，是對照組的3.03倍。酒樣中四甲基吡嗪相對百分含量達0.028%，且感官品質優于對照組，具有入口醇厚、柔和、醬味且口感細膩的特征。

地衣芽孢桿菌；四甲基吡嗪；粹沙酒

粹沙酒為丟糟酒的一種，是利用白酒丟糟加入粉碎的高粱、適量的糖化酶以及麩曲再入池發酵一個月后蒸餾所得的酒。此工藝提高了淀粉利用率，所得的酒產量高但酒的品質較差，醬味不突出。但粹沙酒因價格較低，受到普通消費者的青睞，有一定的市場。四甲基吡嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TTMP）又稱川芎嗪，是白酒的重要香氣成分，曾被人誤解為美拉德反應的產物，后經江南大學研究證實該化合物是由功能菌株轉化前體物質乙偶姻生成[1]。嗜熱芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）以及地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）都有較強的水解淀粉和蛋白質的能力，是醬香型酒的風格形成的重要菌類[2]。地衣芽孢桿菌屬于芽孢桿菌科細菌，為革蘭氏陽性桿菌，已經證實具有生產醬味的能力。張榮等[3]從高溫大曲中分離得到了三株產醬香的菌，經鑒定為地衣芽孢桿菌，發現其發酵液在6 d后呈現明顯的醬香，并在發酵液中檢測到了乙偶姻、四甲基吡嗪以及呋喃扭爾。針對白酒醬味不突出進行了一系列的研究，主要是使用強化大曲，利用功能菌提高四甲基吡嗪產量。ZHU B F等[4]對從高溫大曲分離得到的利用乙偶姻產四甲基吡嗪的厭氧芽孢桿菌進行了研究，經鑒定為枯草芽孢桿菌，同時對該菌產四甲基吡嗪的發酵條件進行了優化，得到＞4.08 g/L的目標產物。該實驗組還對銨鹽對四甲基吡嗪的積累影響進行了研究，發現高濃度的磷酸氫二銨有利于四甲基吡嗪的產生，依此制定了發酵過程中銨鹽的補給策略，將四甲基吡嗪的發酵罐產量提高了29%[5]。另外，該實驗組還考察了不同初始pH對菌體產四甲基吡嗪的影響，發現弱酸環境有利于前體物質乙偶姻的積累，中性環境有利于四甲基吡嗪的生成，依此制定了兩階段pH控制策略以提高四甲基吡嗪的產量[6]。朱兵峰[7]建立了一種全細胞多步轉化乙偶姻偶聯四甲基吡嗪化學合成的工藝，在前體乙偶姻濃度達到41.4 g/L時控制反應條件為四甲基吡嗪最優合成條件，由此可得16.5 g/L四甲基吡嗪。趙德義等[8]從中溫大曲中分離得到一株高產四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌，并研究了如何提高產物的純度。此外，凌杰等[9]研究了醬香型白酒釀造過程中酵母與地衣芽孢桿菌的關系，發現釀酒酵母通過產酸以及大分子的蛋白質物質對地衣芽孢桿菌生長形成抑制，促進了白酒釀造群體微生物發酵過程的解析。豐貴鵬等[10-11]分別研究了地衣芽孢桿菌的發酵培養基的優化，使發酵周期縮短了10 h，而且活菌數達到每個單位接近1×108；優化后的培養基發酵完成后芽孢數可以達到1.25×1011CFU/mL。本研究利用從高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌FBKL1.0199添加到糟醅中再入池發酵一個月，以提高粹沙酒的品質，同時考察了不同接種量對酒的品質影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用菌株為從醬香大曲中篩選出的地衣芽孢桿菌FBKL 1.0199；所用酒醅、麩曲及糖化酶均來源于貴州省珍酒釀酒有限公司。

其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

StableFlex纖維頭（DVB/CAR/PDMS）、57330-U手動萃取手柄：美國Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀：安捷倫科技有限公司；FA1004電子天平：上海箐海儀器有限公司；TDL-5低速離心機：南京東邁科技儀器有限公司；KQ-300DE數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。1.3方法

