食醋中有害微生物的分離與鑒定

曹晉宜，趙紅年，趙凌雁，惠美星

(山西梁汾醋業有限公司，山西太原030032）

食醋中有害微生物的分離與鑒定

曹晉宜，趙紅年，趙凌雁，惠美星

(山西梁汾醋業有限公司，山西太原030032）

該研究對發粘食醋與正常食醋中感官指標、理化指標、香氣組成進行了對比分析，采用傳統培養與16S rDNA序列同源性分析方法對食醋中的有害微生物進行了分離鑒定，同時采用微生物宏基因組分類測序的方法對發粘食醋中的微生物群落結構進行了初步地分析。結果表明，發粘食醋中總酸、乳酸、乙醇含量明顯上升，還原糖、總酯、糠醛含量明顯下降；引起食醋發粘的微生物主要是乳酸桿菌屬中牛痘乳桿菌（Lactobacillusvaccinostercus）。

食醋；宏基因組分析；分離鑒定；牛痘乳桿菌

食醋是富有營養的酸味調味品，不僅有酸味，而且還有一定的鮮味、甜味和香氣。這種色香味的來源，主要是由原料中的營養物質經微生物分解利用產生的，食醋發酵就是這些微生物參與并協同作用的結果。因此，微生物在食醋發酵的過程中發揮了非常重要的作用。但是，近年來發生在食醋行業微生物污染的事件越來越嚴重，其中食醋返渾、脹壺、發粘等現象嚴重制約了傳統食醋行業的發展。已有文獻報道，從污染的食醋中分離出芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、棒桿菌屬（Corynebacteriumsp.）、短桿菌屬（Brevibacteriumsp.）、葡糖桿菌屬（Gluconobactersp.）、耐酸乳桿菌（Lactobacillusacetotolerans）等[1-3]。食醋經微生物污染后往往出現渾濁、顏色變淺、產氣、沉淀、產品異味等現象。

傳統食醋行業對釀造過程中的微生物研究主要采用傳統培養的方法進行研究，但作為傳統開放性的發酵環境，大多數環境微生物對培養的條件較為苛刻，用傳統培養的方法能分離出來的微生物僅占環境樣品的1%～10%[4]。因此，近年來分子生物學方法在食醋釀造產業中的應用越來越多，隨著高通量測序技術的快速發展，宏基因組學技術的出現，通過對樣品中微生物基因序列進行分析，可快速確定其中微生物的種類和豐度[5-6]。

針對目前市場上出現的食醋發粘現象，本研究通過對比正常食醋與發粘食醋樣品的感官指標、理化指標及香氣成分指標，分離出可能引起食醋發粘的有害微生物，并通過微生物宏基因組分類測序的方法對發粘食醋樣品中的微生物種類及相對含量進行了分析，以期為食醋行業預防和控制此類污染提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常食醋（編號000）、發粘食醋（編號001）：市售食醋。

M17培養基：大豆蛋白胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，蛋白胨5.0 g，抗壞血酸0.5 g，牛肉浸膏2.5 g，β-甘油磷酸二鈉19 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2±0.2。

大豆蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物有限責任公司；β-甘油磷酸二鈉（分析純）：東京化成工業株式會社；MgSO4·7H2O（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸（分析純）：天津市申泰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S型分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PHS-3C型數顯酸度計：上海儀電科學股份有限公司；DH-500A型電熱恒溫培養箱：北京中興偉業儀器有限公司；UV5100型分光光度計：上海元析儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀、7890B型氣相色譜儀、HP-INNOWAX毛細管色譜分析柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-21型電泳槽：北京市六一儀器廠；Q32866型Qubit□2.0熒光計：美國英杰生命技術有限公司；T100TM Thermal Cyeler型聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司；75 μ m Carboxen/PDMS型頂空固相微萃取裝置。

1.3 方法

1.3.1 食醋樣品感官指標的對比

[7]中的方法對兩個食醋樣品的色澤、香氣、體態進行了對比。

1.3.2 食醋樣品理化指標的測定

參考文獻[7-8]中的方法對食醋樣品的pH、總酸、氨基酸態氮、不揮發酸、還原糖、總酯、總固形物等理化指標進行檢測。乳酸含量的測定：采用高效液相色譜法[9-10]。

1.3.3 食醋樣品香氣成分的測定[11-12]

采用頂空固相微萃取結合氣相色譜儀對食醋樣品中香氣成分進行測定。

1.3.4 發粘醋樣中微生物宏基因組分類測序分析

醋樣灌裝之前都是經過滅菌的，均符合國家標準，正常食醋中微生物基本檢不出，因此該部分只對發粘食醋樣品進行分析。

（1）食醋樣品中微生物基因組提取

基因組DNA提取步驟參照文獻[13]中的方法進行。

（2）PCR擴增

PCR所用的引物融合了Miseq測序平臺的V3～V4通用引物，341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG；805Ry引物：GAC TGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHV GGGTATCTAATCC；50 μL PCR反應體系包括：10×PCR buffer 5 μL；脫氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）（10mmol/Leach）0.5μL；基因組DNA10ng；Bar-PCR引物F（50μmol/L）0.5μL；引物R（50μmol/L）0.5μL；PlantiumTaq（5 U/μL）0.5 μL；補H2O至50 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s，5個循環；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，20個循環；最后72℃延伸5 min。

