響應面分析法優化玫瑰香葡萄醋發酵工藝的研究

陳炳，冷云偉*，權武，莊奎成，萬吉志，劉偉祥

(1.中國礦業大學化工學院，江蘇徐州221116；2.徐州恒順萬通食品釀造公司，江蘇徐州221000；3.天津濱海茶淀葡萄科技發展有限公司，天津300480）

響應面分析法優化玫瑰香葡萄醋發酵工藝的研究

陳炳1，冷云偉1*，權武2，莊奎成3，萬吉志1，劉偉祥3

(1.中國礦業大學化工學院，江蘇徐州221116；2.徐州恒順萬通食品釀造公司，江蘇徐州221000；3.天津濱海茶淀葡萄科技發展有限公司，天津300480）

以玫瑰香葡萄為原料，采用分割補料發酵工藝釀制玫瑰香葡萄醋。通過單因素試驗探究補料酒精度、補料時間、補料體積對玫瑰香葡萄醋發酵工藝的影響，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法優化其發酵工藝。結果表明，玫瑰香葡萄醋的最佳發酵工藝條件為補料酒精度7%vol，補料時間12 h，補料體積分數33%，在此條件下，平均產酸速率為0.32 g/(100 mL·h)。

玫瑰香葡萄醋；響應面分析；分割補料發酵；優化

食醋的由來源遠流長，歷史久遠，相傳是由杜康之子黑塔發明的，其出現和酒有千絲萬縷的聯系，是千百年來勞動人民智慧的結晶[1-3]。在今天，食醋不僅僅是一種簡單的調味品，更是一種保健食品。因為食醋富含氨基酸、維生素和礦物質等，具有緩解疲勞、促進食欲、增強人體免疫力等功能[4]。果醋顧名思義就是水果經過微生物發酵而來的酸味調味品[5-7]，其不僅僅有食醋的酸味，還帶有水果的果香味和甜味，尤以蘋果醋和葡萄醋居多，深受廣大人民群眾喜愛。

從20世紀80年代開始，在傳統食醋的基礎上，結合國外生產技術經驗，國內開始了對果醋的研究[8]。目前主要果醋的果品資源有：蘋果、葡萄、水蜜桃、菠蘿、香蕉等等。但是絕大多數果醋加工技術處于實驗室試驗階段，規模比較小，尤以葡萄醋和蘋果醋居多。按照葡萄醋的發酵狀態可以分為三種發酵工藝：全固態發酵法、全液態發酵法、前液后固發酵法。截至目前，國內葡萄醋生產規模不大，產品宣傳力度不夠，生產工藝不完善，產品質量一般，這些種種原因制約著葡萄醋的發展。

本研究采用液態發酵技術對玫瑰香葡萄醋進行分割補料發酵[9]，在單因素試驗基礎上，利用響應面法對玫瑰香葡萄醋的發酵工藝條件進行優化，以期得到玫瑰香葡萄醋的最佳發酵工藝和質量合格的玫瑰香葡萄醋產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰香葡萄：天津市茶淀葡萄科技園；安琪紅葡萄酒發酵酵母：湖北安琪酵母有限公司；滬釀1.01醋酸菌：上海釀造一廠。

偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、酚酞（均為分析純）：上海蘇懿化學試劑有限公司。酵母菌培養基[10]：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。醋酸菌試管斜面培養基[11]：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%碳酸鈣，2%瓊脂粉。

醋酸菌液體種子培養基：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%碳酸鈣。

1.2 儀器與設備

XFS-280E立式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫用核子儀器有限公司；GNP-9050BS隔水式電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；HYG-A回轉式恒溫搖瓶柜：上海欣蕊自動化設備公司；100 L自吸式發酵罐：徐州恒順萬通食品釀造公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰香葡萄醋的分割補料發酵工藝

（1）玫瑰香葡萄破碎除梗：選取顆粒飽滿質量上乘的玫瑰香葡萄，破碎除梗后備用。

（2）酵母菌的活化：將酵母菌于酵母菌培養基28℃活化培養48 h。

（3）酒精發酵：將0.000 2%酵母菌接種于處理后的葡萄中，添加0.0001%偏重亞硫酸鉀，然后在30℃條件下經過酒精發酵制成玫瑰香葡萄酒，其中主酵期6d，后酵期15d。

（4）調整初始酒精度：按一定比例加入無菌水得到不同酒精度的玫瑰香葡萄酒。

（5）醋酸菌的培養：①種子活化：將醋酸菌于無菌條件下接種到醋酸菌試管斜面培養基上，在30℃條件下培養48 h，備用。②液體種子培養：將試管斜面上生長良好的菌種接種到液體培養基中，于30℃，100 r/min條件下振蕩培養24 h。

