亮氨酸氨肽酶產生菌篩選與特性的研究

周慧娉，李靜*，鄧毛程，葉茂，潘志聰

(廣東輕工職業技術學院，廣東廣州，510300）

亮氨酸氨肽酶產生菌篩選與特性的研究

周慧娉，李靜*，鄧毛程，葉茂，潘志聰

(廣東輕工職業技術學院，廣東廣州，510300）

為了促進氨肽酶的生產與應用，開展了從豆豉中篩選氨肽酶產生菌的研究。經平板篩選與搖瓶發酵篩選，獲得一株氨肽酶產生菌YBPE-4，該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。通過發酵試驗，確定菌株YBPE-4產氨肽酶的最佳碳源、氮源分別是玉米淀粉、酵母粉，確定產酶的最佳培養溫度為37℃、初始pH值為7.5、轉速為200 r/min、培養時間為84 h。在最佳的條件下，發酵液的氨肽酶活力為6 164 U/mL。

亮氨酸氨肽酶；篩選；鑒定；發酵特性

氨肽酶（aminopeptidase）是一種肽鏈外切酶，能夠從多肽鏈的氨基末端（N端）由外向內依次切斷肽鍵，使氨基酸逐個游離出來[1]。根據適宜水解的氨基酸殘基，氨肽酶可分為不同種類，亮氨酸氨肽酶因對N端帶有亮氨酸殘基的底物具有很高水解活性而得名[1-2]。氨肽酶可應用于改善肉制品、乳制品等食品的風味，并可應用于低值水產品酶解液脫苦、原料奶中嗜冷菌的快速檢測方法、組織修復、醫療診斷以及蛋白序列檢測等多個領域[3-6]，近幾十年吸引了眾多研究人員的高度關注。大約30種微生物被發現能夠產生氨肽酶[7]，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、溶解蛋白單胞菌（Aeromonas proteolytica）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus）、乳酸菌（Lactobacillus lactis）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophy-ticus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和米根霉（Rhizopus oryzae）等[1,8-10]。國內外研究人員已在菌種篩選、氨肽酶純化、酶學特性、氨肽酶應用等方面進行了大量工作，但極少有關于氨肽酶高產菌種的報道，且國內尚未進行氨肽酶制劑的生產。隨著食品工業中活性肽開發的不斷發展，氨肽酶的市場需求日益增大，其規?；a問題亟需解決。本實驗從豆豉中篩選氨肽酶高產菌種，并初步研究其發酵特性，旨在為氨肽酶工業化生產提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆豉：市售；4-硝基苯胺、L-亮氨酸-4-硝基苯胺、玉米淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、大豆蛋白、酪蛋白、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、MgSO4·7H2O、KH2PO4等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

富集培養基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0。

平板分離培養基參照文獻[9]的酪蛋白平板培養基。1.2儀器與設備

SPX-100-Z型生化培養箱、BSD-WXF1350型振蕩培養箱：上海博訊實業有限公司；S-3000N型掃描電鏡、H-7650型透射電鏡：日本日立公司；A200型基因擴增儀：杭州朗基科學儀器有限公司；RDYSP1Z型核酸電泳儀：北京榮陽經典科技有限公司；GI-1型凝膠成像系統：通寶達成科技（北京）有限公司；752N型紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富集培養與平板分離

稱取10g豆豉，接入200mL富集培養基中，30℃、200r/min條件下振蕩培養16 h。然后將培養液進行梯度稀釋，涂布于平板分離培養基上，30℃培養48 h，觀察平板上是否出現透明圈。挑取菌落周圍有明顯透明圈的菌株，接入細菌斜面培養基，培養24 h后保藏備用。

1.3.2 搖瓶篩選

搖瓶篩選培養基同富集培養基。將上述分離所得的斜面菌種接入搖瓶培養基，每200 mL接入1環菌苔，于30℃、200 r/min的條件下進行振蕩發酵，每隔6 h取樣檢測發酵液中亮氨酸氨肽酶活力，直至72 h。選擇各菌株發酵過程中酶活力最大值進行比較，優選最高產的菌株。

1.3.3 菌種鑒定

對優選菌種進行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，并采用掃描電鏡和投射電鏡觀察菌體形態。參照文獻[11]的方法，對優選菌種進行生理生化特征分析和16S rDNA鑒定。提取菌種的16S rDNA后，采用通用引物（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和5′-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′)進行擴增，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物經純化，送測序公司檢測序列，在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索序列的同源性，利用MEGA5.1軟件以鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹[12]。

