雙歧桿菌介導CTP-NPRL2對裸鼠腎癌生長及凋亡的影響*

鄧正國，唐 偉，陳 欣，史曉博

(1.重慶市永榮礦業有限公司總醫院泌尿外科，重慶榮昌 402460；2.重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科 400016)

論著·基礎研究

雙歧桿菌介導CTP-NPRL2對裸鼠腎癌生長及凋亡的影響*

鄧正國1，唐 偉2△，陳 欣2，史曉博2

(1.重慶市永榮礦業有限公司總醫院泌尿外科，重慶榮昌 402460；2.重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科 400016)

目的 探討雙歧桿菌介導CTP-NPRL2對裸鼠腎癌生長及凋亡的影響。方法 構建pET15b-CTP-NPRL2并電轉雙歧桿菌，Western blot驗證蛋白表達。采用腎癌細胞懸液皮下注射法建立裸鼠腎癌模型，并分為觀察組與對照組(每組8只)，分別經尾靜脈注射攜帶pET15b-CTP-NPRL2的雙歧桿菌與生理鹽水，每周1次，4周后處死裸鼠，稱取裸鼠及荷瘤質量，TUNEL法檢測腎癌組織凋亡。結果 觀察組與對照組裸鼠質量分別為(26.24±1.98)g、(23.28±2.17)g，荷瘤質量分別為(1.37±0.12)g、(1.68±0.18)g，兩組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。TUNEL檢測顯示觀察組凋亡指數(23.27±5.14)%明顯高于對照組(10.37±2.58)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論 雙歧桿菌介導CTP-NPRL2對裸鼠腎癌生長具有抑制功能，并明顯增加了腎癌細胞的凋亡。

腎腫瘤；雙歧桿菌；基因治療；NPRL2；細胞質轉導肽

腎癌約占所有成人惡性腫瘤的3%[1]。早期手術后有20%～30%的患者發生轉移[2]；晚期治療方法有限。抑癌基因NPRL2(nitrogen permease regulator-like 2)是Lerman等[3]發現的新抑癌基因，在多種腫瘤中的表達下降，課題組前期于腎癌中發現NPRL2的表達較癌旁組織明顯下降[4]。細胞質轉導肽(cytoplasmic transduction peptide，CTP)可高效攜帶目的蛋白穿透細胞膜并專性定位于細胞質[5]，課題組前期發現利用CTP將NPRL2蛋白轉入腎癌細胞發揮了很好的腫瘤抑制作用[6]。雙歧桿菌是良好的腫瘤基因治療的載體[7-9]。本課題將上述三者結合起來，構建雙歧桿菌介導的CTP-NPRL2處理系統，觀察其對裸鼠腎癌生長及凋亡的影響，為進一步深入研究打下基礎，為腎癌臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物 腎癌細胞786-O由課題組前期保存。健康BALB/c-nu雌性裸鼠24只，4～5周齡，體質量16～18 g，由重慶醫科大學動物實驗中心提供[許可證號：SCXK(渝) 2012-0001,SYXK(渝) 2012-0001]，SPF級動物房，鼠籠喂養，室溫20～23 ℃，12/12 h晝夜節律更替，自由進食和飲水，所有動物喂養與操作均遵守《重慶市實驗動物管理辦法》。

1.1.2 試劑與儀器 雙歧桿菌由本實驗室保存；pET15b、氨芐西林、LB培養基、MRSA培養基、2×pfu colorless mix、2×Taq PCR mix、考馬斯亮藍染色液、PBS粉劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、羊抗鼠辣根過氧化酶(HRP)標記IgG、4%多聚甲醛、PVDF膜及PCR產物純化回收試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；ECL化學發光試劑盒、0.25%胰酶及異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)購自Genview；T4 DNA ligase購自Biolabs；胎牛血清購自GEMINI；鼠源NRPL2單克隆抗體購自Santa Cruz；RPMI1640購自HyClone；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于Roche。普通顯微鏡(Olympus)，低溫高速離心機購自長沙平凡儀器儀表有限公司，電轉杯、凝膠成像系統(Bio-Rad)，基因導入儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建及鑒定 根據目的序列和載體MCS位點，添加Ndel、BamHI，合成引物如下：FCTP-NPRL2：GGA ATT CCA TAT GAT GTA CGG ACG CCG CGC AC；RCTP-NPRL2：CGC GGA TCC TCT TAC TTC CAG CAG ATG ATG ATG TTG GG。PCR擴增目的基因，切膠回收產物。酶切PCR產物和pET15b質粒并回收，通過T4 DNA連接酶連接后轉化DH5α感受態菌株，用含氨芐西林的LB培養基篩選出陽性菌落并PCR鑒定，提取質粒進行測序。

