膽管癌組織緊密連結蛋白18、絲氨酸蛋白酶抑制劑和p53蛋白表達及其臨床意義

曹光材，白江江，戴阿利

膽管癌組織緊密連結蛋白18、絲氨酸蛋白酶抑制劑和p53蛋白表達及其臨床意義

曹光材，白江江，戴阿利

目的探討膽管癌組織緊密連結蛋白18（claudin-18）、絲氨酸蛋白酶抑制劑（maspin）和p53蛋白表達的臨床意義。方法采用免疫組化和Western blot法檢測46例膽管癌和32例正常膽管組織claudin-18、maspin和p53蛋白的表達，采用Spearman等級相關分析。結果膽管癌組織claudin-18和p53蛋白陽性率分別為52.17%和56.52%，顯著高于正常膽管組織（0.0%和0.0%，P＜0.01）；膽管癌組織maspin陽性率為86.96%，顯著低于正常膽管組織（100.0%，P＜0.01）；膽管癌組織claudin-18、maspin和p53蛋白表達量分別為2.83±0.52、2.45±1.24和1.73± 1.26，均顯著高于正常膽管組織（0.48±0.75、0.46±0.32和0.0±0.0，P＜0.05）；膽管癌組織maspin與p53表達呈負相關（r=-8.546，P=0.001）。結論膽管癌組織maspin、claudin-18和p53蛋白表達的意義還有待于進一步研究。

膽管癌；緊密連結蛋白18；絲氨酸蛋白酶抑制劑；p53；免疫組化；蛋白印跡法

膽管癌（Bile duct cancer，BDC）患者的早期診斷較困難，致使手術切除率低，預后極差，但目前尚不清楚其發生、發展的分子機制[1，2]。因此，尋找和研究與膽管癌發生相關的基因及表達產物的變化對其防治具有十分重要的意義[3]。Claudin-18蛋白是細胞間緊密連接結構的骨架蛋白。近年來，研究證實Claudin蛋白與肺癌、胃癌、結直腸癌等多種腫瘤的發生、發展及預后有關。然而，目前尚不清楚claudin-18在膽管癌患者中的表達情況[4]。 Maspin是最新發現的一種腫瘤抑制基因。研究表明，maspin與絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族具有高度的同源性，它們都與細胞外基質的降解有著密切的關系。同為抑癌基因的p53也參與抑制細胞生長及腫瘤發生發展過程[5，6]。目前的研究發現，幾乎所有類型的惡性腫瘤中均存在p53的功能缺失和結構突變。本研究檢測了膽管癌組織claudin-18蛋白、maspin和p53表達情況，以探討三者在膽管癌的發生、發展、浸潤及轉移過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料2012年6月～2016年8月我院肝膽外科收治的46例膽管癌患者手術切除組織的存檔蠟塊，男性26例，女性20例；年齡43～75（58.64± 10.36）歲。所有患者均經手術切除治療，術前均未經放療或化療治療。其中肝門部膽管癌28例，中、下段膽管癌18例；低分化癌16例，高、中分化癌30例；TNM分期Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例。選取同期臨床資料保存完整的32例正常膽管組織作為對照，男性20例，女性12例；年齡44～76（58.56±10.34）歲。兩組患者在年齡、性別方面比較差異無統計學意義（均P＜0.05）。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書，同意本研究。

1.2 膽管組織蛋白表達的檢測羊抗人claudin-18多克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司）；羊抗人p53單克隆抗體和羊抗人maspin單克隆抗體C-20（均購自福州邁新生物技術開發公司）。PV-6000試劑盒、濃縮型DAB試劑盒以及ECL試劑盒（均購自福州邁新生物技術開發公司）。采用免疫組織化學第二代聚合酶兩步法（En Vision，PV）檢測。所有手術標本均經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4μm連續切片，分別行HE染色和免疫組化染色。切片脫蠟、水化、3%過氧化氫室溫下孵育10min，高壓鍋抗原修復后經PBS緩沖液沖洗。按PV-6000試劑盒說明書進行操作：滴加羊抗人claudin-18多克隆抗體、羊抗人p53單克隆抗體或羊抗人maspin單克隆抗體，經37℃孵育1～2 h或4℃過夜，PBS緩沖液沖洗2 min×3次，DAB顯色。蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片、鏡檢。結果評定標準：細胞膜出現棕黃色細顆粒為陽性細胞。隨機觀察5個高倍鏡視野（400×），陽性細胞＜25%為陰性（-）；25%～50%為弱陽性（+）；51%～75%為陽性（++）；＞75%為強陽性（+++），其中陰性（-）和弱陽性（+）為低表達，（++）和（+++）為高表達。

