一株高產乙酸乙酯酵母的鑒定及產酯條件的研究

鐘姝霞，萬世旅，邊名鴻*，劉茗銘，楊贇，顏超

(1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000；3.四川威斯特分析測試有限公司，四川成都610101）

一株高產乙酸乙酯酵母的鑒定及產酯條件的研究

鐘姝霞1,2，萬世旅3，邊名鴻1,2*，劉茗銘1，楊贇1，顏超1

(1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000；3.四川威斯特分析測試有限公司，四川成都610101）

以不同酒曲中篩選出的一株產乙酸乙酯能力較強的酵母Y2為研究對象，利用磷脂脂肪酸分析和分子生物學方法對其進行鑒定，通過單因素試驗分別考察培養方式、發酵時間、發酵溫度和糖化液糖度4個因素對酵母Y2產酯能力的影響，采用正交試驗和驗證試驗對酵母Y2的產酯條件進行優化。結果表明，酵母Y2為異常畢赤酵母（Pichia anomala），其脂肪酸成分以18∶1ω9c為主；發酵溫度和發酵時間對酵母菌株Y2產酯量具有顯著性影響（P＜0.05），優化后的產酯條件為：發酵溫度28℃，高粱糖化液糖度12°Bx，靜置培養5 d；在此最優條件下，酵母Y2產乙酸乙酯的量可達到3.47 g/L。

酒曲；鑒定；異常畢赤酵母；乙酸乙酯；優化

酯類物質在白酒香氣形成過程中起到重要的作用，它既是香氣的組成成分，又是區別白酒與其他蒸餾酒不同的地方。產酯酵母是可生成較多量酯類物質的酵母的通稱[1-2]，具有不同程度的酯化能力[3]。近幾年，對產酯酵母的研究愈加成熟[4-6]，余偉民等[4]采用在入窖前的糟醅中添加生香酵母的方法，考察添加后的酒體中總酯、四大乙酯等成分變化，其總酯、四大乙酯等均有較大的增幅，特香型白酒酒體風格不變，酒體變得醇厚，酒質得到了提高。

乙酸乙酯是我國白酒中含量較多的香味物質之一，對白酒的風格及成型具有重要的作用。乙酸乙酯是濃香型白酒四大骨架酯之一，也是清香型白酒的主體呈香呈味物質[7]。但關于產酯酵母的代謝機理尚不清楚，相關報道較少。普遍認為乙酸乙酯是在酵母細胞內合成的，而不是在培養基中由酯化作用生成的，因此酵母菌健壯與否對酯的生成有著密切的關系。本試驗以西南各地區的酒曲樣品中篩選出的一株高產乙酸乙酯酵母菌株Y2為研究對象，利用磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）分析和分子生物學方法對其進行鑒定，并通過單因素和正交試驗優化其產酯條件，以期能為小曲的制曲提供優良的菌種，提高和穩定小曲酒的風味，改善酒質，提高優酒率。同時，促進小曲酒的發展，提高小曲酒生產企業的經濟效益和市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

從不同酒曲中篩選出的一株產乙酸乙酯能力較強的酵母Y2。

1.1.2 主要試劑

醋酸鈉、氯化鉀、無水乙醇、酚酞、氯仿、異戊醇、濃硫酸、濃鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；糖化酶（50000U/g）、淀粉酶（50000U/g）、蛋白胨、酵母浸膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；甲醇（色譜純）：德國Darmstadt公司；正己烷（色譜純）：美國Fisher Scientific公司；甲基叔丁醚（色譜純）：瑞典Telia公司；瓊脂糖：北京索萊寶科技有限公司；dNTPs、Taq DNA polymerase、TaKaRaTaqTM、DL2000TMDNA Marker：寶生物工程(大連)有限公司；真菌26S rDNA通用引物ITS1：TCCGTAGGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC：英濰捷基生物技術上海公司合成；十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、Tris-飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養基

菌種活化培養基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，pH自然。

沙氏葡萄糖瓊脂培養基：蛋白胨10.0 g/L，葡萄糖40.0 g/L，瓊脂15 g/L，pH值5.6±0.2。

發酵產酯培養基[8]：取150g高梁粉于2L燒杯中，加入少量自來水，攪成糊狀，再加80℃左右熱水600mL，攪勻。用體積分數20%硫酸溶液調節pH值至6.0～6.5，加入80U/g α-淀粉酶于高粱液中，攪勻，置于75℃恒溫水浴鍋中液化30min，補足水至1200mL。將燒杯中的糖化液轉移到三角瓶中，高壓滅菌，待壓力升至0.1MPa后，保壓1 h，取出冷卻至60℃，用體積分數20%硫酸溶液調節pH值至4.5，加入150 U/g糖化酶于高梁液中，然后放入60℃恒溫水浴鍋保溫糖化1h，煮沸5min。取出，室溫條件下5000r/min離心10min，取上清液備用。