（6）醋酸發酵：將玫瑰香葡萄酒的初始酒精度調整為7%vol，然后投料到發酵罐中，接入10%醋酸菌，保持溫度30℃，通風量為1.2 L/min[12]。當發酵進行到一定階段后，每隔一定時間放出一定體積的發酵液，然后補入等體積的玫瑰香葡萄酒，如此反復發酵。

1.3.2 玫瑰香葡萄醋發酵工藝的單因素試驗

選取補料酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol）、補料時間（8 h、10 h、12 h、14 h、16 h）和補料體積分數（24%、27%、30%、33%、36%）3個因素，測定發酵過程中發酵液平均產酸速率的變化。

1.3.3 玫瑰香葡萄醋發酵工藝的響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法對玫瑰香葡萄醋的發酵工藝進行優化。根據Box-Behnken中心組合設計的方法，以補料酒精度（A）、補料時間（B）、補料體積分數（C）為影響因子，玫瑰香葡萄醋發酵液的平均產酸速率（Y）為響應值，設計3因素3水平的響應面試驗，Box-Behnken中心組合設計因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken中心組合設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design

1.3.4 測定方法

酸度測定：采用酸堿滴定法[13]；酒精度測定：采用蒸餾法[14]；感官指標和微生物指標的測定：根據國標GB 18187—2000《釀造食醋》和GB 2719—2003《食醋衛生標準》中的方法進行評定[15-16]；平均產酸速率的測定：取一定玫瑰香葡萄醋發酵時間內發酵液酸度的變化值與時間的比值。

2 結果與分析

2.1 補料酒精度對玫瑰香葡萄醋發酵工藝的影響

圖1 補料酒精度對發酵液平均產酸速率的影響Fig.1 Effect of feeding alcohol content on the average acid production rate of fermented liquid

由圖1可知，隨著補料酒精度的增加，發酵液的平均產酸速率升高。但是當補料酒精度＞7%vol時，發酵液的平均產酸速率降低。這是由于隨著補料酒精度的增加，醋酸菌的營養物質也增加，醋酸菌生長繁殖迅速，因而醋酸菌產酸速率加快；但是當補料酒精度過高時，反而抑制醋酸菌的生長繁殖，產酸能力受到抑制，因而醋酸醋酸菌產酸速率降低。當補料酒精度為7%vol時，醋酸菌平均產酸速率最高，達到0.300g/（100mL·h）。因此，選取6%vol、7%vol、8%vol作為響應面取值范圍。

2.2 補料時間玫瑰香葡萄醋發酵工藝的影響

圖2 補料時間對發酵液平均產酸速率的影響Fig.2 Effect of feeding time on the average acid production rate of fermented liquid

由圖2可知，隨著補料時間的延長，發酵液的平均產酸速率先升高后降低。當補料時間為12 h時，醋酸菌平均產酸速率最高，達到0.313 g/（100 mL·h）。這是因為補料時間過短，發酵液中的酒精利用不充分，因而醋酸菌沒有得到充分的生長繁殖，產酸能力弱；補料時間過長，發酵液中的酒精被消耗殆盡，有害代謝物開始積累，醋酸菌出現死亡現象。因此，選取10 h、12 h、14 h為響應面的取值范圍。2.3補料體積分數對玫瑰香葡萄醋發酵工藝的影響

圖3 補料體積分數對發酵液平均產酸速率的影響Fig.3 Effect of feeding volume fraction on the average acid production rate of fermented liquid

由圖3可知，隨著補料體積分數的增加，發酵液的平均產酸速率也增加。當補料體積分數為33%時，其平均產酸速率最快，為0.317 g/（100 mL·h）。當補料體積分數再增加時，發酵液的平均產酸速率反而下降。這是由于隨著補料體積分數的增加，醋酸菌可以利用的營養物質更加豐富，因而醋酸菌的產酸能力加強；但是補料體積分數過高，放料放出的醋酸菌也變多，前后物料的差異也變大，因而醋酸菌的生長繁殖受到抑制。從實際生產考慮，當補料體積分數增加時，也變相提高了設備利用率，提高生產速度。因此，選取30%、33%、36%為響應面的取值范圍。

2.4 響應面結果分析

2.4.1 響應面模型的建立及顯著性分析

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

利用Design Expert 8.05b軟件設計3因素3水平的響應面試驗，響應面試驗設計及結果如表2所示。

利用Design Expert 8.05b軟件對表2的數據進行多元回歸擬合，對響應值進行回歸分析后建立玫瑰香葡萄醋發酵工藝的參數回歸模型，回歸方程為：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

