肝癌細胞轉移與PI3K-Akt-PAK1通路的相關性研究

張雷，王林，耿智敏，萬永，孟凡迪，孟憲魁

肝癌細胞轉移與PI3K-Akt-PAK1通路的相關性研究

張雷，王林，耿智敏，萬永，孟凡迪，孟憲魁

目的研究肝細胞癌（HCC）組織PI3K/Akt/p21活化蛋白激酶1（PAK1）信號通路的表達對于HCC發生及轉移的重要性，以期為HCC的預防和預后提供一個有效的分子標志，并為HCC的治療提供一定的理論基礎。方法自NCBI中GEO數據庫中的GES364數據集提取數據，對PI3K/Akt/PAK1信號通路基因的表達量進行分析。結果將數據庫中HCC組織分為肝內擴散組（PS）、肝外轉移組（PM）、無轉移組（PN）和正常肝對照組（H）。分析發現PS組和PM組PAK1和MMP-9表達量明顯高于H組和PN組（P＜0.0001）；PS組、PM組和PN組AKT（1/2）和Girdin表達量明顯高于H組（P＜0.05），PS組和PM組AKT2和Girdin表達量也明顯高于PN組（P＜0.05）；在PM組，AKT2與PAK1表達呈正相關（r=0.5679，P=0.0013）。結論PAK1和MMP-9高表達可以促進HCC的擴散和轉移，而AKT的表達和活性對于HCC的轉移也是至關重要的，提示PI3K/AKT/PAK1信號通路與HCC轉移密切相關。

肝細胞癌；轉移；PAK1；AKT

HCC是一種占全球癌癥發病率第五和癌癥致死率第三的常見腫瘤[1]，每年引起大約60萬人死亡[2]。HCC的發生與乙型肝炎（hepatitis B）和丙型肝炎（hepatitis C）病毒感染、肝硬化和黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的攝取等密切相關[3]。然而，HCC發生發展的具體分子機制仍然未被闡明。關于HCC發病機理的研究表明，HCC發生的分子機制存在高度的異質性，一些蛋白在這一過程中所發揮的具體作用仍不清楚[4-6]。盡管有些分子標志，如血管上皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨橋蛋白（osteopontin）和轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等可能參與了HCC的發生，但是大量的臨床和基礎研究表明，現有的分子標志仍不足以精確地預測HCC患者的預后和生存[7]。由于缺乏特異性的靶向治療，晚期HCC患者的預后都很差[8]。p21活化蛋白激酶（p21-activated protein kinases，PAKs）是一種很早就被鑒定的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠被p21 GTPases、GTP-Cdc42和GTP-Rac等活化。每一個PAKs都包含有一個高度保守的氨基末端的Cdc42/Rac結合結構域和一個羧基末端的激酶結構域[9-12]。以往研究表明，PAKs參與多種細胞功能的調節，包括細胞骨架動態、細胞生存、細胞凋亡、激素信號和基因轉錄，并且能夠促進細胞的增殖[13-17]。哺乳動物體內的PAKs家族包含有6個成員，根據其序列、結構和功能的不同可分為兩組，分別為組I（PAK1-3）和組II（PAK4-6）[16，18-20]。眾多研究表明，PAKs家族成員在多種惡性腫瘤中明顯上調，尤其是PAK1在結直腸癌（colorectal cancer，CRC）、乳腺癌（breast cancer）、卵巢癌（ovarian cancer）和HCC中都表現出明顯的上調[21-24]。此外，在CRC腫瘤細胞向淋巴結轉移的過程中，PAK1的表達顯著性增加[21]。在生長因子誘導的乳腺癌的發展和轉移過程中，PAK1也是必需的調節因子[25，26]。PAK1過表達不僅增加卵巢癌細胞的遷移和浸潤[23]，而且在HCC的轉移過程中也發揮重要的作用[24]，而PAK1過表達與多種細胞內信號通路的活化具有密切的關系。

