醬香型大曲中產蛋白酶放線菌的分離及產酶條件研究

于華，黃丹*，陳卓，唐姣，毛祥，鄧玲，劉丹，呂開斌

(四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

醬香型大曲中產蛋白酶放線菌的分離及產酶條件研究

于華，黃丹*，陳卓，唐姣，毛祥，鄧玲，劉丹，呂開斌

(四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

對醬香型大曲中高產蛋白酶的放線菌進行分離鑒定，并對其產酶特性進行研究。通過稀釋涂布劃線法和平皿生化反應法對目的菌株進行分離純化，并運用形態學特征和遺傳學特征對目的菌株進行鑒定。并對目的菌株的產酶條件進行優化。結果顯示，分離出的菌株經分子生物學鑒定為婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei），經單因素與正交試驗優化得出的最佳發酵條件為pH值9.0，發酵溫度35℃，轉速180 r/min，此時酶活力最高為28.62 U/mL。

醬香型；蛋白酶；放線菌；大曲

醬香型白酒亦稱茅臺香型白酒，以茅臺酒為代表。其生產工藝獨特，其中最重要的一點就是用曲量大，占釀酒原料的85%～95%，因此大曲質量與酒的風味密切相關[1]。醬香型大曲是采用富含蛋白質的谷物為主要原料，以開放式培養的制曲工藝制成，形成獨特的微生物群落體系，并產生糖化酶、液化酶、蛋白酶、脂肪酶等酶系[2-3]。這些酶系不僅僅影響到白酒釀造過程中微生物的代謝，同時也和白酒中風味物質的生成和風格特征的形成有著密不可分的聯系[4]。其中，蛋白酶可將蛋白質原料進行降解，轉化為一些小分子物質（如氨基酸等），這些物質是醬香型白酒風格中特殊香型的前體[5]。

醬香型大曲中的微生物主要包括細菌、酵母菌、霉菌和放線菌四大類[6]，其中放線菌可產生淀粉酶、蛋白酶等多種酶，此外，由于放線菌具有強大的產活性物質的能力，使得固態發酵過程中放線菌的次生代謝產物種類具有多樣性，這些代謝產物對白酒釀造環境中其他微生物的生長代謝及白酒質量都有較大的影響。因此對產蛋白酶放線菌的研究就顯得十分必要。本研究從醬香型大曲中篩選出產蛋白酶能力強的放線菌，并進行分子生物學鑒定，通過探討產酶的影響因素，得到最優產酶條件，分析其代謝產物，以期為白酒釀造過程中風味物質的形成提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬香型成品高溫大曲：四川某廠取樣。

硫酸鎂、葡萄糖、檸檬酸、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、L-酪氨酸、干酪素、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、無水氯化鈣、磷酸：成都市科龍化工試劑廠；硫酸錳：重慶吉元化學有限公司；鹽酸：重慶川東化工集團有限公司。以上藥品均為分析純。

1.1.2 培養基

酪蛋白培養基（分離培養基）：Na2HPO4·7H2O 1.07 g，KH2PO40.36 g，酪蛋白4 g，ZnCl20.014 g，NaCl 1.2 g，CaCl20.002 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.02 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：用干磨機將小麥皮打破，然后按小麥∶麩皮∶水=4∶1∶40的比例于沸水浴2 h，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

250HL恒溫恒濕培養箱：金壇市醫療儀器廠；SW-CJIFD單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SYQ-DSX-280B立式自動壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；TW3-2000電爐：四川成都市聚森電器廠；CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；VG-3渦旋振蕩器：德國IKA集團；DZKW-4電子恒溫水浴鍋、DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱：北京中興偉業儀器有限公司；HF1500酶標儀：美國Thermo公司；Universal 32R高速冷凍離心機：德國Hettich科學儀器公司；DYY-III8電泳儀：北京六一儀器廠；ChemiDocXRS+化學發光成像系統、C1000 Touch PCR儀：美國Bio-Rad公司；7890A氣相色譜-5975C質譜聯用儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 產蛋白酶放線菌的分離純化

