非折疊蛋白反應與阿爾茨海默病*

鄧蒙生 ，劉春燕，郝亞楠 綜述，殷 菲 審校

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

·綜 述·

非折疊蛋白反應與阿爾茨海默病*

鄧蒙生 ，劉春燕，郝亞楠 綜述，殷 菲 審?！?/p>

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

非折疊蛋白反應；阿爾茨海默??；內質網應激

阿爾茨海默病(AD)是一種年齡相關的神經退行性疾病，給患者帶來了巨大的心理和身體上的負擔。由于人們生活方式的不斷改變，AD的患病人數飛速上漲，已成為威脅人類健康的一重大疾病，根據Alzheimer′s Disease International網站給出的統計數據，2015年全球有4 680萬患者，到2030年將增長到7 470萬，而2050年可能上漲到驚人的1.31億。目前就其發病機制存在多種假說，包括膽堿能假說、基因假說、金屬離子假說、β-淀粉樣蛋白(Aβ)級聯假說、Tau蛋白過度磷酸化假說和突觸功能障礙假說等。其中被廣泛接受的是Aβ級聯假說[1]和Tau蛋白過度磷酸化引起神經纖維纏結假說[2]。近年來，越來越多的研究結果證實，AD的形成與神經元內質網應激(ERS)引起的非折疊蛋白反應(UPR)存在諸多聯系，提示UPR可能會成為AD防治的新靶點。本文就UPR與Aβ代謝和Tau蛋白磷酸化的相關研究進展進行綜述。

1 UPR

在所有人類基因組編碼的蛋白質當中，分泌性蛋白大約占20%。這些分泌性蛋白在到達它們的最終目的地之前都需要先進入折疊組裝的場所——內質網。內質網不僅是蛋白質折疊組裝的“容器”，它同時還提供了眾多的分子伴侶，幫助蛋白質折疊、成熟。蛋白質在合成過程當中極易出錯，大約有1/3的新生蛋白質會在轉錄、翻譯、折疊或成熟過程中出現錯誤，從而在翻譯過程中或者在翻譯后數分鐘之內被降解掉。UPR正是由于在內質網腔內聚集的錯誤折疊與未折疊蛋白過多，細胞為促進蛋白正確折疊或降解錯誤折疊蛋白而激發的重新尋求內穩態的過程[3]，涉及內質網與細胞核、核糖體和高爾基體等多種細胞器的信號傳遞，它有利于細胞內環境的穩定；但若ERS過度或反應機制失調則可能導致錯誤折疊蛋白在細胞內過度堆積，干擾細胞正常功能，進而引起細胞凋亡，導致疾病的發生[4]，即UPR是一種細胞對抗ERS的自身保護機制，它既可以使蛋白質合成減少以減輕ERS，有利于細胞內環境的穩定，也可以激活凋亡信號通路而使細胞走向凋亡。

UPR主要由存在于內質網膜上起應激傳感器作用的3個信號分子組成，一是雙鍵RNA-依賴的蛋白激酶樣內質網激酶 (PERK)、二是跨膜蛋白活化轉錄因子6 (ATF6)、三是肌醇需求酶1(IRE1)。

正常情況下葡萄糖調節蛋白78 (GRP78,又稱BIP)結合在PERK上使之處于沉默狀態。當ERS時，大量未折疊蛋白與BIP結合，從而導致其與PERK、IRE1分離[5]，使得PERK啟動二聚化或磷酸化而激活，傳遞到下游使真核起始因子2α (eIF2α)51位點絲氨酸磷酸化，阻止蛋白合成，減輕內質網壓力。但持續的應激可激活上游基因，繞過eIF2α依賴的蛋白質翻譯抑制作用[6]，誘導細胞凋亡。

ATF6作為ERS感受器，當內質網蛋白質折疊受阻后，ATF6與BIP蛋白分離，進入高爾基體被位點1蛋白酶(S1P)和位點2蛋白酶(S2P)切割成活性形式[7]，隨后進入細胞核內，與定位于UPR靶基因啟動子區的ERS反應元件(ERSEs)結合，促進分子伴侶BIP、GRP94、蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)、轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)和轉錄因子X盒結合蛋白1(XBP-1)的表達[8]。