第二輪擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，50 μL PCR反應體系包括：10×PCR buffer 5 μL；dNTP（10 mmol/L each）0.5 μL；DNA 20 ng；引物F（50 μmol/L）0.5 μL； Primer R（50 μmol/L）0.5 μL；引物Taq（5 U/μL）0.5 μL；補H2O至50 μL。PCR反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，5個循環；最后72℃延伸5 min[14]。

（3）瓊脂糖凝膠電泳及膠回收

將上述PCR產物采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）的方法進行膠回收，并采用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

（4）宏基因組分類測序分析[15]

利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，然后進行宏基因組分類測序分析。

將發粘食醋樣品中微生物的總DNA進行測序，去除預處理后序列中非擴增區域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并去除序列中的嵌合體，然后對剩余的序列進行聚類，后根據序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（operation taxonomic unit，OTU），本研究采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似度水平的OTU代表序列進行分類學分析，統計樣品的菌落組成。

1.3.5 發粘食醋樣品中微生物的分離純化及鑒定

根據宏基因組分析結果，針對性地采用乳酸菌選擇性培養基M17對發粘食醋樣品中的微生物進行分離純化，將樣品進行梯度稀釋后涂布到平板培養基上，37℃條件下靜置培養48 h，挑取單菌落進行純化，并通過顯微觀察菌落顏色、形態、邊緣、表面等菌落特征。

（1）DNA提取

基因組DNA提取步驟參照文獻[13]中的方法進行。

（2）PCR擴增

以提取出的醋樣細菌基因組DNA為模板，采用引物R-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和R-R（5′-GGC TGCTGGCACGTAGTTAG-3′）進行特異性擴增，擴增產物長度約為500bp。25μLPCR反應體系包括：10×PCRbuffer 2.5 μL；dNTP（10 mmol/Leach）0.5 μL；基因組DNA 4 ng；引物R-F（10μmol/L）1.25μL；引物R-R（10μmol/L）1.25μL；MgCl2（50mmol/L）0.75μL；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.1μL；補H2O至25μL。PCR反應程序：94℃預變性4min，94℃變性60 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環；最后72℃延伸5 min。

（3）目的條帶測序

將上述PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的條帶切膠回收，回收的PCR產物送至上海生工生物北京測序部測序，然后進行比對分析。

1.3.6 污染菌回接醋實驗

將分離得到的潛在污染菌接種至無菌的正常食醋中，37℃培養5～7 d，觀察醋樣的情況。

2 結果與分析

2.1 食醋樣品感官指標分析

正常食醋為紅棕色、有光澤，體態均一，澄清透亮，且具有食醋特有的香氣。發粘醋樣品在污染前期醋體顏色變淺變黃，產氣現象較為嚴重，尤其是在晃動后醋體中的氣泡會出現急劇上升，且醋體的流動性較差，有異味，污染后期底部會出現大量沉淀。

2.2 食醋樣品理化指標分析

將正常食醋和發粘食醋樣品進行理化檢測分析，結果見表1。由表1可知，與正常食醋樣品相比，發粘食醋pH值降低；還原糖和總酯含量明顯下降；總酸、不揮發酸、乳酸含量明顯上升；總固形物略有上升；氨基酸態氮含量變化幅度不明顯。

微生物污染食醋后，將食醋中的還原糖作為碳源大量消耗并代謝產酸，其中尤以乳酸的提高尤為突出，乳酸含量較正常醋樣提高了1.5倍之多。食醋發粘后其還原糖降低了75%以上；不揮發酸的含量提高了90%以上。同時隨著食醋的變質發粘，食醋的總酯含量明顯降低（下降了52%）。

表1 食醋樣品理化指標測定結果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of vinegar simples

2.3 食醋樣品中香氣成分分析

表2 食醋樣品中香氣組分分析結果Table 2 Analysis result of the aroma components of vinegar simples

采用氣相色譜法對正常食醋和發粘食醋中主要香氣成分進行對比分析，結果見表2。由表2可知發粘食醋中的乙醇含量大幅度上升，提高了3倍之多；糠醛含量從初始正常醋樣的35.35%降低至0.20%尤其突出，其他成分苯甲醛、苯乙醇也明顯降低，引起食醋香氣成分的明顯變化，失去了原有食醋的風味。原因可能是食醋受乳酸桿菌污染后，代謝產生大量的乙醇和乳酸，導致食醋中乙醇含量大幅上升，而糠醛等作為中間代謝產物被消耗。

食醋的香氣成分有酸類、醛類、酯類、醇類、酮類、雜環類物質組成，根據香氣成分貢獻率理論，香氣成分含量高、閾值低的成分很可能是食醋的主要香氣成分。乙酸乙酯、苯乙醇、苯甲醛、糠醛等都是山西老陳醋特征香氣成分，這些特征成分表現為熏香、焦糖香、烘烤香、果香等。發粘食醋中苯甲醛、糠醛含量的降低也是造成其風味較差的原因之一。