1.2.2 Western blot驗證目的蛋白的表達 37 ℃厭氧培養雙歧桿菌，待細菌生長進入對數期后制備成感受態。將重組質粒pET15b-CTP-NPRL2電轉感受態雙歧桿菌，電轉條件為:電壓12 kv/cm，電阻200 Ω，電容25 uF。電轉后加入含氨芐西林的MRSA培養液中并做好標記，37 ℃厭氧培養，待細菌生長進入對數生長期，加入IPTG誘導蛋白表達，12 h后離心棄培養液，PBS液洗滌3次，超聲裂菌離心取上清液，Ni-NTA親和層析柱純化后，上樣SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上，封閉后置于4 ℃一抗孵育過夜，次日37 ℃二抗孵育1 h，最后用化學發光試劑顯色。

1.2.3 腎癌細胞培養 腎癌細胞786-O加入于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，37 ℃、5%CO2孵箱中常規傳代培養。當細胞擴增至對數生長期時，0.25%胰酶消化后離心收集，PBS洗滌3次并重懸，稀釋細胞濃度為2.5×107個/mL。

1.2.4 構建裸鼠腎癌模型及分組給藥 3.5%水合氯醛腹腔麻醉(350 mg/kg)后，將配制好的腎癌786-O細胞懸液皮下注射于裸鼠后項，每只0.2 mL，共24只。2周后瘤塊形成，隨機選取2只裸鼠處死，瘤塊行病理檢查。選取荷瘤大小均一的16只裸鼠分為對照組與觀察組，每組8只，分別經尾靜脈注射生理鹽水與攜帶重組質粒pET15b-CTP-NPRL2的雙歧桿菌菌液0.2 mL，每周注射1次，總共4周。待處理結束后，處死并稱取裸鼠及荷瘤質量。

1.2.5 原位末端標記法(TUNEL)檢測腎癌組織凋亡 按TUNEL試劑盒說明書進行操作。在光學顯微鏡下觀察，凋亡細胞表現為核固縮、染色質邊集或成塊、呈棕褐色染色。計數至少5個視野，每個視野100個細胞，計算凋亡指數(apoptotic index，AI)，即凋亡細胞數占細胞總數的百分比。

2 結 果

2.1 測序鑒定及目的蛋白的表達 CTP-NPRL2基因PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 221 bp的條帶，與預期大小相符(圖1)。重組質粒pET15b-CTP-NPRL2采用T7、T7ter引物雙向測序。BLAST比對測序結果顯示重組質粒pET15b-CTP-NPRL2測序結果中包含CTP及NPRL2基因序列，NPRL2基因同源性100%。Western blot驗證目的蛋白的表達，結果顯示攜帶重組質粒pET15b-CTP-NPRL2的雙歧桿菌在50×103左右有目的條帶出現，未經誘導的菌體無條帶出現，見圖2。

M:DNA Marker DL2000;1:CTP-NPRL2基因PCR產物。

圖1 CTP-NPRL2基因PCR擴增產物電泳圖

1:純雙歧桿菌;2:純化的CTP-NPRL2蛋白。

圖2 Western blot檢測目的蛋白的表達

2.2 裸鼠腎癌模型 裸鼠腎癌建模過程中共死亡2只，2只未成瘤，20只成瘤。隨機選取2只成瘤裸鼠處死，取出包塊HE染色病檢，光鏡下見腎癌細胞呈實性片狀，排列較紊亂，極性消失，細胞異質性明顯，可見明顯核分裂(圖3)，說明腎癌模型構建成功。選取腫塊大小均一，直徑約5 mm的16只裸鼠平均分組，剩下2只裸鼠因瘤塊體積過小而棄用，處理過程中無死亡。

2.3 兩組裸鼠及荷瘤質量比較 觀察組較對照組裸鼠質量明顯增加(P<0.05)，而荷瘤質量明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.4 兩組裸鼠腎癌細胞凋亡比較 TUNEL染色可見兩組腎癌細胞均有一定的凋亡(圖4)。觀察組AI值(23.27±5.14)%明顯高于對照組(10.37±2.58)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 裸鼠腎癌模型(HE染色，×400)

表1 兩組裸鼠質量及荷瘤質量比較±s,n=8,g)

a：P<0.05與對照組比較。

A:觀察組；B:對照組。

圖4 各組裸鼠腎癌組織(TUNEL染色，×400)

