CEA迷你肽表位基因疫苗誘導小鼠抗腫瘤免疫的研究①

魏海峰 譚 巖 李 丹 劉 磊 米旭光 李首慶 方艷秋

(吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春130021)

CEA迷你肽表位基因疫苗誘導小鼠抗腫瘤免疫的研究①

魏海峰 譚 巖 李 丹②劉 磊 米旭光 李首慶 方艷秋

(吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春130021)

目的：利用含有CEA625-667基因的單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667免疫小鼠后，觀察其誘導的抗腫瘤免疫效應。方法：采用4～6周純系BALB/c小鼠，肌肉注射法分pc-DNA3.0、pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667三組免疫小鼠，對其激發的機體特異性及非特異性免疫反應進行研究。流式細胞術檢測免疫小鼠脾細胞的T細胞亞群和CD4+/CD8+比值；3H-TdR 摻入法檢測免疫小鼠的特異性淋巴細胞增殖；Western blot雜交及ELISA法檢測免疫小鼠血清中的CEA特異性抗體；ELISA法檢測免疫動物脾細胞體外誘導IFN-γ、IL-4、GM-CSF的分泌水平。結果：實驗組與對照組的CD4+/CD8+比值差異無統計學意義；經過基因疫苗免疫的小鼠與天然小鼠相比，其脾細胞在體外與短肽共孵育之后，會在更短的時間內出現更明顯的細胞增殖；免疫了CEA迷你基因串聯體腫瘤疫苗的小鼠血清中可以產生低滴度的抗體，提示HTL的活化；免疫小鼠脾細胞上清中IFN-γ的含量明顯高于對照組，而pc-DNA3.0,pcDNA-CEA625-667,pcDNA-triCEA625-667各組IL-4的含量均很低，差異無統計學意義；迷你基因三倍體疫苗所引發的增殖效應以及釋放細胞因子的水平均高于迷你基因一倍體，說明我們所采用將目的基因多倍串聯的抗原改造的方式起到了增強免疫效應的作用。結論：CEA迷你肽表位基因單倍體及三倍體疫苗均不能顯著改變動物體內CD4/CD8比值，但均能誘導HTL活化，使被免疫機體T細胞趨向于Th1效應且三倍體疫苗的免疫原性強于單倍體疫苗。

癌胚抗原；迷你基因；基因疫苗；腫瘤生物治療

癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)作為腫瘤相關抗原，因其在正常組織中極有限的表達，以及廣泛出現在上皮源性腫瘤細胞的過量表達而成為腫瘤生物治療研究的熱點[1,2]。目前以CEA為基礎的腫瘤生物治療分為主動免疫和被動免疫治療，主動免疫主要指DNA疫苗，被動免疫包括多肽疫苗和抗體治療。其中DNA疫苗因其具有良好的安全性，且作用持久、設計簡便、產量大、較經濟等特點而備受研究者關注[3]。本研究組前期成功構建了含有CEA625-667基因單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667。本次實驗擬將此重組DNA疫苗免疫小鼠，對其激發的體液免疫和細胞免疫進行研究。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 重組真核表達質粒pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667(本室制備并保存)；FITC標記的羊抗鼠單克隆抗體、生物素標記的馬抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標記親和素(北京鼎國生物公司)；小鼠IFN-γ ELISA試劑盒、小鼠白介素-4 ELISA試劑盒、小鼠單核-巨噬細胞克隆刺激因子ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IMDM培養基(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibcobrl公司)；3H-TdR(3H-胸腺嘧啶，中國原子能研究所)；雙色熒光抗體FITC(異硫氰酸熒光素)和PE(藻紅蛋白)標記的羊抗鼠單克隆抗體CD3/CD4、CD3/CD8(深圳達科為生物技術有限公司)；6～8周齡雄性BALB/c小鼠購自吉林大學基礎醫學院動物室。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和免疫 4～6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為3組，每組6只：pcDNA3.0組； pcDNA-CEA625-667組；pcDNA-triCEA625-667組。肌肉注射法免疫動物。濃度為0.95 μg/μl的質粒與終濃度3%氫氧化鋁膠懸液1∶1(V∶V)混合，每只小鼠每次接種100 μg質粒(溶于0.1 ml氫氧化鋁膠中與質?；旌虾罂傮w積0.2 ml)。分兩側注射與小鼠大腿內側肌群，每隔10 d免疫1次，共免疫4次。

1.2.2 收集免疫動物血清 最后一次免疫后10 d，取小鼠眼血，37℃放置30 min，1 000 r/min離心10 min，取上清-20℃保存。

1.2.3 免疫動物脾細胞的收集 最后一次免疫后10 d，斷頸處死小鼠，無菌取脾。將脾浸入含10%小牛血清的IMDM細胞培養液中，輕輕研磨，紗布過濾后用玻璃試管收集脾細胞。離心、破紅、重懸、洗滌后并進行細胞計數。根據細胞計數結果，用一定體積的完全細胞培養液混懸細胞，使濃度為1×107ml-1。

