桔橙小單孢菌產幾丁質脫乙酰酶的酶學性質研究

王瑤，李永成*

(海南大學食品學院，海南?？?70228）

桔橙小單孢菌產幾丁質脫乙酰酶的酶學性質研究

王瑤，李永成*

(海南大學食品學院，海南?？?70228）

從海邊紅樹林蝦場土壤中篩選的一株產幾丁質脫乙酰酶（CDA）的放線菌桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca），研究其產CDA的酶學性質。結果表明，CDA的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳結果顯示為單一條帶，分子質量為81.8ku。最適pH值為7.0；最適溫度為40℃；Ca2+對此CDA酶活有促進作用，而Cu2+、Zn2+、Mg2+表現出了抑制作用。CDA對蝦殼來源的幾丁質有明顯的脫乙酰效果，紅外光譜測得樣品脫乙酰度由39.03%提高至78.40%。掃描電鏡發現CDA酶解過的幾丁質樣品表面疏松多孔、出現凹槽、晶體消失，進一步印證了該酶的良好脫乙酰效果，也力證了該酶擁有較好的特性。

幾丁質；脫乙酰酶；酶學性質；脫乙酰

幾丁質又稱甲殼素，是一種含氮多糖類物質，廣泛存在于甲殼類（蝦、蟹、昆蟲等）動物的外殼及真菌細胞中。作為目前唯一發現的堿性多糖，幾丁質性質獨特，具有廣泛的生物活性和良好的生物相容性[1]。幾丁質和殼聚糖的差別在于N-脫乙酰度的不同，殼聚糖具有較高的脫乙酰度。不斷的化學改性賦予其更多的功能，其降解后的低聚糖、氨基葡萄糖及各種殼聚糖顯示出更豐富的活性。使得殼聚糖在食品、醫療、紡織等各領域都有廣泛的應用。目前殼聚糖最新應用在抗腫瘤[2]、食品添加助劑[3]、藥物載體[4]、功能性食品[5]等。殼聚糖的制備方法主要是化學法和酶法，但是化學法污染嚴重，酶法卻避免了化學法帶來的污染。

幾丁質脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）可將幾丁質分子中的乙?；苯用撊ド蓺ぞ厶?。目前，對不同來源CDA的報道有很多[6]，如真菌、放線菌、蝸牛消化道等。酶的分離純化[7-9]、酶的特征性質[7-9]、基因序列[9]等也有頗多文獻進行報道。大多數報道也顯示了不同來源的CDA，性質有所不同。

小單孢菌科菌（Micromonosporaceae）是一類分布廣泛且具多種生物活性的稀有放線菌[10]。它不僅能產生慶大霉素、羅沙米星等多種抗菌抗生素還能產生一些具有獨特結構的抗腫瘤抗生素[11]。目前，以放線菌小單孢菌科為來源研究幾丁質脫乙酰酶（CDA）的不多，且小單孢菌是僅次于鏈霉菌的可以產生新型活性物質的重要來源，因此本實驗對桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca）產CDA的酶學性質進行研究，對于以后CDA的應用及工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca），本實驗室從?？跂|寨港紅樹林蝦場土壤中篩選及鑒定，4℃條件下保存；蝦殼來源的幾丁質：北京基尼亞生物技術有限公司。1.1.2培養基

篩選培養基[12]：膠體幾丁質0.25%；K2HPO40.07%；KH2PO40.03%；MgSO40.05%；NaCl 1.0%；對硝基乙酰苯胺0.2%；瓊脂2.0%。

發酵培養基：葡萄糖0.5%；酵母浸膏1.0%；膠體幾丁質0.03%；CaCl20.15%；NaCl 1.0%；pH7.0。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用有限公司；TGL-16M離心機：上海盧湘儀；HZQ-X300C恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；Milipore Labscale切向流超濾系統：美國密理博公司；TENSOR27傅里葉紅外光譜儀：德國布魯克公司；S-3000N 30KV掃描電子顯微鏡：日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠體幾丁質制備[13]

稱取粉碎后的幾丁質0.5 g，加20 mL預冷（4℃）濃HCl，磁力攪拌器攪拌至幾丁質全部溶解（期間控溫超聲20min），加入200mL預冷蒸餾水和體積分數為95%乙醇混合液（1∶1，V/V）中，4℃靜置過夜，次日將懸浮液以8 000 r/min離心10 min，沉淀用蒸餾水洗至中性，4℃保存備用。

1.3.2 酶液的制備

將活化后的橙黃小單孢菌菌株種子液按4%接種量接種于裝液量為100 mL/500 mL的錐形瓶中，30℃、180 r/min培養84 h，過濾后發酵液經過Milipore Labscale切向流超濾系統（＞10 ku）濃縮6倍，備用。

濃縮發酵液經硫酸銨沉、DEAE-纖維素離子層析及Sephadex G-100凝膠層析分離純化，冷凍干燥后的樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳以檢測此幾丁質脫乙酰酶的純度及分子質量。