1.2 儀器與設備

E100生物顯微成像系統：日本NIKON公司；6890N氣相色譜儀：美國Agilent科技有限公司；Sherlock 6.0微生物鑒定系統：美國MIDI公司；DM3000正置生物顯微鏡：德國徠卡公司；HT300A固相微萃取儀：意大利HTA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產酯酵母的磷脂脂肪酸分析

將活化好的酵母以四區劃線法接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，在28℃條件下培養24h后提取磷脂脂肪酸。主要步驟為：挑取第三區的單菌落（約40mg）于有螺旋蓋的試管底部，加入1 mL皂化試劑（45 g氫氧化鈉溶于300mL體積分數為50%的甲醇溶液），擰緊螺蓋沸水浴5min，取出振蕩5～10 s，再度擰緊螺蓋，繼續沸水浴25 min；待樣品管冷卻后，加入2mL甲基化試劑（97.5mL濃鹽酸、137.5mL甲醇溶于65 mL蒸餾水），蓋嚴振蕩，（80±1）℃水浴10 min，冷水浴冷卻至25℃（溫度與時間要嚴格控制，以免羥基酸和環式脂肪酸受到破壞）；在冷卻的樣品管中加入1.25 mL甲基叔丁基醚，快速振蕩10 min，棄去下層水相；在剩余有機相中加入3 mL堿洗滌液（0.3 mol/L NaOH溶液），快速振蕩5 min，加3～4滴飽和氯化鈉溶液，取2/3上層有機相至氣相色譜樣品瓶中備用，用于氣相檢測。將待檢樣品于氣相色譜儀上機進樣鑒定，氣相色譜各參數由MIDI Sherlock程序設置調用，將所得的磷脂脂肪酸信息與MIDI Sherlock中的YST28 3.80庫進行比對，鑒定樣品中微生物的種類[9]。

1.3.2 產酯酵母的分子鑒定

采用改良的CTAB法[10]提取酵母Y2菌株DNA。

將提取的DNA送往上海杰李生物用真菌26S rDNA通用引物ITS1和ITS4進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增并鑒定。

PCR擴增體系（50μL）：ddH2O33.5μL，10×buffer5μL，dNTP 4 μL，引物各1 μL，模板5 μL，Taq0.5 μL。

PCR擴增程序：94℃預變性5.0 min；94℃變性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1.0 min）；30個循環72℃延伸7.0 min。

1.3.3 產酯條件單因素試驗設計

酵母Y2種子液制備：在無菌條件下挑取純菌種至100 mL菌種活化培養基，30℃、100 r/min培養72 h，得到酵母Y2種子液。

用高粱糖化液作為發酵培養基，將活化好的酵母種子液按10%（V/V）的接種量于發酵產酯培養基中，考察高粱糖化液糖度（6°Bx、8°Bx、10°Bx、12°Bx、14°Bx）、發酵溫度（22℃、25℃、28℃、31℃、34℃）、培養時間（2d、3d、4d、5d、6 d）和培養方式（搖床轉速50 r/min、100 r/min、150 r/min、靜置）4個因素對酵母菌株Y2產乙酸乙酯量的影響，確定較優的產酯條件。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，按L9（33）進行正交試驗設計[11]，考察發酵溫度、發酵時間、高粱糖化液糖度3個因素對酵母菌株Y2產乙酸乙酯量的影響，確定最佳產酯條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 酵母Y2發酵產酯條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for esterproducing conditions optimization of yeast Y2

1.3.5 乙酸乙酯含量的測定[12-14]

將發酵液用定性濾紙過濾除去菌體和沉淀，收集濾液后用0.45 μm微孔濾膜過濾，準確量取過濾后的發酵液100 mL于蒸餾瓶中，并加入50 mL水蒸餾，收集100 mL餾出液，按GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中規定的方法測定餾出液中乙酸乙酯的含量。

1.3.6 數據分析

利用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析（采用一般線性模型單因素Duncan法），檢測結果用平均值±標準差表示，所得數據在Origin 8.0中編輯作圖。