由于IRE1的二聚化位點與BIP結合域有部分重疊，當BIP從IRE1上釋放后，二聚化位點游離，導致IRE1二聚化和磷酸化。自身激活的IRE1進一步被切割，其羧基端片斷被運輸到細胞核內，將XBP-1的mRNA上26個位于內含子的核苷酸切除，改變其開放閱讀框，使之成為有活性的sXBP1，進而促進內質網分子伴侶和P58IPK表達。P58IPK結合并抑制PERK，使細胞進入新的穩態。但如果應激持續存在，將會解除PERK介導的蛋白質翻譯抑制作用[9]。IRE1還可能通過影響c-Jun氨基末端激酶 (JNK)的磷酸化水平而影響Bcl-2蛋白表達從而調節細胞凋亡[10]。

2 UPR與AD

Hoozemans等[11-12]證實，UPR滲透于AD發病的每一個階段中，AD患者BIP的表達量、PERK的磷酸化水平都遠遠高于健康人，提示UPR可能在AD的進程中起著重要的作用。

2.1 Aβ與UPR Aβ是淀粉樣前體蛋白(APP)經β和γ分泌酶切割后形成的一段大小為40～42個氨基酸的短肽，在AD的發病進程中Aβ會不同程度的聚集，形成單體、低聚物、纖維等結構，這也是AD病理進程中的一個重要標志[13]。盡管Aβ的作用機制還不十分清楚，但是現有的實驗結果表明，ERS引起的UPR與APP的代謝及Aβ的神經毒性密切相關[14]。

在AD進程中ERS會擾亂APP加工及轉運過程，開始BIP可與APP相互作用，幫助其維持正確的構象或調節其加工，但用衣霉素(TM)、毒胡蘿卜素(TG)、布雷菲德菌素A (brefeldin A)處理細胞后發現APP從細胞核周圍遷移到細胞膜上[15]。UPR下游蛋白XBP-1會影響ADAM10的表達，在AD模型腦內可以觀察到XBP-1的mRNA水平明顯高于對照組[16]，同時APP/PS1和5xFAD轉基因小鼠上XBP-1介導的ADAM10表達比正常老鼠強兩倍[17]。研究發現過表達APP的人神經母細胞瘤細胞內的Aβ生成量增加使細胞變得更容易誘發ERS，而用γ-分泌酶抑制劑(L-685458)處理后這種傾向明顯減輕[18]，敲除SK-N-SH細胞的PERK基因后eIF2α的磷酸化水平降低、BIP的表達減少，Aβ的毒性增強；同時UPR被激活后APP被降解，但淀粉蛋白前β位分泌酶(BACE1)蛋白水平及PS1水平明顯減少，Aβ水平明顯增加[19]。同時在PERK單倍劑量不足的老年癡呆轉基因模型鼠(5XFAD鼠 (Tg6799 line))中發現eIF2α的磷酸化水平降低[20]；BACE1的磷酸化降低[21]，從而影響APP的加工過程，提示UPR可能通過影響APP剪切影響Aβ切生成。

另外Aβ本身與UPR也有密不可分的聯系。Chafekar等[22]指出，用Aβ的低聚物孵育人成神經細胞瘤細胞 (SK-N-SH)引起UPR，同時與用TM與Aβ處理細胞后進行對比，發現二者具有相同的毒性機制；在培養的神經元中加入外源性的Aβ，也使得內質網內的Ca2+大量釋放到細胞質中引起鈣內穩態失衡[23]，從而促進分子伴侶BIP的表達、PERK的磷酸化、eIF2α的磷酸化、ATF6的活化。且不僅Aβ的上調是與GRP78密切相關[24]，同時Aβ短時間(作用6 h)處理神經元就能檢測到PERK通路被激活[25-26]。同時有證據表明：Aβ低聚物可能通過PERK-eIF2α通路影響內質網和細胞微管骨架、影響內質網相關功能而引起UPR[27]。

2.2 Tau蛋白與UPR Tau蛋白是一種微管相關蛋白(MAP)，其作用是穩定微管 (微管是重要的細胞骨架系統，參與維持神經元形態、軸索形成和樹突狀進程)及幫助神經元突觸延伸。磷酸化的Tau蛋白反復解聚再聚合是神經元突觸延伸的必須過程。在AD患者腦內過度磷酸化的Tau蛋白總是自聚集為配對螺旋樣纖維(PHF)再發展為NFTs。對AD患者進行尸檢，在其腦內能發現UPR信號分子磷酸化與磷酸化的Tau蛋白共同存在[12]，這些提示UPR可能與Tau蛋白異常磷酸化相關。