1.3.3 幾丁質脫乙酰酶(CDA)酶活測定方法[13]

酶活測定方法：10 mL具塞試管中加入1mL 200 mg/L的對硝基乙酰苯胺溶液、3mL 50 mmol/L的pH 7.0磷酸鹽緩沖液，50℃水浴3 min，加入1 mL酶液，50℃水浴15 min，沸水浴終止酶促反應，加水定容至10 mL，若出現渾濁現象，在5 000 r/min條件下離心10 min，在波長400 nm處測定吸光度值?？瞻讓φ战M添加1 mL滅活酶液，其余同上。

酶活的定義：在該反應條件下每小時產生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。

1.3.4 幾丁質脫乙酰酶的酶學性質

pH對CDA酶活的影響：測定CDA在pH4.0～10.0的酶活曲線，確定CDA的最適pH。其中pH4.0～6.0為100mmol/L檸檬酸緩沖液；pH7.0～9.0為100 mmol/L硼酸緩沖液；pH10.0為100 mmol/L碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液。

溫度對酶活的影響：在最適pH條件下測定（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）溫度條件下對酶活的影響，每隔5 min測一次酶活。

金屬離子對酶活的影響：在發酵液中按1%添加量添加Mg2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、K+，測定發酵液的酶活，確定金屬離子對酶活的影響。

1.3.5 幾丁質脫乙酰酶的脫乙酰效果

冷凍干燥后的CDA溶于20 mL蒸餾水中，加0.2 g蝦殼來源的幾丁質底物，40℃，置于水浴鍋中恒溫水浴1 h，后將底物于50℃烘干。將樣品按照大約1∶100的比例與溴化鉀磨粉壓片進項紅外光譜測定，取少許樣品鍍金后進行電鏡掃描。

2 結果與分析

2.1 幾丁質脫乙酰酶的SDS-PAGE檢測

采用SDS-PAGE凝膠電泳測定CDA的純度及分子質量，電泳結果如圖1所示。由圖1可知，粗酶液純化后，蛋白在電泳圖上呈現為單一條帶。根據Marker各條帶的相對遷移率，計算出桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca）來源的幾丁質脫乙酰酶分子質量為81.8 ku。然而報道[9,14]的大多數來源的CDA電泳結果顯示分子質量在50～60 ku之間。80 ku左右分子質量的CDA還少見報道。表明此種來源的CDA顯示了較高的特性。

圖1 幾丁質脫乙酰酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of chitin deacetylase

2.2 pH對CDA酶活的影響[15-16]

由圖2可知，在pH 7.0時CDA有最大酶活27.30 U/mL。這可能與起始培養條件及放線菌特性有關。pH＜7.0時在pH 6.0處酶活最大，為最大酶活的28%；pH＞7.0時，各測定點酶活均高于酸性條件下。因此，桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca）來源的幾丁質脫乙酰酶屬于中性酶，此種來源的CDA酶最適pH值為7.0，在中偏堿性條件下酶活較高，這也為CDA的進一步研究提供依據。

圖2 不同pH對酶活的影響Fig.2 Effects of different pH on enzyme activity

2.3 溫度對酶活的影響

由圖3可知，酶在溫度40～70℃條件下表現了較高的酶活力。40℃條件下，酶活在15 min時出現了一個小高峰，當反應進行到25 min時，酶活達到最大48 U/mL；當反應溫度為70℃時，酶活呈緩慢升高的趨勢，在酶處理時間達到25 min時，酶活達到最大值28 U/mL。當溫度為50℃、60℃時，酶活在15 min時也出現了小高峰。當酶處理時間達到30 min，在各個溫度條件下，酶活都呈現急劇下降的趨勢。然而，報道稱大多數來源的CDA都在50℃表現最佳酶活[17]。甚至在最適溫度下草酸青霉（Penicillium oxalicum）產CDA半衰期達693.10min[9]。更有報道稱其CDA酶活范圍在30～100℃[18]。結果表明，此種來源的CDA酶最適溫度為40℃，并在40～70℃條件下具有較高的活性。

圖3 不同溫度對酶活的影響Fig.3 Effects of different temperature on enzyme activity

2.4 金屬離子對酶活的影響

圖4 不同金屬離子對酶活的影響Fig.4 Effects of different metal ions on enzyme activity

Cu2+、Co2+、Fe2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+對CDA有促進作用，而Mo2+、Zn2+、Pb2+、Bi2+、1 mmol/L的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）對CDA則具有抑制作用[9,19]。由圖4可知，Ca2+對CDA的有明顯的促進作用，Zn2+也有明顯的抑制作用。然而Cu2+、Mg2+卻與報道不同表現出了抑制作用。說明不同來源的CDA有細微的差別[20]。

