一株高產果膠酶的真菌分離鑒定及酶學特性

尹樂斌，雷志明，孔彥卓，楊瑩，趙良忠*

(1.邵陽學院生物與化學工程系，湖南邵陽422000；2.湖南省豆制品加工技術基礎研究基地，湖南邵陽422000）

一株高產果膠酶的真菌分離鑒定及酶學特性

尹樂斌1,2，雷志明1，孔彥卓1，楊瑩1，趙良忠1,2*

(1.邵陽學院生物與化學工程系，湖南邵陽422000；2.湖南省豆制品加工技術基礎研究基地，湖南邵陽422000）

以果膠為唯一碳源，對采集自湖南武岡市臍橙果園土樣（pH 5.5～6.5）進行富集篩選，分離得到一株產果膠酶的菌株，編號為BM201。根據形態學觀察、ITSrDNA及28SrDNAD1/D2序列同源性比對及系統進化分析對菌株進行多相鑒定，初步將該菌株鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）BM201。該菌株發酵產酶條件為30℃、160 r/min搖床發酵培養3 d，在該條件下獲得的果膠酶酶活為421 U/L。該酶最適反應溫度為50℃，在30～50℃條件下處理60 min，該酶的相對酶活在80%以上，表明該酶的熱穩定性較好；該酶的最適作用pH值為5.0，在pH4.0～7.0下處理60 min，該酶的相對酶活在50%以上，表明該酶在酸性條件下的穩定性較好。

果膠酶；系統進化；尖孢鐮刀菌；相對酶活

果膠類物質是由多個D-乳糖醛酸通過α-1,4糖苷鍵相互連接形成的直鏈狀聚合物，廣泛存在于植物初生壁和細胞間隙中，構成相鄰細胞中間層黏結物[1-3]，同時，果膠類物質還能與纖維素和半纖維素等非淀粉多糖交織在一起形成細胞壁[4]。果膠酶是一種能夠分解果膠質類物質的復合酶，廣泛分布于高等植物和微生物中，根據其作用底物、酶切位點及酶解初始產物的不同，分為果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶三類[3,5]。果膠酶占整個酶制劑總產量高達10%的份額[6]，其銷售收入占食品酶制劑總額的40%[6-7]，廣泛應用于食品加工、污水處理及紡織加工等行業[6-9]。近年來隨著不斷深入的研究，有關果膠酶及其水解物應用于植物誘導抗病的研究報道日漸增多[10-14]，顯示了該酶誘人的應用前景。因此，尋找高產、穩產及高活力新果膠酶菌種資源具有重要的意義。

基于果膠酶廣泛用途，有關產果膠酶微生物的分離篩選、發酵條件優化及果膠酶基因的克隆表達等的研究異?；钴S，目前篩選得到產果膠酶的菌種很多，來源極其廣泛，主要包括細菌、霉菌、酵母，其中以黑曲霉、根霉研究報道為多[15-16]。然而，有關尖孢鐮刀菌產果膠酶還鮮見報道，為開發微生物新資源，本研究從臍橙果園土壤篩選到產果膠酶菌株BM201，運用形態學及分子生物學的方法進行鑒定，并對該菌株發酵的果膠酶酶學性質進行了初步研究，豐富了產果膠酶菌種資源。因此，研究尖孢鐮刀菌產嗜酸果膠酶微生物的篩選、分離及其產酶特性，對于拓寬果膠酶的應用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

采自湖南武岡市臍橙果園土樣（pH 5.5～6.5），裝入滅菌封口塑料袋中，-20℃保存備用。

1.1.2 主要試劑

果膠、半乳糖醛酸：美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

富集、復篩培養基：果膠8 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.1 g/L，蒸餾水定容，于115℃滅菌20 min。