2.4 發粘食醋樣品中微生物宏基因組分類測序分析

樣品經過微生物宏基因組分類測序分析，得出的樣本數據信息見表3。樣本中微生物群落的分類學情況結果如表4所示。

表3 樣本數據信息統計Table 3 Data statistics of the sample

表4 發粘食醋樣品菌群分布Table 4 Microbiome distribution of sticky vinegar

由表4可知，發粘醋樣中微生物群落主要集中在厚壁菌門和變形菌門上，其中屬厚壁菌門的微生物占該微生物群落的99.24%；屬變形菌門的微生物占該微生物群落的0.44%。發粘醋樣中微生物最主要的是乳酸桿菌屬（Lactobacillus），占總比例的94.21%；其次是片球菌屬（Paralactobacillus），占總比例的3.11%；韋榮球菌科（Paralactobacillus）占總比例的1.03%。發粘醋樣中微生物群落多樣性不高，群落分布不均勻，優勢菌群為乳酸桿菌屬。

2.5 發粘食醋樣品中主要微生物的分離與鑒定

2.5.1 分離菌株的形態特征

圖1 發粘食醋樣品中分離細菌菌落形態（A）及菌體形態（B）Fig.1 Colonial(A)and mycelial(B)morphology of strain isolated from sticky vinegar sample

根據宏基因組分析結果顯示，發粘食醋中主要微生物為乳酸桿菌，因此采用乳酸菌選擇性培養基M17培養基進行分離純化，通過顯微鏡觀察菌落及菌體形態特征，結果見圖1。

由圖1可知，菌落在M17培養基表面形成直徑約5 mm的圓形菌落，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，且刮起時菌落具有一定的粘稠性。菌體形態為單個或對生的短桿菌，革蘭氏染色呈陽性。

2.5.2 分離菌株的分子生物學鑒定

對分離得到的菌株基因組DNA進行16S rDNA PCR擴增，擴增產物電泳結果見圖2。

圖2 分離菌株擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of amplification products of isolated strain

由圖2可知，分離得到的菌株基因片段大小約為500bp，將擴增序列進行測序后，在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上進行BLAST比對，通過同源性分析顯示該序列與牛痘乳桿菌（Lactobacillus vaccinostercusDSM 20634 NODE_48, NZ_AYYY01000028）相似度為97%，因此，初步認為分離得到的菌株為牛痘乳桿菌（Lactobacillus vaccinostercus）。2.6污染菌回接實驗

為了進一步證明，分離得到的潛在污染菌能夠引起食醋發粘，將上述分離得到的菌株進行純培養后接種到正常食醋中培養。結果證明，牛痘乳桿菌的接入能夠引起食醋變質發粘，使醋體顏色變淺變黃、產氣、晃動后氣泡急劇上升，造成醋體的流動性較差，有異味。因此，可以認定牛痘乳桿菌是引起食醋變質發粘的微生物。

3 結論

本研究對發粘食醋與正常食醋感官指標、理化指標、香氣成分指標行了對比分析，同時通過微生物宏基因組分類測序的方法對發粘食醋微生物群落結構進行了分析，得出造成食醋拉絲發粘的微生物主要為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其次是片球菌屬（Paralactobacillus）、韋榮球菌科（Paralactobacillus）。在此基礎上，采用傳統培養方法與分子生物學方法對分離得到的菌株進行了鑒定，結果表明引起食醋發粘變質的主要微生物為牛痘乳桿菌（Lactobacillus vaccinostercus）。該類微生物污染食醋后，能夠利用食醋中的營養成分進行生長代謝，以還原糖為碳源進行二次發酵，產生大量的乳酸、乙醇等，并造成食醋脹氣、返渾、異味、發粘等現象，使得食醋風味變差。但片球菌屬與韋榮球菌科在該類污染中是否起到關鍵的作用及作用機制還需做進一步的研究。

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Isolation and identification of harmful microorganism from vinegar

CAO Jinyi,ZHAO Hongnian,ZHAO Lingyan,HUI Meixing
(Shanxi Liang Fen Vinegar Indusyry Co.,Ltd.,Taiyuan 030032,China)

The sensory indexes,physicochemical indexes and aroma components in sticky vinegar and normal vinegar were contrasted and analyzed. The harmful microorganism in vinegar was isolated and identified by traditional culture method and 16S rDNA sequence homology analysis. Meanwhile,the microbial community structure in vinegar was preliminarily analyzed by microbial metagenomics classification sequencing method. The results showed that the contents of total acids,lactic acid and ethanol were significantly increased,and the contents of reducing sugar,total esters and furfuralwere obviouslydecreased in the stickyvinegar.The main microorganismwhich caused the vinegar stickywasLactobacillusvaccinostercus.

vinegar;metagenomic analysis;isolation and identification;Lactobacillus vaccinostercus

Q393

0254-5071（2017）02-0115-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.025

2016-09-01

山西梁汾醋業有限公司專項基金（2015-03）

曹晉宜(1984-)，女，工程師，碩士，研究方向為微生物發酵。