2.5 CDA的紅外光譜分析[21]

由圖5可知，波數3 453 cm-1對照于殘糖基上的羥基和乙酰氨基；殼聚糖分子的羥基和氨基發生衍生化反應可明顯的發現峰變尖銳。脫乙酰的幾丁質紅外光譜中，波數3 265 cm-1的酰胺譜代被削弱，在波數3 110 cm-1附近出現一個弱的吸收峰；在部分脫乙酰的幾丁質紅外光譜中波數2938cm-1明顯減弱。波數2880cm-1為CH2伸縮振動，變尖銳則表明樣品脫乙酰度較高。波數1000～1100cm-1范圍內的平行譜帶為C—O伸縮振動。

圖5 幾丁質傅里葉紅外光譜圖Fig.5 Fourier transform infrared spectrum of chitin

由圖5b可知，可明顯觀察到3 453 cm-1、2 880 cm-1處峰形變尖銳，且波數3 453 cm-1處峰形變瘦。說明殼聚糖分子的羥基和氨基發生衍生化反應[22]。酰胺譜帶位置1637cm-1、1560cm-1、1310cm-1處吸光度值明顯減弱，且波數1110cm-1處振動明顯增強，說明酶在該條件下對幾丁質有脫乙酰作用。酰胺譜帶Ⅰ在波數1637cm-1、酰胺譜帶Ⅱ在波數1560cm-1、酰胺譜帶Ⅲ在波數1 310 cm-1反應乙酰氨基，其吸收強度與脫乙酰度有直接關系，因此紅外光譜法測定殼聚糖脫乙酰度常用此峰為測定峰。

通過對酰胺譜帶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可能的分析譜帶和波數3 430 cm-1、2 880 cm-1等可能的參比譜帶及2種基線法做脫乙酰度的相關性分析結果，選用波數1 560 cm-1處酰胺譜帶Ⅱ作分析譜帶，波數2 880 cm-1處作參比譜帶；采用峰谷相連的基線作法。按照下式計算幾丁質的脫乙酰度（degree of deacetylation，DD）[23]：

基線法作圖得對照組，A1560/A2880=0.936 8；實驗組，A1560/A2880=0.452 7；計算出對照組DD%=39.03%；實驗組DD=78.40%。

稱取0.1 g對照組幾丁質，用堿量法[22]測得其脫乙酰度為37.02%，誤差＜10%，在允許范圍內，說明紅外法測定脫乙酰度結果有效。則此紅外結果表明Micromonospora aurantiaca產CDA有明顯的脫乙酰效果。

2.6 CDA作用于幾丁質掃描電鏡分析

圖6 幾丁質掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope spectrum of chitin

由圖6a可知，在×4.0 k條件下，39.03%脫乙酰度的對照樣品幾丁質，其緊密結構的表面，有大量細小的晶體纖維，且擁有少量的疏松纖維結構，疏松纖維表面平滑。由圖6b可知，在×4.0 k條件下，78.40%脫乙酰度的幾丁質表面較圖6a更為疏松多孔，且大量的晶體纖維消失。由圖6c可知，×8.0 k條件下，清晰可見酶解后的幾丁質樣品表面出現孔洞，且纖維也變得粗糙不平滑。由此表明，桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca）來源的CDA對蝦殼來源的幾丁質有明顯的脫乙酰效果。

3 結論

通過對桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca）來源的幾丁質脫乙酰酶的研究，發現在中偏堿性條件下酶活性高，最適pH值為7.0，酶的適應溫度范圍為40～70℃，最適酶活溫度為40℃。CDA在pH 7.0，40℃，Ca2+條件下表現了最高酶活48 U/mL。且與蝦殼來源的底物幾丁質結合發現脫乙酰效果明顯，脫乙酰度由39.03%提高到78.40%。一般N-乙?；撊?5%以上時，可稱之為殼聚糖，作為工業品的殼聚糖脫乙酰度＞70%，70%～85%的是中脫乙酰度殼聚糖。實驗結果表明此來源的CDA能零污染的將幾丁質轉化為殼聚糖，有實際應用價值，可對其進行更深入的研究。

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Enzymatic properties of chitin deacetylase fromMicromonospora aurantiaca

WANG Yao，LI Yongcheng*
(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

A chitin deacetylase(CDA)-producing actinomycesMicromonospora aurantiacawas screened from the seaside mangrove shrimp farms soil, and the enzymatic properties of CDA were researched.The results of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) showed that molecular mass of CDA was 81.8 ku for a single band.The optimal pH and temperature were 7.0 and 40℃,respectively.Ca2+had promoting effect on CDA enzyme activity,whereas Cu2+,Zn2+and Mg2+showed inhibitory effect.CDA had obvious deacetylation effect on chitin from shrimp shells.The degree of deacetylation of the sample was increased from 39.03%to 78.40%by infrared spectroscopy.By scanning electron microscope,the surface of chitin samples by CDA hydrolysis became loose,porous,grooves and the crystal disappeared,which further evidenced that the CDA had good deacetylation effect and characteristics.

chitin;deacetylase;enzymatic property;deacetylation

TQ925

0254-5071（2017）02-0102-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.022

2016-11-02

海南省自然科學基金項目(20163065)

王瑤（1992-），女，本科，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：李永成（1968-），男，教授，博士，研究方向為微生物發酵。