初篩培養基：含0.01 g/L剛果紅及1.5%瓊脂的富集培養基。

種子培養基：碳源為柑橘皮渣8 g/L、果膠1 g/L，其他成分與富集培養基相同。

液體發酵產酶培養基：柑橘皮渣8g/L，（NH4）2SO41.5g/L，K2HPO41.0 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.1 g/L，蒸餾水定容，分裝后于115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Mastercycler型PCR儀：德國Eppendorf公司；UV2201型紫外分光光度計：日本島津股份有限公司；GIS2020型凝膠圖象分析系統：上海天能科技有限公司；BX51型顯微鏡：日本Olympus等。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離篩選

將5 g土壤樣品加入含100 mL富集培養基的錐形瓶中，30℃、160 r/min搖床富集培養3 d，取5 mL富集菌液接種到新鮮的富集培養基中，在上述的條件下培養，如此反復富集5～6次。富集菌液用無菌水進行10倍梯度稀釋，取適當稀釋度菌懸液接種于初篩培養基上，30℃恒溫培養3 d，觀察菌落形態并分別測量水解圈及菌落直徑的大小，選擇水解圈直徑與菌落直徑比值相對較大的菌株進行復篩。對初篩得到的菌株接種到液體產酶培養基中，在上述培養條件下培養，測定粗酶液的果膠酶活力，以產酶活力最高的菌株作為目標菌，接種到斜面復篩瓊脂培養基上，4℃保存備用。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）菌體形態及培養特性

觀察菌株在平板上的菌落形態，用光學顯微鏡進行菌落形態、菌絲、分生孢子等特征的觀察，參考《真菌鑒定手冊》[17]方法進行初步的分類檢索。

（2）ITS序列的PCR擴增及測序分析

為了提高菌株的分子鑒定可靠性，同時擴增ITS rDNA和28S rDNA D1/D2區核酸保守序列，進行BLAST比對分析?；蚪MDNA的提取參照FERRE C等[18]的方法進行。用真菌ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGT GAA CCT GCG G-3′）及ITS4（5′-TCCTCCGCT TAT TGATAT GC-3′）[19-20]擴增ITS rDNA片段。利用引物F63（5′-GCA TAT CAA TAAGCGGAGGAAAAG-3′）及LR3（5′-GGTCCGTGTTTC AAG AACG-3′）[20-21]擴增28S rDNA D1/D2序列。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系及條件參照劉建利[20]的方法進行。PCR產物經回收、純化后送測序。ITS rDNA和28S rDNA D1/D2測序結果在GenBank中進行BLAST同源性比對，選出相似性＞96%的序列，應用MEGA 6.06[22]軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）分別構建ITS rDNA及28S rDNA D1/D2序列的系統進化樹。

1.3.3 果膠酶酶活力測定

（1）粗酶液的制備

將保存的斜面菌株活化后接入種子培養基在30℃、160r/min培養12h，制備種子液。以3%接種量接入發酵培養基30℃、160r/min培養72h，發酵液8000r/min離心20min，上清即粗酶液。

（2）果膠酶酶活力測定

果膠酶活力的測定參照KALAICHELVAN P[23]并稍加改進：取稀釋的粗酶液0.5 mL，加入1.5 mL pH 5.0的0.5%果膠液，50℃水浴30 min，加2 mL 3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，沸水浴中反應10 min滅活粗酶液，冷卻至室溫后定容。以經沸水滅活的酶液作為空白對照，于波長540 nm處測定OD540nm值。果膠酶定義：1 mL液體酶在50℃及pH 5.0條件下，每分鐘降解底物產生1 μg還原性半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活單位（U/mL）。每次實驗重復3次，求平均值。

1.3.4 酶學特性

（1）酶最適反應溫度及熱穩定性

研究粗酶液在溫度30～90℃條件下的相對酶活力，以確定該酶液作用的最適溫度。為了測定果膠酶的熱穩定性，將粗酶液在30～90℃恒溫水浴下處理60 min，取出后立即放入冰浴備用，測定殘留酶活，以未經水浴處理的酶活力為100%，計算相對酶活。