1.3.4 碳源和氮源的篩選

以搖瓶篩選培養基為基礎，分別改變培養基的碳源和氮源，進行的發酵產酶試驗。在碳源的篩選中，分別以30 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米淀粉、可溶性淀粉為碳源。在氮源的篩選中，分別以10 g/L的硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、酪蛋白、大豆蛋白為氮源。

1.3.5 發酵條件的優化

按上述優選碳源、氮源的結果配制培養基，分別以28℃、31℃、34℃、37℃、40℃為試驗溫度，在pH7.0和200r/min的條件下進行發酵，優選最佳的溫度。分別以6.0、6.5、7.0、7.5和8.0為試驗的初始pH，在最佳溫度和200 r/min的條件下進行發酵，優選最佳的初始pH。以最佳的溫度和初始pH為前提，分別在50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min和250r/min的條件下進行發酵，根據結果選擇最佳搖瓶轉速。

1.3.6 產酶時間的選擇

在優選的發酵條件下進行發酵，每隔6 h檢測發酵液中的亮氨酸氨肽酶活力，根據酶活力檢測結果確定最佳的產酶時間。

1.3.7 氨肽酶活力的測定

分別配制0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL、8.0 μg/mL的對硝基苯胺溶液，于波長405nm處測定吸光度值，以對硝基苯胺溶液的含量為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。測定前，先分別配制pH8.0、0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液和75 mmol/L的L-亮氨酸-4-硝基苯胺溶液；然后將發酵液置于5000r/min、4℃的條件下離心10min，吸取上清液進行適當稀釋，備用。取兩支試管，每支試管都加入8.6 mL的Tris-HCl緩沖液和0.4 mL的L-亮氨酸-4-硝基苯胺溶液，于40℃水浴預熱10 min，分別將1.0 mL稀釋樣液和1.0 mL蒸餾水加入不同試管，分別作為反應體系和對照體系，再置于40℃水浴中恒溫30 min。反應結束后，在波長405 nm處，以對照體系為空白，測定反應液的吸光度值，根據標準曲線的回歸方程計算反應釋放的4-硝基苯胺質量濃度。氨肽酶活力定義：在40℃條件下，每分鐘水解L-亮氨酸-4-硝基苯胺生成1 μg對硝基苯胺的酶量為1個活力單位，以U/mL表示。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

從平板分離培養基上挑取了56株菌，分別進行搖瓶發酵，結果表明，菌株YBPE-4發酵液中氨肽酶酶活力最高，達1826U/mL，故優選該菌株進行后續的研究。該菌種的菌體革蘭氏染色呈陽性，掃描電鏡（×10 000）和透射電鏡（×3 000）的結果如圖1所示。菌株YBPE-4的生理生化特征如表1所示。經測序分析，該菌種16S rDNA的擴增產物為1 439 bp；在NCBI中進行同源性檢索，以鄰接法構建系統發育樹，如圖2所示。

圖1 菌株YBPE-4的掃描電鏡圖(×10 000)(A)和透射電鏡圖(×3 000)(B)Fig.1 SEM(×10 000)(A)and TEM(×3 000)(B)photographs of strain YBPE-4

由圖1可知，菌體大小約為（1.7～3.6）μm×（0.7～0.8）μm，呈桿狀，周生鞭毛。

表1 菌種YBPE-4的生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YBPE-4

由表1可知，該菌株各生理生化試驗結果與文獻報道的枯草芽孢桿菌一致[13-14]。

圖2 菌種YBPE-4的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YBPE-4

由圖2可知，該序列與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的相似度達99%。與Bacillus subtilisL2HC11（登錄號：QQ861470.1）的親緣關系最近，故被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 碳源對產酶的影響

由圖3可知，以不同營養物質為唯一碳源，氨肽酶產量高低的順序是：玉米淀粉＞可溶性淀粉＞麥芽糖＞蔗糖＞葡萄糖。有文獻報道，培養基如果存在較多容易被利用的碳源，可能直接影響菌種代謝途徑，并可能促使發酵液pH迅速下降，不利于微生物合成蛋白酶。對于試驗所用的碳源，玉米淀粉溶解性差，最難被菌株YBPE-4攝取與利用，反而有利于菌種產氨肽酶，基本與文獻[15]所述的規律一致，故選擇玉米淀粉為最佳碳源。

圖3 不同碳源對產氨肽酶的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on aminopeptidase yield