為了對玫瑰香葡萄醋發酵工藝的參數回歸模型的可靠性進行驗證，對回歸方程進行方差分析，結果如表3所示。由表3可知，模型極顯著（P＜0.001），失擬值不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程的擬合效果好，試驗設計方案具有可操作性。二次項A2、B2、C2極顯著，說明對響應值有極顯著影響。A、B、C三個因素對響應值的影響效果大小為：C＞B＞A。R2=0.998 4＞0.9，說明此模型具有可靠性，R2adj=0.996 3，說明此模型可以解釋大約99.63%響應值的變化，因此回歸方程的擬合程度較好。該回歸方程變異系數（coefficient of variation，CV）為0.98%，在可以接受的范圍之內。所以試驗結果與預測值之間具有良好的擬合度，可以用此參數回歸模型來對玫瑰香葡萄醋的發酵過程進行分析和預測。

2.4.2 響應面及等高線分析

由圖4可知，隨著補料時間的延長，補料酒精度呈現先增加后減少的趨勢；隨著補料酒精度的增加，補料體積分數呈現先增大后減小的趨勢；隨著補料體積分數的增大，補料時間呈現先增加后減小的趨勢。為了進一步確定最佳響應值的因素水平組合，采用Design Expert 8.05b軟件進行優化分析，得到3個單因素的最佳組合：補料酒精度為7.01%，補料時間為11.98 h，補料體積分數為32.93%，此時，最佳響應值平均產酸速率為0.322 g/（100 mL·h）。

圖4 補料酒精度、補料時間和補料體積分數的交互作用對平均產酸速率影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between feeding alcohol content,feeding time and volume fraction on the average acid production rate

鑒于在實際生產中操作的可行性，最終把玫瑰香葡萄醋發酵工藝的參數修正為：補料酒精度為7%vol，補料時間為12 h，補料體積分數為33%，在此條件下進行三次驗證試驗，最后得到的平均產酸速率為0.324 g/（100 mL·h），與理論預測值相差較小，因此，應用響應面分析法建立的玫瑰香葡萄醋發酵工藝模型的參數是可行的。

2.5 玫瑰香葡萄醋的感官指標和微生物指標

參照國標GB 18187—2000《釀造食醋》和國標GB 2719—2003《食醋衛生標準》的要求，對在最優工藝條件下釀造所得的玫瑰香葡萄醋進行感官評價和微生物指標測定，結果表明，玫瑰香葡萄醋澄清無雜質，粉紅色，酸味柔和無異味，具有玫瑰香葡萄的果香味和醋香味，菌落總數、大腸桿菌和致病菌未檢測出。所釀造的玫瑰香葡萄醋感官和微生物指標均符合國家標準。

3 結論

本研究以玫瑰香葡萄為原料釀造葡萄醋，采用單因素試驗和響應面分析法優化玫瑰香葡萄醋的發酵工藝，得出最佳工藝參數為：補料酒精度7%vol，補料時間為12 h，補料體積分數為33%，此時平均產酸速率為0.324g/（100mL·h），其感官指標和微生物指標都符合國家標準。

通過對玫瑰香葡萄醋發酵工藝的研究，探索不同發酵條件對發酵進程的影響，為以后葡萄醋的研究奠定扎實的理論基礎，同時變相延長了葡萄的儲存方式和時間，深化了葡萄的利用價值，延長了葡萄的加工產業鏈。

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Optimization of fermentation process of muscat grape vinegar by response surface methodology

CHEN Bing1,LENG Yunwei1*,QUAN Wu2,ZHUANG Kuicheng3,WAN Jizhi1,LIU Weixiang3
(1.School of Chemical Engineering&Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China; 2.Xuzhou Hengshun Wantong Food Brewing Company,Xuzhou 221000,China;3.Tianjin Binhai Chadian Grape Technology Development Co.,Ltd.,Tianjin 300480,China)

Using muscat grape as raw material,muscat grape vinegar was produced by segmentation feeding fermentation.The effects of feeding alcohol content,feeding time and volume on fermentation process of the muscat grape vinegar were researched by single factor experiment.Response surface methodology was used to optimize the fermentation process based on single factor experiment.The results showed that the optimum conditions were as follows：feeding alcohol content 7%vol,feeding time 12 h and volume fraction 33%.Under the conditions,the average acid production rate was 0.32 g/(100 ml·h).

muscat grape vinegar;response surface analysis;segmentation feeding fermentation;optimization

TS264.22

0254-5071（2017）02-0111-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.024

2016-11-24

蘇北科技專項（BN2016038）

陳炳（1992-），男，碩士研究生，研究方向為微生物發酵。

*通訊作者：冷云偉（1965-），男，副教授，碩士，研究方向為微生物發酵。