（2）酶最適pH及酸堿穩定性

研究粗酶液在pH 3.0～9.0的緩沖體系中的酶活力，測定酶作用的最適pH值。粗酶液分別在pH 3.0～9.0緩沖液中于30℃恒溫水浴處理60 min，然后調節pH至5.0，測定殘留酶活力，以最大酶活為100%，計算相對酶活。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株的分離、篩選

土壤樣品經過反復富集培養，根據以果膠為唯一碳源的初篩培養基上的水解圈大小初步判斷菌株產果膠酶的能力，獲得產生水解圈直徑較明顯的菌株10株。經過酶活力的復篩，得到一株產酶活力最高且穩定的真菌，編號為BM201，提交至中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）保存，編號為CGMCC No.9108。菌株BM201按照

1.3.3 節方法制備的粗酶液酶活達421 U/L。菌株BM201在未進行發酵條件優化所產果膠酶酶活遠高于顧紅燕等[24]利用高大毛霉（Mucor mucedo）發酵所產生275 U/L的果膠酶酶活，但低于趙曉璐等[25]從荷葉中分離的1株產果膠酶內生真菌炭疽菌屬（Colletotrichumsp.），該菌在28℃、150 r/min發酵10 d，測得其酶活分別為62.9 U/mL?？梢灶A測本實驗獲得菌種經過培養基及發酵條件的優化后，其酶活有較大的提升空間。

2.2 菌株菌落及菌體形態學觀察及培養特性

菌株BM201在復篩培養基平板上30℃條件下培養2～3d，結果見圖1。由圖1可知，菌落突起絮狀，高3～5mm，菌絲白色質密。菌落起初呈粉白色，隨后呈淺粉色至肉色，略帶有淺紫色，由于大量孢子生成而呈粉質。小型分生孢子著生于單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成球團，假頭狀著生，單胞，卵形、腎形等，大?。?.2～7.8）μm×（1.3～3.3）μm；大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，多胞，略彎曲，兩端細胞稍尖，多數為2～3隔膜，大?。?.2～25.6）μm×（2.8～4.5）μm。菌株BM201具有較寬的pH值耐受范圍（pH 3.0～9.0），最適生長的pH值為5。該菌株發酵培養過程OD540nm值的總體變化趨勢都是隨著培養發酵時間的延長而增加。在發酵初期（1～2 d）的發酵液顏色與培養基配制時的顏色相同，沒有明顯的變化；在發酵中期（3～5 d），BM201發酵液的顏色發生明顯變化，3d時淡奶紅色，在5d顏色加深，轉變為淺紅色。

圖1 菌株BM201的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of strain BM201

2.3 ITS序列分析及系統發育樹構建

菌株BM201的ITS rDNA及28S rDNA D1/D2測序結果分別為525 bp（GenBank登錄號為KF857541），590 bp（GenBank登錄號為KF857542）。用Clustal X軟件（Version 2.0）將ITS rDNA及28S rDNA D1/D2各自近緣種序列進行比對，以最短序列為標準，統一調整片段長度，然后再利用MEGA 6.06軟件對菌株BM201的ITS rDNA及28S rDNA D1/D2序列分別構建系統發育樹，結果分別見圖2、圖3。結合二者的系統發育樹可知，BM201與其他Fusarium oxysporum菌株緊密地聚集在同一個分支上，均具有95%以上的同源性，這與BLAST比對分析結果一致?；谏鲜鼍晷螒B學特征及培養特性，ITS rDNA及28S rDNA D1/D2序列同源性分析及系統進化分析，將該真菌鑒定為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌，并將其命名為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）BM201。

圖2 菌株BM201基于ITS rDNA序列分析的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain BM201 based on ITS rDNA sequence analysis

圖3 菌株BM201的28S rDNA D1/D2序列構建的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain BM201 constructed by 28S rDNA D1/D2 sequence