2.3 氮源對產酶的影響

圖4 不同氮源對產氨肽酶的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on aminopeptidase yield

由圖4可知，酵母粉、酪蛋白、大豆蛋白和蛋白胨等有機氮源，比較適合菌株YBPE-4的氨肽酶發酵，其中酵母粉的產酶量最大，故選擇酵母粉為最佳氮源。

2.4 培養溫度對產酶的影響

圖5 不同培養溫度對產氨肽酶的影響Fig.5 Effect of different culture temperature on aminopeptidase yield

由圖5可知，在試驗溫度范圍內，菌株YBPE-4的酶活隨溫度升高呈現先上升后下降的趨勢，在37℃時的酶活力最大，溫度過低或過高均會影響氨肽酶的合成。故選擇菌種YBPE-4產氨肽酶最適培養溫度為37℃。

2.5 初始pH對產酶的影響

圖6 不同初始pH對產氨肽酶的影響Fig.6 Effect of different initial pH on aminopeptidase yield

由圖6可知，酶活力隨初始pH值升高呈先上升后下降的趨勢，當初始pH值為7.5時，有利于菌株YBPE-4產酶，酶活力達到最高。故選擇菌株YBPE-4產氨肽酶最佳初始pH值為7.5。

2.6 搖瓶轉速對產酶的影響

圖7 不同搖瓶轉速對產氨肽酶的影響Fig.7 Effect of different rotate speed on aminopeptidase yield

由圖7可知，隨著搖瓶轉速的增大，發酵液的酶活力呈上升趨勢。當轉速為200 r/min時，發酵液的酶活力達到最大；繼續增大轉速，酶活力變化不大。故選擇菌種YBPE-4產氨肽酶最佳搖瓶轉速為200 r/min。

2.7 最佳培養時間的選擇

圖8 培養時間對產氨肽酶的影響Fig.8 Effect of culture time on aminopeptidase yield

由圖8可知，發酵液中氨肽酶活力的高峰期主要出現在72 h以后，在產酶時間84 h時酶活力達到最大，此時酶活力為6 164 U/mL；繼續延長時間，酶活力呈下降趨勢。因此，最佳的產酶時間選擇84 h。

3 結論

本研究從豆豉中篩選獲得1株氨肽酶產生菌YBPE-4，該菌種被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。經發酵試驗，確定玉米淀粉、酵母粉分別是菌種YBPE-4產氨肽酶的最佳碳源、氮源，確定產酶的最佳培養溫度為37℃、初始pH值為7.5、轉速為200 r/min、培養時間為84h。在最佳的條件下，發酵液的氨肽酶活力為6164U/mL。菌種YBPE-4具有較強的產氨肽酶能力，但與生產應用有一定差距，仍需從菌種改良、發酵工藝優化等方面進一步提高產酶水平。

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Screening and characteristics of leucine aminopeptidase-producing strain

ZHOU Huiping,LI Jing*,DENG Maocheng,YE Mao,PAN Zhicong(Guangdong Industry Technical Polytechnic,Guangzhou 510300,China)

In order to promote the production and application of aminopeptidase,aminopeptidase-producing strains were screened from Douchi.By Petri dishes and shake flask fermentation screening,an aminopeptidase-producing strain YBPE-4 was obtained and identified asBacillus subtilis. Through fermentation experiments,the corn starch and yeast extract powder were determined as the optimal carbon source and nitrogen source for strain YBPE-4,respectively.The optimal culture temperature,initial pH,rotate speed and culture time for enzyme production were 37℃,7.5,200 r/min and 84 h,respectively.At the optimum conditions,the aminopeptidase activity of fermentation broth reached 6 164 U/ml.

leucine aminopeptidase;screen;identification;fermentation characteristics

TS201.3

0254-5071（2017）02-0098-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.021

2016-09-13

2013年度廣東省高層次人才項目（粵財教2013[246]號）；2016年廣東大學生科技創新培育專項資金（攀登計劃專項資金,pgjh-2016B0561）；廣東輕工職業技術學院創新強校工程專項資金項目（1A20201，2A21205，2A30305）；廣東高校特色調味品工程技術開發中心建設項目（GCZX-B1103）；2013廣東輕工職業技術學院科研啟動(KJ201307)。

周慧娉（1995-），女，大專生，研究方向為生物工程。

*通訊作者：李靜（1974-），女，副教授，博士，研究方向為環境科學、資源綜合利用技術。