1.2.4 小鼠T細胞亞群檢測 各免疫組小鼠每個樣本取1×106小鼠脾細胞加入管內，用0.1 mol/L、pH7.0 PBS洗滌2次，分別加入熒光標記抗體10 μl，振蕩混勻后室溫避光作用20 min。用PBS洗2次后，再加入0.5 ml PBS混勻，上機檢測CD3、CD4、CD8陽性表達率。

1.2.5 Western blot檢測免疫動物血清中的CEA625-667抗體 取10 μl濃度為0.95 mg/ml的純化短肽CEA625-667行SDS-PAGE電泳，利用半干式轉移電泳儀將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜，進行Western blot，一抗為各免疫組小鼠的1∶100稀釋血清。

1.2.6 ELISA方法檢測免疫動物脾細胞上清中IFN-γ、IL-4、GM-CSF的含量 各免疫組小鼠每個樣本設2復孔，各取脾細胞1×106孔-1，加入96孔板，事先每孔中加入終濃度為10 μg/ml的CEA625-667短肽(對照孔中不加)，并用IMDM完全培養基，將每孔總體積調為200 μl，置37℃ 5%CO2培養箱中培養72 h后，收集細胞培養上清，置-70℃冰箱中保存待測。IFN-γ、IL-4、GM-CSF的ELISA檢測方法按試劑盒說明進行操作。

1.2.73H-TdR摻入法檢測免疫動物特異性淋巴細胞增殖水平 各免疫組小鼠每個樣本設3復孔，各取脾細胞1×106孔，加入96孔板，事先每孔中加入終濃度為10 μg/ml的CEA625-667短肽(對照孔中不加)，并用IMDM完全培養基，將每孔總體積調為200 μl，置37℃ 5%CO2培養箱中培養96 h后，加入3H-TdR 1.0 Ci/孔，再培養16 h，用多頭細胞收集儀將細胞收集于玻璃纖維濾紙上，烤干后將濾紙放入閃爍杯中，液閃儀計數。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計學軟件進行統計學分析。數據經方差齊性檢驗，若方差齊則采用樣本均數比較的方差檢驗(LSD-t檢驗)；若方差不齊則采用非參數檢驗(秩和檢驗)，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫小鼠T細胞亞群檢測結果 pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667組和空質粒pc-DNA3.0組免疫小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T細胞數和CD4+/CD8+值比較差異均無統計學，見表1。

2.2 免疫小鼠血清中CEA625-667抗體的Western blot檢測結果 空質粒對照組在6.7 kD處未見陽性蛋白帶，pcDNA-CEA625-667和pcDNA-triCEA625-667免疫組血清在1∶500稀釋度下，與重組CEA短肽結合，在6.9 kD處可見陽性蛋白帶,見圖1。

2.3 免疫小鼠脾細胞體外誘導細胞因子的分泌 免疫小鼠脾細胞在體外用CEA短肽刺激72 h后，檢測IFN-γ、GM-CSF及IL-4的分泌，結果見表2。CEA短肽刺激可明顯誘導釋放IFN-γ及GM-CSF的水平升高，與不用CEA短肽刺激組相比，差異具有統計學意義(P<0.001)。免疫小鼠脾細胞上清中IFN-γ的含量明顯高于對照組(P<0.001)，pcDNA-triCEA625-667誘導釋放IFN-γ的水平均高于pcDNA-CEA625-667，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。小鼠脾細胞培養上清中GM-CSF的含量在pc-DNA3.0、pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667組測量值依次增高，但差異無統計學意義。所有實驗組和對照組均未檢測到IL-4分泌。

2.4 免疫動物的特異性淋巴細胞增殖水平 末次免疫后10 d，取免疫組小鼠脾細胞與10 μmol/L CEA625-667短肽共孵育96 h后，測細胞增殖。淋巴細胞增殖反應結果見表3。經統計學分析，各實驗組間差異有顯著統計學意義。

GroupsCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+pcDNA-3.052.25±3.0524.57±2.4112.44±3.032.05±0.31pcDNA-CEA625-66753.01±3.7823.45±4.2811.18±3.352.18±0.30pcDNA-triCEA625-66758.72±3.2125.87±3.3114.28±3.501.87±0.24

GroupsConcentrationofIFN-γ(pg/ml)WithpeptideNopeptideConcentrationofGM-CSF(pg/ml)WithpeptideNopeptidepcDNA-3.053.33±6.5265.00±8.25198.50±16.871)23.83±5.05pcDNA-CEA625-667 213.17±13.251)2)147.24±6.79228.17±12.351)18.67±5.53pcDNA-triCEA625-667 335.17±42.761)2)3)190.53±4.98240.67±13.981)15.83±5.21

Note：1)P<0.001 vs no peptide；2)P<0.001 vs pcDNA-3.0 group； 3)P<0.05 vs pcDNA-CEA625-667group.