2.4 尖孢鐮刀菌BM201果膠酶特性

2.4.1 酶最適反應溫度及熱穩定性

在不同溫度下測定菌株BM201產果膠酶活力，其酶活力的溫度效應曲線見圖4。由圖4可知，其溫度效應“鐘型”曲線變化幅度相對平穩，該果膠酶最適反應溫度為50℃。低于50℃，相對酶活力隨溫度的增加而增加；高于50℃，相對酶活隨溫度的升高而降低，但在40～60℃范圍內其相對酶活力仍保持在80%以上，表明該酶液可以在較廣的溫度下使用。酶的熱穩定性結果表明，在30～50℃條件下處理60 min，該酶的殘留相對酶活力在80%以上，保持相對穩定，表明該酶的熱穩定性相對較好。

圖4 溫度對果膠酶活性及穩定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of pectinase

2.4.2 酶最適pH及酸堿穩定性

由圖5可知，該果膠酶在pH 3.0～9.0范圍內均保持酶活力，表明該酶可以耐受較廣的pH范圍，最適作用pH值為5.0，在強酸或強堿性條件下酶活力較低。酶的pH穩定性結果表明，該果膠酶在pH 4.0～7.0能保持較高穩定性，在此pH條件下處理60 min，BM201菌株產生的果膠酶相對酶活力保持在50%以上，表明該酶在酸性條件下穩定性較好。

圖5 果膠酶最適反應pH及酸堿穩定性Fig.5 The optimal reaction pH pH stability of pectinase

2.5討論

自然界中存在的果膠結構復雜，組成該多糖的殘基構型、相互連接的殘基種類及比例、殘基之間相互連接成鍵的位置、成鍵的角度等豐富多樣，形成了分子結構和空間結構上千差萬別的果膠分子，其降解過程需要多種酶協同作用才能完成。研究表明，果膠酶多樣性是在長期進化過程中對果膠結構復雜性的適應所致，果膠酶基因的克隆，從基因水平揭示果膠酶基因的多樣性[26-27]。植物的細胞壁是病原菌入侵的主要障礙，植物病原菌含有大量的果膠酶，通過降解果膠而有利于該病原菌入侵植物組織中[28]。尖孢鐮刀菌寄主范圍非常廣泛，能夠侵染包括茄科、葫蘆科、十字花科、豆科、石竹科、芭蕉科在內的蔬菜、花卉、水果等多種作物，真菌細胞壁裂解酶基因與真菌的致病性顯著相關，尖孢鐮刀菌分泌出幾種不同的細胞壁裂解酶，其中果膠酶在該菌致病過程中的作用機理是當前研究熱點[29]。果膠酶的主要來源通過微生物法發酵獲得，已經報道有多種細菌及真菌可產果膠酶（如芽孢桿菌屬、青霉素、曲霉屬等），本實驗中分離得到產果膠酶的尖孢鐮刀菌在30℃、160 r/min培養72 h后的酶活為421 U/L，下一步將對其培養基及發酵條件進行優化，以期獲得更高的酶活。

3 結論

本研究以果膠為唯一碳源，從臍橙果園土壤中初篩到10株具有較明顯水解圈的菌株，從中復篩得到一株產酶活力最高且穩定的真菌，應用形態學觀察、ITS rDNA及28S rDNA D1/D2序列分析及系統進化分析對菌株進行多相鑒定，初步將該菌株鑒定為尖孢鐮刀菌，并命名為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）BM201。該菌株產生的果膠酶最適反應溫度為50℃，在30～50℃條件下處理60 min，殘留酶活在80%以上，表明該酶的熱穩定性相對較好；該酶的最適作用pH值為5.0，在pH 4.0～7.0條件下處理60 min殘留酶活在50%以上，表明該酶在酸性條件下的穩定性較好。BM201菌株及其發酵產生的酸性果膠酶在柑橘加工、橙汁澄清、酸性有機廢水處理等領域具有潛在的應用前景。本研究不僅豐富了產果膠酶微生物來源，同時也豐富了產果膠酶微生物多樣性及果膠酶基因庫。

[1]HARHOLT J,SUTTANGKAKUL A.,SCHELLER H V.Biosynthesis of pectin[J].Plant Physiol,2010,153(2)：384-395.