1.3.1 丟糟續糧入池發酵

粹沙窖池開窖取酒后，按照粹沙工藝加入一定量的新糧、糖化酶和麩曲，攪拌均勻，將制備好的菌懸液分別按0.1%、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%的接種比例分別接種到5 kg酒醅中，將接種好的酒醅裝入編織袋內，置于窖池中上層，以不接入功能性菌株的酒醅作為對照組，用窖泥封窖。發酵30 d后開窖取醅，開窖后立即測定酒醅的蛋白質含量和四甲基吡嗪含量。將實驗組及對照組酒醅分別上甑蒸餾，對蒸餾得到的酒樣進行頂空固相萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結合GC-MS分析。

1.3.2 蛋白質含量測定

參照國標GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中的方法測定[12]。

1.3.3 酒醅及酒樣中四甲基吡嗪含量測定

采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）技術結合GC-MS分析酒醅中揮發性成分及吡嗪類物質的含量。

樣品處理：取酒醅15 g，研磨充分后加入30 mL蒸餾水浸泡10 min，然后超聲波處理30 min，取出離心或過濾，吸取上清液5 mL于15 mL萃取瓶中，加入1.5 g NaCl（酒樣則直接取5mL于15mL萃取瓶中，不加NaCl）。插入裝有2cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在60℃左右頂空萃取40 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250℃）中，熱解吸3 min進樣。采用全掃描模式對酒樣中揮發性成分進行檢測。

氣相色譜條件：色譜柱CP-WAX（30 m×0.25 mm× 0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫35℃（保持5 min），以4℃/min升溫至135℃，再以8℃/min升溫至180℃保持5min，運行時間43 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦（He）（99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流速0.8 mL/min；分流進樣，分流比為20：1；溶劑延遲時間2 min。

質譜條件：電子電離源（electron ionization，EI），離子源溫度230℃，接口溫度250℃。

定性定量方法：采用選擇離子掃描模式對四甲基吡嗪的四個特征離子進行掃描。根據峰面積與含量成正比的關系，用GC-MS聯用儀計算其峰面積對應的響應值，根據已建立的四甲基吡嗪響應值-濃度標準曲線，得到酒醅及酒樣中四甲基吡嗪含量。

2 結果與分析

2.1 接種量對酒醅四甲基吡嗪和蛋白質含量的影響

實驗對發酵前后酒醅中四甲基吡嗪和蛋白質含量進行了測定，結果見圖1所示。

由圖1可知，實驗組酒醅中殘留蛋白質含量隨接種量的增大總體呈下降趨勢，其含量基本低于對照組但減少量不大，這可能與加入的功能性菌株，其自身生長消耗及代謝利用部分蛋白質將其轉化成四甲基吡嗪有關。地衣芽孢桿菌桿菌能產生中性蛋白酶與其他微生物產生的酸性蛋白酶協同作用，能降解復雜蛋白質，對提高出酒率及酒的品質有一定作用[13]。發酵前酒醅中沒有檢測到四甲基吡嗪。發酵后對照組的四甲基吡嗪含量最低為2.25 μg/g，接種量為5%的實驗組其四甲基吡嗪含量最高，達6.81μg/g，是對照組的3.03倍。其次為10%接種量的實驗組，含量為6.54 μg/g。因此選擇接種量為5%進行后續實驗。黃永光等[14-15]利用黑曲霉分泌的蛋白酶處理發酵培養基，所得樣品與對照組相比，不僅產酒率得到了提高，香味物質也得到了加強，所得樣品四甲基吡嗪含量是對照組的3倍多，這與本研究結果相同，也充分說明蛋白質對香味物質的貢獻。

2.2 酒樣中四甲基吡嗪分析

對照組（接種量0）、實驗組（接種量5%）酒樣GC-MS總離子流色譜圖見圖2。成分分析見表1、表2。

圖2 對照組(A)及實驗組(B)酒樣中揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components in control group (A)and experimental group(B)liquor analysis by GC-MS