圖1 免疫小鼠血清中CEA625-667抗體的Western blot檢測結果Fig.1 Western blot for CEA625-667 hybridized by serum from immuned miceNote: 1.The standard protein marker;2.Recombinant CEA625-667 protein;3.The western blot of pcDNA-3.0 group;4.The Western blot of pcDNA-CEA625-667 group;5.The Western blot of pcDNA-triCEA625-667 group.

GroupsCpmvalueWithpeptideNopeptidepcDNA-3.01590.00±97.281)277.67±74.15pcDNA-CEA625-667 5034.33±178.211)2)239.00±67.60pcDNA-triCEA625-667 7881.67±201.121)2)3)248.33±48.55

Note：1)P<0.001 vs no peptide；2)P<0.001 vs pcDNA-3.0 group；3)P<0.01 vs pcDNA-CEA625-667group.

3 討論

免疫細胞可通過分泌細胞因子或直接接觸，進行細胞間的相互作用，從而對免疫應答進行直接或間接的調節，當機體的免疫系統被某種異種抗原激活后，會表現出CD4+/CD8+比值上升，提示免疫應答的正調節占優勢。在本實驗中疫苗免疫小鼠后，實驗組與對照組的CD4+/CD8+比值無統計學差異，得到這種結果的原因可能是多方面的，以往認為，CD4+T細胞具有調節免疫反應活性，輔助B細胞產生抗體，分泌細胞因子的作用，而CD8+T細胞則有免疫抑制和細胞毒性作用。但目前人們已經確認存在CD4+殺傷性T細胞[4]，因而不能說CD4+T細胞一定發揮上調作用；而且最近研究表明，抑制免疫應答的T細胞亞群確實存在，但這些細胞不是CD8+T細胞，而是CD4+T細胞[5]。CD8+T細胞中也還有一類顯示反抑制活性的細胞，在免疫應答中發揮上調作用[6]。當然，也不能除外我們所構建的以表位為基礎的疫苗無法達到全基因疫苗一樣激活整個免疫系統的免疫效力，或DNA疫苗在體內提呈不完全等情況。

本實驗應用細胞增殖實驗以及抗體和細胞因子的檢測來反映免疫小鼠的HTL效應，經過DNA免疫的小鼠與天然小鼠相比，其脾細胞在體外與短肽共孵育之后，會在更短的時間內出現更明顯的細胞增殖。通過對抗體的檢測，我們發現免疫了CEA迷你基因串聯體腫瘤疫苗的小鼠血清中可以產生低滴度的抗體，進一步證實了CEA迷你肽表位基因疫苗可有效誘導HTL效應，激發機體的特異性免疫。有實驗證明CD4+T細胞的激活需要抗原遞呈細胞通過MHC classⅡ提供抗原表位，其標志性的改變是B細胞分泌抗原表位特異性的IgG抗體[7]。由于Th1/Th2類細胞因子含量體現了Th細胞輔助其他淋巴細胞發揮免疫活性的功能，隨后我們通過對免疫小鼠脾細胞上清中細胞因子的檢測，對Th1/Th2類細胞的活化趨勢做了進一步的探討。實驗結果表示免疫小鼠脾細胞上清中IFN-γ的含量明顯高于對照組，而pc-DNA3.0、pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667各組IL-4的含量均很低，提示了本研究所選用的高親和力Th表位使被免疫機體T細胞趨向于Th1效應。這與Ahlers[8]的實驗結果相吻合，可能是由于高親和力的Th表位可以產生一個更強的CD40L信號傳導來激活樹突狀細胞產生IL-12，而得到一個更加極性化的抗原提呈細胞，這對誘導出能夠產生IFN-γ的CD4+T細胞可能是必要的[9]。

與全序列基因疫苗比較，迷你基因疫苗能夠針對特異性抗原表位誘導免疫反應，而避免了無關抗原表位的影響。本研究結果表明，迷你基因三倍體疫苗所引發的增殖效應以及釋放細胞因子的水平均高于迷你基因一倍體，兩者比較有統計學差異，說明我們所采用的將目的基因多倍串聯的抗原改造方式起到了增強免疫效應的作用。本研究為有關CEA短小目的基因串聯疫苗的研制與臨床前實驗奠定了基礎。

[1] Ahn E,Kim H,Han KT,etal.A loss of antitumor therapeutic activity of CEA DNA vaccines is associated with the lack of tumor cells' antigen presentation to Ag-specific CTLs in a colon cancer model[J].Cancer Lett,2015,356(2):676-685.