[2]EDWARDS M C,DORAN-PETERSON J.Pectin-rich biomass as feedstock for fuel ethanol production[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012, 95(3)：565-575.

[3]TU T,BAI Y,LUO H,MA R,et al.A novel bifunctional pectinase from Penicillium oxalicumSX6 with separate pectin methylesterase and polygalacturonase catalytic domains[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014, 98(11)：5019-5028.

[4]CAFFALL K H,MOHNEN D.The structure,function,and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides[J].Carbohyd Res,2009,344 (14)：1879-1900.

[5]LARA-M□RQUEZ A,ZAVALA-P□RAMO M G,L□PEZ-ROMERO E, et al.Biotechnological potential of pectinolytic complexes of fungi[J]. Biotechnol Lett,2011,33(5)：859-868.

[6]SEMENOVA M V,SINITSYNA O A,MOROZOVA V V,et al.Use of a preparation from fungal pectin lyase in the food industry[J].Appl Biochem Microbiol,2006,42(6)：598-602.

[7]PEDROLLI D B,MONTEIRO A C,GOMES E,et al.Pectin and pectinases：production,characterization and industrial application of microbial pectinolytic enzymes[J].Open Biotechnol J,2009,3(1)：9-18.

[8]ZHANG C,YAO J,ZHOU C,et al.The alkaline pectate lyase PEL168 of Bacillus subtilisheterologously expressed inPichia pastorisis more stable and efficient for degumming ramie fiber[J].Bmc Biotechnol,2013, 13(1)：26-34.

[9]PASHA K M,ANURADHA P,SUBBARAO D.Applications of pectinases in industrial sector[J].Int J Pure Appl Sci Technol,2013,16(1)：89-95.

[10]MOERSCHBACHER B M,MIERAU M,GRAE?NER B,et al.Small oligomers of galacturonic acid are endogenous suppressors of disease resistance reactions in wheat leaves[J].J Exp Bot,1999,50(334)：605-612.

[11]ROCO A,CASTA□EDA P,P□REZ L M.Oligosaccharides released by pectinase treatment ofCitrus limonseedlings are elicitors of the plant response[J].Phytochemistry,1993,33(6)：1301-1306.

[12]LANG C,D□RNENBURG H.Perspectives in the biological function and the technological application of polygalacturonases[J].Appl Microbiol Biotechnol,2000,53(4)：366-375.

[13]LI Z,BAI Z,ZHANG B G,LI B,et al.Purification and characterization of alkaline pectin lyase from a newly isolatedBacillus clausiiand its application in elicitation of plant disease resistance[J].Appl Biochem Biotechnol,2012,167(8)：2241-2256.

[14]LIONETTI V,CERVONE F,BELLINCAMPI D.Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases[J].J Plant Physiol,2012,169(16)：1623-1630.

[15]HEERD D,TARI C,FERN□NDEZ-LAHORE M.Microbial strain improvement for enhanced polygalacturonase production byAspergillus sojae[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(17)：7471-7481.

[16]MENEGHEL L,REIS G.P,REGINATTO C,et al.Assessment of pectinase production byAspergillus oryzaein growth-limiting liquid medium under limited and non-limited oxygen supply[J].Process Biochem, 2014,49(11)：1800-1807.

[17]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1979：226-227.

[18]FERRER C,COLOM F,FRAS□S S,et al.Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8 S ribosomal DNA typing in ocular infections[J].J Clin Microbiol,2001,39(8)：2873-2879.

[19]燕勇，李衛平，高雯潔，等.rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應用[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18（10）：1958-1961.