將醬香型大曲粉碎，取25 g于盛有225 mL無菌生理鹽水的500 mL三角瓶中振蕩混勻，得到10-1濃度的菌懸液。并以10倍濃度梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5，取10-3、10-4、10-5濃度的菌懸液于分離培養基上進行平板涂布，37℃條件下培養，每天觀察并記錄各平板中菌落形態以及培養基上透明圈的大小等，從不同平板上挑取長勢良好、透明圈較大的單菌落進行進一步的純化。

1.3.2 分離菌株復篩

將分離純化的各菌株接種于發酵培養基中，120 r/min、37℃條件下培養4 d，以蛋白酶活力為評價指標，測定各菌株的產蛋白酶能力，并最終篩選出產蛋白酶能力較強的菌株。

1.3.3 分離菌株的鑒定

（1）菌株形態特征的鑒定

將篩選出的高產蛋白酶菌株接種于酪蛋白培養基中培養，觀察其菌落形態及透明圈大小，并進行革蘭氏染色，觀察其個體形態。

（2）16S rDNA同源序列分析

使用凍融法[7]提取分離菌株的基因組DNA，并以細菌的基因組DNA為模板，用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，引物序列如下：正向引物27F：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。最后將擴增出的PCR產物送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.3.4 分離菌株的生長特性及產酶特性研究

（1）分離菌株生長曲線測定

將分離菌株接種于發酵培養基中，在120 r/min、37℃條件下培養，每隔12h取出一瓶發酵液過濾，收集菌體，清洗，然后于80℃烘箱內干燥至質量恒定，記錄菌絲干質量[8]。

（2）蛋白酶活力的測定

酪氨酸標準曲線的繪制：取16支25 mL的比色管分成6組（空白組1支，平行每組3支），編號，并按表1所示加入各試劑，混勻后，放入40℃水浴保溫20 min，于波長680 nm處進行比色測定，以酪氨酸的含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線[9]。

表1 標準樣液的配制Table 1 Preparation of standard sample solution

蛋白酶活測定[10]：取4支25 mL比色管，每管加入1 mL待測酶液于40℃恒溫水浴鍋中保溫2 min，在空白組1支比色管中加入2 mL三氯乙酸溶液，實驗組3支比色管中加入1 mL經40℃預熱5 min的酪蛋白溶液，搖勻，40℃保溫10 min。然后，在空白組中加入1 mL經40℃預熱5 min的酪蛋白溶液，實驗組中加入2 mL三氯乙酸溶液，搖勻，靜置10min，過濾。分別取1mL濾液加入5mL碳酸鈉溶液，再加入1mLFolin-酚試劑，混勻，放入40℃水浴保溫20min，于波長680 nm處測定其吸光度值。

蛋白酶活單位定義：在上述條件下，1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量為1活力單位，以U/mL表示[11]。蛋白酶活力計算公式如下：

式中：U為蛋白酶活力，U/mL；A為樣品平行試驗的平均吸光度值；K為吸光常數，由標準曲線得出，數值上等于OD680nm為1時所相當酪氨酸微克數；n為待測酶液稀釋倍數；4為反應液的總體積，mL；10為反應時間，min。

產蛋白酶曲線的測定：接種2 mL種子液于盛有100 mL無菌發酵培養基的250 mL三角瓶中。120 r/min、37℃條件下進行培養。每隔12 h取出一瓶發酵液，測定其蛋白酶活力，并繪制產蛋白酶曲線。以確定后續試驗測定蛋白酶活力的培養時間。

1.3.5 發酵條件對分離菌株產蛋白酶的影響

（1）單因素試驗

接種2 mL種子液于不同初始pH值（5、6、7、8、9、10）的100mL無菌發酵培養基中，分別在不同轉速條件（0、60r/min、120 r/min、180 r/min、240 r/min）、不同溫度條件下（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）培養4 d，取發酵液于4 000 r/min條件下離心10 min，再取上清液測定酶活力的大小，考察初始pH值、轉速、培養溫度對分離菌株產蛋白酶能力的影響。

（2）分離菌株發酵產蛋白酶條件正交試驗優化

根據單因素試驗結果，采用L9（34）正交表，分別以培養基初始pH值、轉速、培養溫度作為3個參考因素，選取3個水平進行試驗。按表2的正交因素水平設計L9（33）正交試驗。

表2 培養條件優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for culture conditions optimization