由表1可知，對照組酒樣中共檢測到48種物質，醛類物質4種，酮類物質3種，醇類物質10種，酸類物質1種，酯類22種，其他芳香及雜環類物質8種。其中乙酸乙酯相對含量最高，沒有檢測到吡嗪類物質。

由表2可知，實驗組酒樣中共檢測到50種物質，醛類物質5種，酮類物質3種，醇類物質10種，酸類物質3種，酯類24種，其他芳香及雜環類物質9種。含量最多的是乙酸乙酯，相對百分含量為38.665%，檢測到具有代表性醬香風味的物質有糠醛、吡嗪和糠醇等，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪相對百分含量為0.028%。

表1 對照組酒樣揮發性成分GC-MS分析結果Table 1 Composition analysis of aroma components in control group liquor by GC-MS

表2 實驗組酒樣揮發性成分GC-MS分析結果Table 2 Composition analysis of aroma components in experimental group liquor by analysis GC-MS

3 結論

本研究從高溫大曲分離得到的地衣芽孢桿菌直接添加到糟醅，再入窖發酵，所得酒樣中風味物質—四甲基吡嗪含量得到明顯提高。同時考察了不同接種量對酒醅的影響，發現接種量為5%時最佳，所得酒醅中四甲基吡嗪含量較高，是對照組的3.03倍；揮發性成分與對照組有明顯的不同：添加地衣芽孢桿菌發酵制得的酒樣中除苯甲醛和糠醛含量稍有降低外，醛類物質特別是乙縮醛含量上升明顯；比對照組酒樣多了一種香味物質4-羥基-2-丁酮，且乙偶姻的含量相對少，可能是產生了更多的四甲基吡嗪；大部分醇類種類上相同，含量上差別也不顯著；變化最大的應該是酯類物質的種類，除乙酸乙酯的含量變化較大外，其余酯類含量差別并不明顯。檢測到具有代表性醬香風味的物質有糠醛、吡嗪和糠醇等，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪相對百分含量為0.028%。

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Application ofBacillus licheniformiswith tetramethyl pyrazine yield

WANG Xiaodan1,2,LEI Anliang1,3,WANG Jing1,2,BAN Shidong1,2,QIU Shuyi1,2*
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor-Making and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Jane Wine Brewing Co.,Ltd., Zunyi 387000,China)

Bacillus licheniformisisolated from high-temperatureDaquwas used to improve Moutai-flavor style of Cuisha liquor.Comparing with the control group of fermented grains,B.licheniformis(FBKL1.0199)was added into the fermented grains lied in the middle layer of the pits.Samples were taken according to the liquor-making technology,and the effect of different strains addition on tetramethyl pyrazine content was investigated. Volatile components in distilled grains and liquor were analyzed using GC-MS.Meanwhile,sensory evaluation of the sample was made.Results showed that the optimum strain addition was 5%,the tetramethyl pyrazine content in fermented grains was 6.81 μg/g after fermentation,which was 3.03 times of the control group.The relative percentage of tetramethyl pyrazine in the liquor reached 0.028%,and the sensory quality was mellow, soft,with sauce flavor and delicate features,which was better than the control group.

Bacillus licheniformis;tetramethyl pyrazine;Cuisha liquor

TS261.1

0254-5071（2017）02-0035-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.008

2016-12-21

貴州省科技支撐項目（黔科合支撐[2016]2340）；貴州省科技廳重大專項計劃項目(黔科合重大專項字[2015]6012)；貴州省科技廳工業攻關項目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省科技廳重大專項計劃項目（黔科合重大專項字[2013]6009號）；貴州省省校合作計劃項目（黔科合LH字[2014]7672）

王曉丹（1980-），女，工程師，博士，研究方向為應用生物技術。

*通訊作者：邱樹毅（1963-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程。