3 討 論

腎癌亦稱腎細胞癌，是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，約占腎臟腫瘤的90%，病理類型以透明細胞癌為主，約占腎癌的80%[10]。近年來，腎癌的發病率有上升的趨勢，并且許多患者就診時已處于晚期[11]。腎癌早期以根治性腎切除術為主，而晚期患者失去手術機會，同時由于腎癌具有多藥物耐藥基因，對放、化療不敏感，缺乏特效治療方法?；虔煼ㄊ悄I癌治療的研究熱點，但目前研究都未能突破到臨床應用，需進一步探索。

抑癌基因NPRL2，也稱腫瘤抑制候選基因4(tumor suppressor candidate-4,TUSC4)，表達于許多正常組織，而在相應的惡性腫瘤組織中表達明顯下降，如肺癌、乳腺癌、結腸癌[3]。研究表明，抑癌基因NPRL2與腫瘤的發生、發展及預后關系密切。Otani等[12]學者研究認為，NPRL2的表達在肝細胞癌的發展過程中作為一個獨立的預后因子扮演了重要的角色。外周血中的NPRL2 mRNA也可作為一個有用的分子標記物來檢測出早期階段的結腸腺瘤與結腸癌[13]。本課題組前期研究發現NPRL2在腎癌組織標本中的表達降低，并與腎癌組織學分級、TNM分期密切相關，通過轉染帶有抑癌基因NPRL2的質粒能抑制腎癌細胞786-O增殖，阻滯細胞周期于G0/G1期并增加細胞凋亡[4]。

CTP是Kim等[5]報道的一種可高效攜帶蛋白質穿透胞膜并專性定位于細胞質的轉導肽，以胞吞-非依賴性機制發揮轉導功能，也避免了傳統的轉導肽PTD作為蛋白轉導體時主要定位于細胞核而存在損傷遺傳物質和致瘤等潛在危害。Huang等[14]通過原核表達CTP-OD-HA融合蛋白，成功轉染慢性粒細胞白血病細胞發揮出OD-HA的作用抑制了細胞的增殖。Xun等[15]同樣通過原核表達anti-HBc scFv-CTP，利用CTP將anti-HBc scFv轉入HepG2.2.15細胞，抑制了乙型肝炎病毒的復制。本課題組前期證實，利用CTP同樣能使抑癌基因NPRL2蛋白轉入腎癌細胞并發揮該蛋白的抑癌作用[6]。雙歧桿菌屬于革蘭陽性菌，嚴格厭氧，是人體中的重要益生菌，廣泛用于各種奶制品發，被美國食品和藥品管理局(FDA)定為最高安全級別。許多研究表明，雙歧桿菌對腫瘤中心厭氧區具有很好的靶向性，是良好的基因治療靶向載體[7-9]。本課題擬將NPRL2、CTP與雙歧桿菌三者聯合起來，結合本課題組前期工作經驗，構建雙歧桿菌介導的CTP-NPRL2處理系統，觀察其對裸鼠腎癌組織生長及細胞凋亡的影響。

本研究結果顯示，雙歧桿菌介導CTP-NPRL2對裸鼠腎癌組織的生長具有明顯的抑制作用，并且顯著增加了腎癌細胞的凋亡，從而減輕了裸鼠的腫瘤負荷，改善了裸鼠的身體質量。該結果初步表明，利用雙歧桿菌介導CTP-NPRL2治療腎癌切實可行，并為下一步繼續深入細致的研究打下了基礎，也為臨床上腎癌的基因治療提供了新的思路。然而，本實驗僅僅初步證實了雙歧桿菌介導CTP-NPRL2對腎癌組織具有腫瘤抑制作用，還需要進一步進行深入的研究，以期闡述清楚雙歧桿菌介導CTP-NPRL2治療腎癌的分子機制，為臨床藥物開發與應用提供最可靠的實驗依據。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2015[J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5-29.

[2]Eggener SE,Yossepowitch O,Pettus JA,et al.Renal cell carcinoma recurrence after nephrectomy for localized disease:predicting survival from time of recurrence[J].J Clin Oncol,2006,24(19):3101-3106.

[3]Lerman M,Minna JD.The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3:identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes[J].Cancer Res,2000,60(21):6116-6133.

[4]Tang YY,Jiang L,Tang W.Decreased expression of NPRL2 in renal cancer cells is associated with unfavourable pathological,proliferation and apoptotic features[J].Pathol Oncol Res,2014,20(4):829-837.

[5]Kim D,Jeon C,Kim JH,et al.Cytoplasmic transduction peptide(CTP):new approach for the delivery of biomolecules into cytoplasm in vitro and in vivo[J].Exp Cell Res,2006,312(8):1277-1288.