PI3K/Akt信號通路參與包括細胞增殖、細胞分化、細胞運動、腫瘤發生發展和血管生成等在內的多種細胞活動[27，28]。有研究表明，PAK1可以協同PI3K/ Akt信號通路，促進肝癌細胞的增殖和轉移[29]。PI3K/AKT/PAK1信號通路對于乳腺癌的發展也發揮著重要的作用[30]。這些都暗示PI3K/AKT/PAK1信號通路對于HCC的發展和轉移有著重要的作用，但其具體的作用機制仍有待于進一步的研究。本研究通過對數據庫中HCC患者相關基因和信號分子的表達量和相關性的分析，揭示了PI3K/Akt/PAK1信號通路對于HCC發生及轉移的重要性，明確了該信號通路及其部分調控的靶基因對HCC轉移的正向調控作用，以期為HCC的預防和預后預測提供一個有效的分子標志，并為HCC的治療提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料通過NCBI GEO Home入口檢索GSE364數據集關于HCC的相關資料，最近更新時間為2012年2月23日，根據獲得樣本的特性，具體分組信息如表1。

表1 GSE364數據集樣本分組情況

1.2 基因表達量分析基于數據庫特定研究樣本數據集中特定目標基因表達量的相對值進行表達量分析，所有數據都經過對數轉換和中位數中心化處理。根據表達量處理后數據進行聚類和差異分析。文中比較差異分析圖由GraphPad Prism 5軟件制作（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001均表示差異有統計學意義）。

1.3 相關性分析基于數據庫特定研究樣本數據集中特定目標基因表達量的相對值進行相關性分析，所有數據都經過對數轉換和中位數中心化處理。文中相關性分析圖由GraphPad Prism 5軟件制作（P＜0.05表示差異有統計學意義，r＜0表示負相關，r＞0表示正相關）。

2 結果

2.1 PAK1及其相關基因表達分析為了評估PAK1及活性與HCC發生發展的關系，我們選取了PAK1及其下游靶基因MMP-9作為分析對象。據以往的相關研究表明，活化的PAK1可以促進MMP-9的表達，所以MMP-9表達量的增加不僅可以反映肝癌發生發展過程的惡化，同時也可以在一定程度上反映PAK1的活性。據此，我們根據HCC的擴散轉移情況，將NCBI數據庫GSE364數據集中的HCC和正常標本進行分類（表1），然后對分類樣本進行了PAK1和MMP-9的表達分析。結果表明，與正常對照組（H）相比，PAK1在PS、PM和PN中均存在不同程度的高表達（P＜0.0001，P＜0.0001，P=0.0026），與H組相比，MMP-9在PS組和PM組中均存在不同程度的高表達（P＜0.0001，P＜0.0001），而其在PN組中的表達與H組無明顯差異（P=0.6371）。此外，與PN組相比，PAK1和MMP-9在PS組和PM組中均存在不同程度的高表達（P＜0.0001，P＜0.0001），說明在擴散和轉移過程中癌細胞需要PAK1和MMP-9的參與，即PAK1和MMP-9的高表達可以促進HCC的擴散和轉移，這也與以往的一些研究結果相一致。除此之外，與PS組比，PAK1和MMP-9在惡性化程度更高的PM組中也表現為高表達（P＜0.0001，P=0.001），更說明PAK1的表達和活性及MMP-9的表達對于HCC的轉移是至關重要的（圖1）。