2 結果與分析

2.1 分離菌株鑒定

2.1.1 產蛋白酶菌株的分離與初篩

在酪蛋白平板培養基上涂布10-3、10-4、10-5濃度的大曲菌懸液，37℃條件下培養4 d，觀察并記錄每個平板上的菌落形態和透明圈的大小，選取有透明圈產生，生長緩慢，菌落緊密而不蔓延，表面干燥，菌體不易挑動與培養基緊密結合的菌落，再進行多次劃線分離后，其平板形態見圖1。

圖1 初篩菌落透明圈Fig.1 Transparent circle of screening colony

2.1.2 分離菌株復篩

將各分離菌株接種到發酵培養基中，120 r/min、37℃條件下培養4d，取發酵液測定其蛋白酶活力，結果見圖2。由圖2可知，產蛋白酶量較大的菌株依次序分別是菌株F3、F4、F1，其中菌株F3的酶活最大為20.98U/mL。故選定菌株F3進行后續試驗。

圖26 株分離菌的產蛋白酶結果Fig.2 Protease-producing results of six isolated strains

2.1.3 分離菌株形態學鑒定

將分離菌株F3進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察，得出細胞形態，如圖3所示。由圖3可知，該菌染色結果為紫色，是革蘭氏陽性菌。該菌的基內菌絲不斷裂，氣生菌絲發育良好，且有較長的輪生孢子絲。

圖3 分離菌株F3的形態Fig.3 Morphology of isolated strain F3

2.1.4 分離菌株16SrDNA同源序列分析及系統發育樹構建

以菌株F3的總DNA為模板，采用通用引物進行擴增，經瓊脂糖電泳檢測，出現唯一條帶，大約為1400bp的特異性擴增產物，如圖4所示。

圖4 菌株F3的PCR擴增產物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of PCR amplified products of strain F3

將測出的序列在NCBI上進行BLAST比對，下載與此序列同源性高的序列，經MEGA6.0軟件采用鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法將測定的序列與在GenBank中下載的序列進行分析，構建系統發育樹，獲取目的菌的分類地位，結果見圖5。由圖5系統發育樹可知，分離菌株F3鑒定為婁徹氏鏈霉菌（Streptomycesrochei）。

圖5 菌株F3的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain F3

2.2 分離菌株F3的生長特性及產酶特性研究

2.2.1 分離菌株F3生長曲線測定

圖6 菌株F3生長曲線Fig.6 Growth curve of strain F3

將分離菌株F3接種于盛有100mL發酵培養基的250mL三角瓶中，120r/min、37℃恒溫培養，每隔12 h測定其菌體干質量，結果如圖6所示。在0～84 h內，該菌菌體干質量一直增加，前36 h生長較為旺盛，36～84 h相對緩慢，生長主要表現在菌絲尖端的伸長和出現分支、斷裂等，此時期的菌體呼吸強度達到高峰，有的開始積累代謝產物。在84 h后，菌體干質量開始下降，大多數次級代謝產物在此期合成，大多數細胞都出現大的空泡。有些菌絲體還會發生自溶，這與菌種和培養條件有關。

2.2.2 酪氨酸標準曲線的制作

以酪氨酸含量（x）為橫坐標，不同含量的酪氨酸對應的吸光度值（y）為縱坐標，得到酪氨酸的標準曲線方程為：y=0.009 2x+0.006 8，其相關系數R為0.999 7，并在0～100 μg/mL范圍內與吸光度值的線性關系良好。

2.2.3 分離菌株產蛋白酶曲線測定

以蛋白酶活力為縱坐標，時間為橫坐標，繪制該菌株的產蛋白酶曲線。如圖7所示，該菌株在培養的前96 h中，蛋白酶酶活一直在增加，但在96 h后呈現降低的趨勢。因此，在后續試驗中都選擇恒溫培養96 h時測定蛋白酶活力。

圖7 菌株F3的產蛋白酶曲線Fig.7 Protease production curve of strain F3

2.2.4 培養基初始pH對分離菌株產蛋白酶的影響

圖8 不同初始pH對菌株F3產蛋白酶的影響Fig.8 Effects of different initial pH on the protease production of strain F3