2 結果與分析

2.1 產酯酵母的磷脂脂肪酸分析

脂類物質是構成生物細胞膜的主要成分，且在細胞中含量穩定[15-16]，約占細胞干質量的5%[17]。通常這些脂類物質的組成和含量在同一種微生物中是穩定的和可遺傳的[18]。磷脂是一類含有磷酸的脂類物質。磷脂脂肪酸即為甲基化脂類物質并提取磷脂成分后，所得到的脂肪酸產物，它具有屬的特異性，通過磷脂脂肪酸的組成和含量的差異可對純種培養的微生物進行快速鑒定。酵母Y2的磷脂脂肪酸分析和鑒定結果分別見表2、表3。由表2可知，酵母Y2的脂肪酸以長鏈不飽和脂肪酸為主，其中含量最多的為18∶1ω9c（41.89%），該脂肪酸為真菌的一種標志脂肪酸。由表3可知，通過與酵母庫YST28 3.80比對發現酵母Y2與第一選擇畢赤酵母（Pichia）相似值為0.331，與第二選擇Candida castrensis的相似值為0.214，說明酵母Y2可能為Pichia的一種非典型菌種[9]。

表2 酵母Y2的脂肪酸組成Table 2 Fatty acids composition of yeast Y2

表3 MIDI微生物鑒定系統鑒定結果Table 3 Identification results of MIDI microbial identification system

2.2 產酯酵母的分子鑒定

為進一步確定酵母菌株Y2的種屬，利用引物ITS1和ITS4對酵母菌株Y2的26S rDNA-ITS序列進行PCR擴增，并對擴增序列測序，用BLAST將測序結果與GenBank數據庫中的序列進行比較并構建系統發育樹見圖1。由圖1可知，酵母菌株Y2與異常畢赤酵母（Pichia anomala）聚在一簇的相似度為100%，表明酵母菌株Y2屬于Pichia anomala。

圖1 菌株Y2的26S rDNA-ITS序列系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 26S rDNA-ITS sequence of yeast Y2

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 不同培養方式對酵母菌株Y2產酯的影響

考察培養方式對酵母菌株Y2產乙酸乙酯含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 不同搖床轉速對酵母Y2產乙酸乙酯的影響Fig.2 Effects of different shaking table revolution on ethyl acetate production by yeast Y2

由圖2可知，隨著轉速的增加，乙酸乙酯產量呈明顯地下降趨勢（P＜0.05），而靜置培養的產酯能力明顯高于搖床培養，在此培養方式下，乙酸乙酯產量達到3.16 g/L，原因可能是由于通氣量過大使酵母呼吸旺盛，加速了乙酸乙酯的分解[1]。同時在空氣充足的條件下，酵母以生長繁殖為主。由此可知，雖然產酯酵母產酯需要一定量的空氣，但不宜過多。因此，對酵母菌株Y2采用靜置培養。

2.3.2 高粱糖化液糖度對酵母菌株Y2產酯的影響

考察高粱糖化液糖度對酵母菌株Y2產乙酸乙酯的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨著糖化液糖度的增加，酵母Y2產乙酸乙酯量呈先增加后減少的趨勢，在糖化液糖度為10°Bx時產乙酸乙酯效果最佳，達到3.42 g/L。這說明一定范圍內糖度增加對產酯有一定的促進作用，但過后隨著糖度增加，其滲透壓增大，產酯量隨之下降。同時，高粱糖化液糖度為8°Bx、10°Bx和12°Bx時，其差異不顯著，因此選擇這三個糖度進行后續試驗。

圖3 糖化液糖度對酵母Y2產乙酸乙酯的影響Fig.3 Effect of saccharification liquid sugar content on ethyl acetate production by yeast Y2

2.3.3 發酵溫度對產酯的影響

考察發酵溫度對酵母菌株Y2產乙酸乙酯的影響，結果如圖4所示。

圖4 發酵溫度對酵母Y2產乙酸乙酯的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on ethyl acetate production by yeast Y2

由圖4可知，隨著發酵溫度的升高，酵母菌株Y2產乙酸乙酯酯量呈先增加后降低，在發酵溫度為28℃時，乙酸乙酯產量最高，達3.34 g/L。酵母酯化酶活力對溫度具有較高的依賴性，溫度的變化對酯化酶的作用有很大的影響。因此，選擇25℃、28℃和31℃進行后面的正交試驗。