[20]劉建利.利用28S rDNA D1/D2區和ITS rDNA序列鑒定甜瓜白粉病病原菌[J].植物保護學報，2011，38（1）：47-51.

[21]FELL J W,BOEKHOUT T,FONSECA A,et al.Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis[J].Int J Syst Evol Micr,2000, 50(3)：1351-1371.

[22]TAMURA K,STECHER G,PETERSON D,et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Mol Biol Evol,2013,30 (12)：2725-2729.

[23]KALAICHELVAN P.Production and optimization of pectinase from Bacillussp.MFW7 using cassava waste[J].Asian J Plant Sci Res, 2012,2(3)：369-375.

[24]顧紅燕，齊鴻雁，張洪勛.高大毛霉制取果膠酶發酵條件實驗[J].過程工程學報，2002，2（3）：252-256.

[25]趙曉璐，周寧，唐咸來，等.一株產果膠酶荷葉內生真菌的分離鑒定[J].中國釀造，2016，35（8）：91-94.

[26]G□TESSON A,MARSHALL J S,JONES A D,et al.Characterization and evolutionary analysis of a large polygalacturonase gene family in the oomycete plant pathogenPhytophthora cinnamomi[J].Am Phytopath Soc,2002,15(9)：907-921.

[27]GACURA M D,SPROCKETT D D,HEIDENREICH B,et al.Comparison of pectin-degrading fungal communities in temperate forests using glycosyl hydrolase family 28 pectinase primers targetingAscomycete fungi[J].J Microbiol Meth,2016,123：108-113.

[28]SOHAIL M,LATIF Z.Phylogenetic analysis of polygalacturonase-producingBacillusandPseudomonasisolated from plant waste material[J]. Jundishapur J Microbiol,2016,9(1)：e28594.

[29]裴月令，曾凡云，彭軍，等.尖孢鐮刀菌與寄主互作機理研究進展[J].熱帶生物學報，2014，5（1）：92-100.

Isolation and identification of a high pectinase-producing fungus and the enzymatic characteristics

YIN Lebin1,2,LEI Zhiming1,KONG Yanzhuo1,YANG Ying1,ZHAO Liangzhong1,2*
(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Shaoyang University,Shaoyang 422000,China; 2.Soybean Processing Techniques of the Application and Basic Research Base in Hunan Province,Shaoyang 422000,China)

Withpectinasthesolecarbonsource,apectinase-producingstrainnamedBM201wasenrichedand isolated fromHunan Wugangnavelorange orchardsoilsimple(pH5.5-6.5).Accordingtothemorphologicalobservation,comparison ofITSrDNAand 28SrDNAD1/D2 sequence homologyand phylogenetic tree analysis,the strain was identified asFusarium oxysporumBM201.The fermentation enzyme-producing conditions of strain BM201 were at 30℃,160 r/min shaking table fermentation cultivation for 3 d.Under the conditions,the pectinase activity was 421 U/ml.The optimal reaction temperature of the pectinase was 50℃,and the relative enzyme activity of the pectinase was more than 80%at 30-50℃treating for 60 min,which indicated the thermostability of the pectinase was relatively better.The optimal reaction pH of pectinase was 5.0,the relative enzyme activity of the pectinasewasmorethan50%atpH4.0-7.0treatingfor60min,whichindicatedthetstabilityofthepectinaseatacidconditionswasrelativelybetter.

pectinase;phylogenetic tree;Fusarium oxysporum;relative enzyme activity

Q939.11

0254-5071（2017）02-0093-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.020

2016-11-09

湖南省教育廳青年項目(13B110)；農業科技成果轉化項目(2014GB2D200228)；豆制品加工技術湖南省應用基礎研究基地建設項目(2013TP4068)；湖南省科技計劃項目(2016RS3035)

尹樂斌(1982-)，男，講師，博士，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：趙良忠(1963-)，男，教授，碩士，研究方向為食品科學與技術。