1.3 膽管組織claudin-18、maspin和p53蛋白水平檢測采用Western blot法，取出經-80℃液氮保存的膽管癌組織細胞團塊，預冷PBS緩沖液沖洗3次，加RIPA蛋白提取緩沖液（Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH7.4，1mmol/LEDTA，1%-TritonX-100，0.1%SDS，5mg/LLeupeptin，1mmol/L PMSF）提取蛋白，BCA法定量，調整蛋白濃度后加入4×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min。加80μg蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，分別加入羊抗人claudin-18多克隆抗體、羊抗人p53單克隆抗體或羊抗人maspin單克隆抗體，經37℃孵育1～2 h或4℃過夜，PBST洗滌3次，每次10min。加入經適當稀釋的HRP標記的兔抗羊IgG，室溫（37℃）孵育2 h，PBST洗滌3次，每次10min，ECL顯色，暗室內X線片曝光、顯影、定影。然后，用GS800系統掃描圖像，分析蛋白表達量。實驗重復2次，取均值。

1.4 統計學處理應用SPSS19.0統計學軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，采用Spearman等級相關性分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膽管癌組織與正常膽管組織claudin-18、maspin和p53表達情況膽管癌組織claudin-18、maspin和p53陽性率分別為52.17%（24/46）、86.96%（40/46）和56.52%（26/46），而在正常膽管組織陽性率分別為0.0%（0/32）、100.0%（32/32）和0.0%（0/32），差異均有統計學意義（P＜0.01，表1，圖1、圖2）。

表1 膽管癌組織與正常膽管組織claudin-18、maspin和p53表達量（±s）比較

表1 膽管癌組織與正常膽管組織claudin-18、maspin和p53表達量（±s）比較

例數claudin-18maspinp53膽管癌組織462.83±0.522.45±1.241.73±1.26正常膽管組織320.48±0.750.46±0.320.0±0.0 t 2.2353.5564.112 P 0.0240.0210.000

圖1 膽管癌和正常膽管組織claudin-18、maspin和p53蛋白表達情況（Western blot法）

圖2 膽管癌和正常膽管組織P53表達情況（PV二步法，400×）

2.2 不同臨床和病理學指標膽管癌組織claudin-18、maspin和p53表達的比較在不同年齡、性別、腫瘤直徑、組織分化程度組織claudin-18、maspin和p53表達無顯著性差異（均P＞0.05）；不同TNM分期腫瘤組織claudin-18表達水平無顯著性差異（P＞0.05），而p53和maspin表達水平差異具有統計學意義（均P＜0.05，表2）。

表2 不同特征膽管癌組織claudin-18、maspin和p53表達（±s）比較

表2 不同特征膽管癌組織claudin-18、maspin和p53表達（±s）比較

例數claudin-18t值P值maspint值P值p53t值P值年齡（歲）13.2350.345＞60182.94±0.632.56±1.356.3450.2251.84±1.337.7350.332≤60282.72±0.462.33±1.048.2310.1161.62±1.148.3520.225性別男202.89±0.686.5460.2562.69±1.227.7720.3321.79±1.354.2330.321女262.73±0.427.3360.3342.37±1.026.9840.3581.68±1.165.3280.327腫瘤直徑（cm）≤2.0202.91±0.655.2330.3362.63±1.254.4420.3281.72±1.224.3290.228＞2.0262.74±0.447.8940.3422.34±1.143.5610.3341.66±1.049.4570.318腫瘤部位肝門部282.88±0.646.3420.2542.64±1.235.5560.2231.75±1.253.3360.257中、下段182.71±0.434.3520.5562.38±1.066.7240.3161.68±1.324.3520.334腫瘤分化高、中分化302.74±0.425.4360.2232.38±1.274.5630.2411.63±1.353.2680.226低分化162.86±0.636.1770.3162.64±1.025.6620.3251.73±1.244.5240.314 TNM分期Ⅰ期172.65±0.336.1320.2372.25±0.865.5570.0441.64±0.964.3520.032Ⅱ期152.76±0.414.3520.4322.36±0.936.3420.0351.72±1.135.4380.025Ⅲ期102.87±0.533.3160.5562.49±1.055.1160.0261.85±1.256.4430.012Ⅳ期42.98±0.624.3520.3262.62±1.146.4350.0161.94±1.386.4510.028

2.3 膽管癌組織claudin-18、maspin與p53表達的相關性分析膽管癌癌組織maspin表達與p53表達呈負相關（r=-8.546，P=0.001），而claudin-18表達與p53或maspin表達均無顯著相關性（r=6.452，P=0.436，r=5.543，P=0.336）。