圖1 各肝癌組織PAK1及其靶基因MMP-9表達差異比較

2.2 PI3K/AKT及其相關基因的表達量分析據以往的研究，PI3K/AKT信號通路對于HCC患者的發生發展都具有重要作用，而且PAK1也會協同活化PI3K/AKT信號通路以促進肝癌細胞的遷移和浸潤。所以，鑒于上述的研究，為了進一步探究PI3K/AKT信號通路與HCC發生和轉移的相關性，我們選取了AKT（1/2）及其下游靶基因Girdin和FAK作為分析對象。據以往的相關研究，活化的AKT（pAKT）可以促進FAK的活化和Girdin的表達。所以，Girdin表達量的增加不僅可以反映肝癌的發生發展過程的惡化，同時也可以在一定程度上反映AKT的活性。據此，我們對分類樣本中AKT（1/2）、FAK和Girdin表達進行了分析，結果表明，與H組比，PS組、PM組和PN組AKT（1/2）和Girdin存在不同程度的高表達（AKT1：P=0.0005，P=0.0002，P=0.0018；AKT2：P=0.0007，P=0.0008，P= 0.0915；Girdin:P＜0.0001，P＜0.0001，P=0.025），而各組FAK表達量均無明顯的差異，可能是因為即便是對于正常細胞FAK也發揮著重要的作用，所以其表達量相對恒定，體現在HCC轉移過程中信號的增加可能是由于其活性的增強，而非表達量的變化。此外，與PN組比，PS組和PM組AKT2和Girdin存在不同程度的高表達（AKT2:P=0.01，P＜0.0068；Girdin:P＜0.0001，P＜0.0001），說明在擴散和轉移過程中HCC要比無轉移的HCC更需要AKT2和Girdin的參與，即AKT2和Girdin的高表達可以促進HCC的擴散和轉移。除此之外，惡性程度更高的PM組Girdin比PS組有更高的表達（P＜0.0001），也說明Girdin表達和AKT活性對于HCC的轉移是至關重要的（圖2）。

圖2 各組肝癌組織AKT及其相關靶基因表達差異比較

2.3 PI3K/AKT/PAK1信號通路及其靶基因相關性分析在上述的研究中，我們對PAK1及其靶基因MMP-9和AKT，及其后者的靶基因Girdin在各組HCC樣本和正常對照樣本中的表達分別進行了比較分析。為了進一步確定PAK1和AKT激酶的表達量和活性的同步變化，我們對PAK1和AKT2及其各自的靶基因的表達量進行了相關性分析。結果表明，HCC組織AKT2與其靶基因Girdin表達呈明顯的正相關（r=0.6708，P＜0.0001），PAK1與其靶基因MMP-9表達也呈明顯的正相關（r=0.6458，P＜0.0001，圖3）。

圖3 PI3K/AKT/PAK1信號通路及其相關基因的表達相關性分析

2.4 PI3K/AKT/PAK1信號通路與HCC轉移的相關性分析在上述研究中，我們分析了PAK1及其靶基因MMP-9和AKT及其靶基因Girdin在不同HCC樣本和正常對照樣本中的表達，并對其差異進行了比較分析。已有研究表明，PAK1與PI3K/AKT信號通路有協同作用，為了進一步研究其在HCC發生及轉移過程中的作用，我們分析了PM組HCC組織PAK1和PI3K/AKT表達量，結果表明，AKT2與PAK1表達呈正相關（r=0.5679，P=0.0013，圖4），說明PAK1與PI3K/AKT信號通路在HCC轉移過程中是有關聯的，而且這一關聯對于HCC的發展和惡化有著密切的關系，很可能PI3K/AKT/PAK1形成一條正向擴大的信號通路，從而促進早期HCC向惡性的可轉移的方向發展，并影響患者的生存及預后。

圖4 PM組HCC組織AKT2與PAK1表達呈正相關

3 討論

在近十年，對于肝癌發生的分子機制的研究取得了巨大的進展。許多關鍵的信號通路都被證明在HCC發生和發展的過程中發揮著重要的作用，而且這些信號通路相關分子的異常表達以及它們之間的交互作用更是促進了HCC的發展及惡化，尤其是PI3K/AKT/PAK1信號通路在此過程中的作用越來越受到人們的關注。