[2] Bilusic M,Heery CR,Arlen PM,etal.Phase I trial of a recombinant yeast-CEA vaccine (GI-6207) in adults with metastatic CEA-expressing carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother,2014,63(3):225-234.

[3] Khalili S,Rahbar MR,Dezfulian MH,etal.In silico analyses of Wilms′ tumor protein to designing a novel multi-epitope DNA vaccine against cancer[J].J Theor Biol,2015,379:66-78.

[4] Mi JQ,Manches O,Wang J,etal.Development of autologous cytotoxic CD4+T clones in a human model of B-cell non-Hodgkin follicular lymphoma[J].Br J Haematol,2006,135(3):324-335.

[5] Qiao M,Thornton AM,Shevach EM.CD4(+)CD5(+)regulatory T cellsrender naive CD4(+)CD25(-)T cells anergic and suppressive[J].Immunology,2007,120(4):447-455 .

[6] Wang C,Liu X,Li Z,etal.CD8(+) NK T-like cells regulate the immune response by killing antigen-bearing DCs[J].Sci Rep,2015,5:14124.

[7] Barbosa MD,Celis E.Immunogenicity of protein therapeutics and the interplay between tolerance and antibody responses[J].Drug Discov Today,2007,12(15):674-681.

[8] Ahlers JD,Belyakov IM,Thomas EK,etal.High-affinity T helper epitope induces complementary helper and APC polarization,increased CTL,and protection against viral infection[J].J Clin Invest,2001,108(11):1677-1685.

[9] Ahlers JD,Belyakov IM,Matsui S,etal.Signals delivered through TCR instruct IL-12R expression: IL-12 and TNF-α synergize for IL-12R expression at low antigen dose[J].Int Immunol,2001,13(11):1433-1442.

[收稿2016-12-09]

(編輯 許四平)

Study on antitumor effect of minigene DNA vaccine derived from Carcinoembryonic Antigen (CEA) gene in mice

WEIHai-Feng,TANYan,LIDan,LIULei,MIXu-Guang,LIShou-Qing,FANGYan-Qiu.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To observe the immunological activity of haploid vaccine and three tandem repeats of minigene DNA vaccine derived from Carcinoembryonic Antigen (CEA) gene.Methods: The immunoreaction was induced by intramuscular injection with pc-DNA3.0,pcDNA-CEA625-667and pcDNA-triCEA625-667in BALB/c.Four weeks after injection,the spleen cells and serum were separated respectively from the mice for the in vitro assessment.Changes of the T lymphocytes subset was analyzed by flow cytometry.Lymph proliferation responses were tested by3H-TdR incorporation,IFN-γ，IL-4 and GM-CSF in their cultural supernatants were detected with ELISA and seral IgG antibody against CEA were detected with Western blot and ELISA.Results: The difference of the ratio of CD4+/CD8+of the mice immuned by pc-DNA3.0,pcDNA-CEA625-667or pcDNA-triCEA625-667was not significant.Lymph proliferation responses were more significant in the mice immuned by pcDNA-CEA625-667and pcDNA-triCEA625-667in a shorter time by contrast with na?ve mice.Low tilter IgG antibody against CEA was detected in the antiserum of the mice immuned by repeats of minigene DNA vaccine,which suggested the activation of helper T-cell.ELISA showed that the level of IFNγ in the 3 days culture of the splenocytes was relatively higher in the groups of minigene DNA vaccination than in the control groups,while IL-4 expression was absent in all groups.The immune response level elicited by three tandem repeats of minigene DNA vaccine pcDNA-triCEA625-667was superior to that elicited by pcDNA-CEA625-667,which showed that any immunogenic inadequacies in minigene presentation can be rectified by linking itself in a string-of-beads vaccine.Conclusion: The haploid vaccine and three tandem repeats of minigene DNA vaccine derived from CEA gene both can not change the ratio of CD4+/CD8+but can induce the activation of helper T-cell and skew T cells toward Th1 response.The immune response level elicited by three tandem repeats of minigene DNA vaccine was superior to that elicited by haploid vaccine.

Carcinoembryonic antigen;Minigene;DNA vaccine;Tumor biological therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.014

①本文受吉林省科技廳國際合作項目(20140414043GH)、吉林省科技廳中青年科技創新領軍人才及團隊項目(20140519018JH)、吉林省人社廳省人才開發資金(2016年度)和吉林省科技廳重點實驗室項目(20122113)資助。

魏海峰(1978年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤基礎及臨床研究，E-mail：whfweb@163.com。

及指導教師：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事腫瘤生物治療基礎與臨床研究，E-mail：yq.fang@163.com。

R392 R730.5

A

1000-484X(2017)03-0384-04

②吉林大學第一醫院呼吸內科，長春130021。