[6]Zeng Y,Shi XB,Yuan ZY,et al.Biological characteristics of renal cancer cells after CTP-mediated cancer suppressor gene NPRL2 protein treatment[J].Biol Chem,2016,397(11):1163-1171.

[7]江虹銳，魯志剛，馬玉彥，等．兩歧雙歧桿菌在荷瘤鼠模型中的靶向定植及對巨噬細胞的免疫激活[J]．腫瘤，2009，29(8)：721-726．

[8]Yin X,Yu B,Tang Z,et al.Bifidobacterium infantis-mediated HSVTK/GCV suicide gene therapy induces both extrinsic and intrinsic apoptosis in a rat model of bladder cancer[J].Cancer Gene Ther,2013,20(2):77-81.

[9]吳瑜，易成，王樹人，等．嬰兒雙歧桿菌對小鼠黑色素瘤模型腫瘤組織的靶向性[J]．四川大學學報(醫學版)，2003，34(3)：435-438．

[10]Leibovich BC,Lohse CM,Crispen PL,et al.Histological subtype is an independent predictor of outcome for patients with renal cell carcinoma[J].J Urol,2010,183(4):1309-1315.

[11]Ridge CA,Pua BB,Madoff DC.Epidemiology and staging of renal cell carcinoma[J].Semin Intervent Radiol,2014,31(1):3-8.

[12]Otani S,Takeda S,Yamada S,et al.The tumor suppressor NPRL2 in hepatocellular carcinoma plays an important role in progression and can be served as an independent prognostic factor[J].J Surg Oncol,2009,100(5):358-363.

[13]Liu AY,Liu DG,Du YJ,et al.Relationship between tumor and peripheral blood NPRL2 mRNA levels in patients with colorectal adenoma and colorectal cancer[J].Cancer Biol Ther,2014,15(5):489-495.

[14]Huang SF,Liu DB,Zeng JM,et al.Cloning,expression,purification and functional characterization of the oligomerization domain of Bcr-Abl oncoprotein fused to the cytoplasmic transduction peptide[J].Protein Expr Purif,2009,64(2):167-178.

[15]Xun YH,Pan QC,Tang ZH,et al.Intracellular-delivery of a single-chain antibody against hepatitis B core protein via cell-penetrating peptide inhibits hepatitis B virus replication in vitro[J].Int J Mol Med,2013,31(2):369-376.

Effect of bifidobacterium-mediated CTP-NPRL2 on growth and apoptosis of nude mouse renal carcinoma*

DengZhengguo1,TangWei2△,ChenXin2,ShiXiaobo2

(1.DepartmentofUrology,GeneralHospitalofYongrongMiningCo.,Ltd.,Chongqing402460,China; 2.DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To evaluate the effect of bifidobacterium-mediated CTP-NPRL2 on the growth and apoptosis of nude mouse renal carcinoma.Methods Recombinant plasmid pET15b-CTP-NPRL2 was constructed and transfected into bifidobacterium by electroporation,and then the expression of fusion protein CTP-NPRL2 was verified by Western blot.The nude mouse renal carcinoma model was constructed by subcutaneous injection of renal carcinoma cells suspension.The nude mice with renal carcinoma were equally and randomly divided into the observation group and control group(8 mice in each group).The mice in the observation group were treated with bifidobacterium containing recombinant plasmid pET15b-CTP-NPRL2 through tail vein injection,and the mice in the control group were treated with normal saline.All mice were treated once a week for four weeks,and then executed for evaluating the weight of mice and bearing tumors.Finally,the apoptosis of renal carcinoma was detected by TUNEL staining.Results The mass of nude mice was(26.24±1.98) g in the observation group and(23.28±2.17) g in the control group.The mass of bearing tumors was(1.37±0.12) g in the observation group and(1.68±0.18) g in the control group,and the differences were statistically significant(P<0.05).The TUNEL detection results showed that the apoptosis index of renal carcinoma cell in the observation group(23.27±5.14)% was significantly higher than that in the control group(10.37±2.58)%,and the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion Bifidobacterium-mediated CTP-NPRL2 has an inhibitory effect on the renal carcinoma growth of nude mouse,and significantly increases the apoptosis of renal carcinoma cells.

kidney neoplasms;bifidobacterium;gene therapy;nitrogen permease regulator-like 2;cytoplasmic transduction peptide

重慶市衛生局面上項目(2013-2-262)。 作者簡介：鄧正國(1970-)，副主任醫師，本科，主要從事泌尿系統腫瘤的診治研究?！?/p>

，E-mail:tangwei2060@163.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.005

R737.11；R730.59

A

1671-8348(2017)18-2464-04

2017-01-02

2017-03-16)