研究表明，在HepG2肝癌細胞敲除PAK1會導致pERK和pAKT表達量減少[31，32]，結合本研究中PAK1和AKT的相關性分析表明，在HCC組織PAK1不僅可以增加AKT的磷酸化水平，促使其活化，而且還有可能促進AKT表達量的增加，這樣使得PI3K/AKT信號通路進一步活化，進而促進腫瘤的發展和轉移。

我們的研究分析表明，與H組比，PS組、PM組和PN組PAK1存在不同程度的高表達，PS組和PM組MMP-9也存在不同程度的高表達，與PN組比，PS組和PM組PAK1和MMP-9均存在高表達。與PS組比，惡性化程度更高的PM組PAK1和MMP-9也表現為高表達，這些結果說明PAK1和MMP-9高表達可以促進HCC的擴散和轉移，也進一步說明了PAK1表達和活性對于HCC的轉移是至關重要的。鑒于此，我們也對PI3K/AKT信號通路及其相關基因的表達水平進行了分析，其結果與PAK1相似，說明癌細胞在擴散和轉移過程中，需要AKT2和Girdin的參與。與PS組比，PM組Girdin呈高表達，也說明Girdin的表達和AKT的活性對于HCC的轉移是至關重要的。最后，通過對PI3K/AKT信號通路和PAK1在HCC轉移樣本中的相關性分析，我們發現，PAK1與PI3K/AKT信號通路在HCC轉移的過程中是有關聯的，而且其對于HCC的轉移有著密切的關系，PI3K/AKT/PAK1可能形成一條促癌的信號通路，從而促進早期HCC的轉移。

通過對本研究結果的分析討論，我們提出了PAK1和AKT信號在HCC轉移過程中不僅表達量增多，而且其活性也有明顯的增強。此外，PI3K/AKT信號通路和PAK1信號密切相關，鑒于以往的一些研究結果，PI3K/AKT信號通路很可能協同PAK1信號形成共同的促癌信號，協同調控HCC的惡化轉移。本研究不僅揭示了這一相關性的存在，而且也為預防及治療HCC，防止其惡化轉移提供了一個新的切入點。

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（收稿：2016-09-10）

（本文編輯：陳從新）

Expression of PI3K-Akt-PAK1 pathway in the process of metastasis of hepatocellular carcinoma

Zhang Lei，Wang Lin，Geng Zhimin，et al.Department of Elderly Surgery，First Affiliated Hospital，Jiaotong University，Xi'an 710061，Shaanxi Province

ObjectiveBased on relevant database data，we tried to explore the importance of PI3K/Akt/ PAK1 signaling pathway to HCC metastasis and provide an effective molecular marker for the prevention of HCC. MethodsFrom GES364 data sets of GEO in the NCBI database，we searched the materials about the PI3K/Akt/ PAK1 expression in intrahepatic spread（IHS），entrahepatic metastasis（EHM），non-metastasis（NM）and normal livers（N）.ResultsThe expression of PAK1 and MMP-9 were up-regulated in IHS and EHM group（P<0.0001）as compared with those in normal liver and NM group;the expression of AKT（1/2）and Girdin were upregulated in the IHS，EHM and NM group（P<0.05）as compared with in normal liver；in the EHM group，the expression of AKT2 was positively correlated to PAKI（r=0.5679，P=0.0013）.ConclusionsThe up-regulation of PAK1 and MMP-9 could promote the spread and metastasis of HCC cells，the increased expression and activities of AKT are crucial for metastasis of liver cancer，and the PI3K/AKT/PAK1 signaling pathway is closely related to the development and metastasis in patients with HCC.

Hepatocellular carcinoma；Metastasis；PAK1；AKT

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.013

710061西安市西安交通大學第一附屬醫院老年外科

張雷，男，43歲，醫學博士，副主任醫師。主要從事膽道和肝臟外科疾病診治研究。E-mail:zhanglei723d@126.com