3 討論

腫瘤的發生是一個漸進的過程，同時也是一個多因素、多階段的過程，其中抑癌基因的失活是導致腫瘤細胞增殖、浸潤和遠處轉移的基礎[6]。目前已發現claudin蛋白已有27個家族成員，主要功能是維持細胞間粘附、調節細胞旁通透性及維持細胞極性[7，8]。近年來研究顯示，不同claudin蛋白亞型在腫瘤中差異性表達可用于診斷及鑒別診斷，如claudin-4可用于鑒別腺癌，而尚不清楚claudin-18表達的作用[9，10]。本研究結果表明，claudin-18在膽管癌組織中的表達顯著高于正常組，表明claudin-18可作為臨床預測的指標之一。

Maspin是屬于Serpin家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，最初發現于正常人乳腺上皮，可編碼42 kD細胞質蛋白。由于Maspin能夠抑制乳腺癌細胞運動、侵襲和轉移，因此被認為具有抑制腫瘤活性的能力[11-13]。p53是目前公認的maspin表達調節因子[14，15]，能夠調控細胞的生長及DNA損傷后的細胞凋亡。p53有兩種類型，分別為野生型和突變型。野生型p53可通過抑制細胞增殖、促進DNA損傷后的修復以及誘導細胞凋亡等方式起到抑制腫瘤生長的作用[16]；突變型p53因原有的空間構象已經改變，喪失了特異性結合DNA的能力，導致轉錄因子活性的丟失。除此之外，相關研究提示因突變型p53還能夠與某些癌基因起協同作用，所以會促進腫瘤的增殖和生長[17]。由于野生型p53在細胞內的相對表達量較低且半衰期短，普通的免疫組化方法難以檢測，而突變型P53因蛋白空間構象改變，半衰期較長，所以普通免疫組化方法所檢測到的p53基本為突變型p53[18]。戚峰等[19]采用SP免疫組化法分別測定40例膽管癌組織和20例正常膽管組織p53的表達量，結果顯示，膽管癌組織p53陽性率為57.5%，而正常膽管組織無p53陽性表達。這一結果表明，p53基因的突變或失活在膽管癌發生、發展的過程中起到了關鍵性的作用。本研究采用SP免疫組化法檢測膽管癌組織p53的陽性率為56.52%，與戚峰等報道近似。Shinozaki et al[20]研究揭示p53能結合到maspin基因的啟動子上，并把maspin視為p53的一個新的靶點。實驗結果提示p53與maspin表達呈負相關，這與在胃癌、甲狀腺癌、原發性前列腺癌、乳腺癌中的研究結果一致。本研究結果顯示，膽管癌組織maspin表達與p53呈負相關，與Alvarez et al的研究結果一致。此外，本研究還發現，不同TNM分期的膽管癌組織maspin和p53表達量不同，暗示這兩種指標可用于臨床評價膽管癌患者病情的嚴重程度。

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（收稿：2016-09-27）

（本文編輯：陳從新）

Expressionofclaudin-18,maspinandp53intissuesfromcholangiocarcinoma

CaoGuangcai，Bai Jiangjiang，Dai Ali.Department of Anorectal Surgery，Affiliated Hospital，Yan'an University，Yan'an 716000，Shaanxi Province，China

ObjectiveTo study the expression of claudin-18，maspin and p53 in tissues of cholangiocarcinoma.MethodsThe expression of claudin-18，maspin and p53 were detected by immunohistochemistry and Western blot in 46 cholangiocarcinoma and 32 normal liver tissues.ResultThe positive rates of claudin-18 and p53 in cancerous tissues were 52.17%and 56.52%，respectively，significantly higher than 0.0%and 0.0%in normal control（P＜0.01）；The positive rate of maspin in cancerous tissues was 86.96%，much lower than 100.0%in normal control（P＜0.01）；The relative expression levels of claudin-18，maspin and p53 were 2.83±0.52，2.45±1.24 and 1.73±1.26，respectively，significantly higher than 0.48±0.75，0.46±0.32 and 0.0±0.0 in the control（P<0.05）；The expression of maspin was negatively correlated with p53 expression in cancerous tissues（r=-8.546，P=0.001）.ConclusionThe implication of maspin，claudin-18 and p53 expression in cholangiocarcinoma tissues needs further investigation.

Cholangiocarcinoma；Claudin-18；Maspin；p53；Immunohistochemistry；Western blot

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.014

716000陜西省延安市延安大學附屬醫院肛腸外科(曹光材,白江江）；陜西延安職業技術學院護理系（戴阿利）

曹光材，男，35歲，大學本科，主治醫師。主要從事結腸直腸腫瘤和肛門良性疾病研究。E-mail：caoguangcai1981@163.com