2.3.4 發酵時間對產酯的影響

考察發酵時間對酵母菌株Y2產乙酸乙酯的影響，結果如圖5所示。

圖5 發酵時間對酵母Y2產乙酸乙酯的影響Fig.5 Effect of fermentation time on ethyl acetate production by yeast Y2

由圖5可知，酵母菌株Y2產乙酸乙酯的量隨著發酵時間的增加呈先增加后稍微降低的趨勢。在發酵初期，酵母正處在生長繁殖的高峰，乙酸乙酯合成量較少。隨后酯的合成旺盛，酯迅速積累，當發酵時間為4 d時，乙酸乙酯的產量達到最大值，為3.34 g/L；到第4天后趨于穩定。其原因是酯的生成和分解是同時進行的，4 d過后酯的分解速度加快。因此，選擇發酵時間4 d為宜。

2.4 酵母菌株Y2產酯工藝的優化

根據單因素試驗結果，設計L9（33）正交試驗進行產酯發酵條件優化，以乙酸乙酯的產量為評價指標，選擇發酵溫度、發酵時間和高粱糖化液糖度3個因素，研究其對酵母菌株Y2產酯的影響，確定最佳的產酯工藝條件，正交試驗結果與分析見表4，方差分析結果見表5。

表4 酵母Y2發酵產酯條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for esterproducing conditions optimization of yeast Y2

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results

由表4可知，各影響因素對酵母Y2產酯的影響程度為RA＞RB＞RC，即發酵溫度＞發酵時間＞高粱糖化液糖度。綜合分析得到產酯最佳方案為A2B3C3，即發酵溫度28℃，發酵時間5 d，高粱糖化液糖度12°Bx。

由表5可知，發酵溫度和發酵時間對酵母菌株Y2產酯具有顯著性影響（P＜0.05），高粱糖化液糖度對酵母菌株Y2產酯的影響不顯著（P＞0.05）。

2.5 驗證試驗

通過單因素試驗和正交試驗獲得酵母菌株Y2產酯的最佳工藝條件為：發酵溫度28℃，高粱糖化液糖度12°Bx，靜置培養5 d。在該優化產酯條件下，通過3次驗證試驗，得到酵母菌株Y2產乙酸乙酯的量為3.47 g/L。

3 結論

本研究以酒曲中篩選得到一株高產乙酸乙酯的酵母菌株Y2為研究對象，經PLFA和分子生物學對其進行鑒定。結果表明，酵母菌株Y2為異常畢赤酵母（Pichia anomala），并采用單因素試驗和正交試驗對酵母菌株Y2產乙酸乙酯發酵條件進行了優化，確定了酵母菌株Y2最佳的產酯條件為發酵溫度28℃，高粱糖化液糖度12°Bx，靜置培養5 d。在此最優產酯條件下，酵母菌株Y2產乙酸乙酯的量可達到3.47 g/L。在今后的研究中，可利用基因工程技術、原生質體融合技術、誘變育種技術等高新技術來提高酵母的產酯能力，協調各香味物質的比例，以達到理想的產香效果。

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Identification and ester-producing conditions of a high ethyl acetate-producing yeast

ZHONG Shuxia1,2,WAN Shilv3,BIAN Minghong1,2*,LIU Mingming1,YANG Yun1,YAN Chao1
(1.School of Biotechnology Engineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China;2.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China;3.Sichuan Swat Analyze and Test Limited Company,Chengdu 610101,China)

Using a high ethyl acetate-producing yeast strain Y2 screened from differentJiuquas research object,the yeast Y2 was identified by phospholipid fatty acid analysis and molecular biology methods.The effects of culture mode,fermentation time,fermentation temperature,and saccharification liquid sugar content on ester-producing ability of yeast Y2 were investigated by single factor experiment.The ester-producing conditions of yeast Y2 were optimized by orthogonal experiments and verification experiments.Results indicated that yeast Y2 wasPichia anomala, the main fatty acid composition was 18∶1ω9c,fermentation temperature and time had significant effect on ester yield of yeast Y2(P＜0.05).The optimum ester-producing conditions were as follows：fermentation temperature 28℃,sugar content of sorghum saccharification liquid 12°Bx,static culture for 5 d,in the optimum conditions,the ethyl acetate yield of yeast Y2 could reach 3.47 g/L.

Jiuqu;identification;Pichia anomala;ethyl acetate;optimization

TS261.1

0254-5071（2017）02-0075-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.016

2016-09-01

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金項目（NJ2013-03）

鐘姝霞（1990-），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：邊名鴻（1979-），女，副教授，碩士，研究方向為發酵工程。