發酵液pH值會引起微生物細胞膜電位的變化，導致其對微生物營養物質的吸收能力產生變化[12-13]。每種微生物都有其生長的最佳pH值，過酸或者過堿，微生物的生長能力都會受阻，菌體死亡率增加，引起產酶能力的下降。培養基初始pH對菌株產蛋白酶的影響見圖8。由圖8可知，該菌株在pH值為5～9時產蛋白酶量逐漸增加，pH值為9～10時產蛋白酶量逐漸減少，其最適產蛋白酶pH值為9，酶活力達到21.88 U/mL，且堿性條件下產酶能力明顯高于中性和酸性條件。

2.2.5 轉速對分離菌株產蛋白酶的影響

圖9 轉速對菌株F3產蛋白酶的影響Fig.9 Effects of rotate speed on the protease production of strain F3

由圖9可知，當搖床轉速在0～180 r/min時該菌株的產蛋白酶量逐漸增加，轉速180～240 r/min時菌株的產酶能力下降，可能是由于轉速過高，會對菌體細胞造成嚴重的破壞，導致菌株的產酶能力下降[14]。即轉速為180 r/min時產蛋白酶能力最大，達到22.88 U/mL。

2.2.6 發酵溫度對分離菌株產蛋白酶的影響

圖10 發酵溫度對菌株F3產蛋白酶的影響Fig.10 Effects of culture temperature on the protease production of strain F3

由圖10可知，該菌株在30～35℃時產蛋白酶量逐漸增加，35～50℃時產蛋白酶量逐漸減少，由于過高的溫度會使菌體的生長速度變慢，代謝能力下降，進而影響菌株的產酶，所以在40℃過后，產酶能力大幅下降，但并沒有完全消失，可能是由于該菌是從醬香型高溫大曲分離得到，對高溫環境已經具有一定的適應能力[15]。故其最適發酵溫度為35℃，產蛋白酶能力最大，達到28.62 U/mL。

2.2.7 分離菌株產蛋白酶條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果，按表2設計正交試驗，對結果進行分析，以確定最佳條件。正交試驗結果與分析見表3。

表3 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of strain F3

由正交試驗表3中得出的最佳組合為A2B2C2，與直觀結果A2B2C3相比，得到A2B2C2組合產酶量更高，即最佳發酵條件為初始pH值為9，轉速180 r/min，培養溫度35℃，此時發酵液的酶活力大小為28.62 U/mL。

3 結論

本研究對醬香型大曲中高產蛋白酶放線菌進行了分離鑒定，并對其發酵特性進行了研究。采用稀釋涂布和平板劃線法對醬香型大曲中的產蛋白酶放線菌進行分離純化，以蛋白酶活為指標，篩選出了一株產蛋白酶能力較強的菌株，并通過16S rDNA同源序列分析對該菌株進行遺傳學鑒定，確定該株菌為婁徹氏鏈霉菌（Streptomycesrochei）。以不同的初始pH、轉速、培養溫度做單因素試驗研究其產蛋白酶能力，并在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗，獲得該株菌最優產酶條件為培養溫度35℃，轉速180r/min，培養基初始pH9，此最佳條件下其蛋白酶活力為28.62U/mL。

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Isolation of protease-producing actinomycetes from sauce-flavorDaquand its proteaseproducing conditions

YU Hua,HUANG Dan*,CHEN Zhuo,TANG Jiao,MAO Xiang,DENG Ling,LIU Dan,LYU Kaibin
(College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

A strain of actinomycetes with high yield protease was isolated and identified,and its protease-producing characteristic was researched.The objective strain was separated and purified through spread plate and biochemical reaction method,and the target strain was identified by morphological characteristics and genetic characteristics.The enzyme producing conditions of the target strains were optimized by single factor and orthogonal tests.The results showed that the strain was identified asStreptomyces rocheiby molecular biological identification,and the optimum fermentation conditions through single factor and orthogonal tests were：pH 9.0,fermentation temperature 35℃,rotation speed 180 r/min,the enzyme production capacity could reach the maximum of 28.62 U/ml.

sauce-flavor;protease;actinomycetes;Daqu

TS261.1

0254-5071（2017）02-0064-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.014

2016-10-02

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室項目（NJ2013-02）；瀘州老窖科研獎學金項目（15ljzk02）；四川理工學院大學生創新創業訓練計劃項目（201610622010）

于華（1991-），男，碩士研究生，研究方向為固態釀造功能微生物。

*通訊作者：黃丹（1968-），女，教授，本科，研究方向為微生物及應用。