Hoozemans等[12]發現在已經形成的神經纖維纏結中檢測不到磷酸化的PERK，但在Tau蛋白過度磷酸化的神經元中卻大量存在；在TgTauP301L轉基因小鼠海馬中發現磷酸化的Tau蛋白與磷酸化的PERK是明顯增強的,且有免疫共定位現象[28]。且在轉入Tau蛋白基因(P301L)動物模型上發現21個月大的老鼠皮層中PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化水平均明顯增加；而PERK抑制劑可以通過減少Tau蛋白磷酸化起到神經營養作用[29]；用誘導物誘導的Tau蛋白過度磷酸化之后UPR信號分子的磷酸化也會增加[28]；岡田酸(OA)一種蛋白磷酸酶抑制劑，可以誘導Tau蛋白過度磷酸化，同時也可以引發UPR，與此同時還可以使PERK磷酸化、eIF2α磷酸化、IRE1對Xbp-1 mRNA拼接及CHOP蛋白mRNA水平上調[30]。在AD患者腦內糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)、磷酸化的PERK是共同增加且有共定位的現象[12]，而GSK-3β是主要的Tau蛋白激酶，它可以促進Tau蛋白磷酸化[31]。即UPR通過激活GSK-3β促進Tau蛋白磷酸化。

反過來，Tau蛋白也可以激活UPR其機制如下：可溶性的Tau蛋白損害內質網相關的蛋白降解(ERAD)并激活UPR，在rTg4510 (這種小鼠表達人P301L突變的4R0N Tau蛋白)轉基因小鼠上可溶性Tau蛋白的積累與PERK的磷酸化是同時進行的。在rTg4510轉基因小鼠上發現Tau蛋白與ERAD、泛素蛋白酶體相關的兩個蛋白纈酪肽包含蛋白 (VCP又稱P97)、E3泛素連接酶(HRD1又稱SYVN1)存在共沉淀[32]；此時能檢測到CD3δ (一種通過ERAD降解的蛋白)大量積累，提示ERAD功能受到損害，即可溶性Tau蛋白或Aβ產生毒性，通過HRD1、VCP/p97損害ERAD，當ERAD正常功能受到影響時，內質網未折疊蛋白增多，從而引發UPR。而UPR又激活GSK-3β促進Tau蛋白磷酸化[33]。

3 Aβ和Tau蛋白通過UPR相互作用

通過研究發現，在AD患者體內Aβ和磷酸化的Tau 存在共定位[34]。UPR發生通過各種途徑使得Aβ產生增加，而Aβ可以通過刺激突觸外的N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)提高細胞內鈣水平[35]，打破細胞內鈣穩態導致UPR發生，此時GSK-3β被激活，Tau蛋白磷酸化水平急速上升，且Tau蛋白聚集會損害ERAD導致ERS又激活UPR；生成的Aβ又可以反過來打破內質網鈣穩態而導致ERS，促進UPR進程，形成惡性循環。此外，Aβ和Tau蛋白之間存在協同作用，Tau蛋白能夠結合Aβ形成可溶性復合體，生成穩定的復合物[36]，此復合物可通過提高GSK-3β活性促進Tau蛋白磷酸化并作為Aβ積聚的作用位點，加速Aβ生成沉淀[37]?？傊?，Aβ與Tau蛋白通過UPR被鏈接起來，當神經元內發生不可逆的UPR時，二者相互促進，并最終導致神經元凋亡。其相互作用方式及可能的細胞信號轉導途徑，見圖1。

圖1 Aβ和Tau蛋白與UPR的關系

4 展 望

ERS及其下游UPR在AD中的作用越來越被人們重視，它可能是AD發病的原因之一[38-39]。體外實驗證實Aβ低聚物孵育神經元可引起Tau蛋白過度磷酸化，Aβ介導的神經毒性與Tau蛋白過度磷酸化通過UPR而被串聯起來[40]。提示這一重要的生理過程中存在許多潛在的、新的預防和治療AD的作用靶點和藥物。首先是化學分子伴侶，它可以幫助蛋白質的正確折疊、正確構象的維持，減少Aβ的生成[41]。常見的分子伴侶4-苯基丁酸 (4-PBA)?；切苋パ跄懰?(TUDCA)被廣泛用于抑制UPR[15,30]；其次是影響ER Ca2+遷移，內質網Ca2+穩態失衡是ERS的重要標志[23]，有文獻報道Rhyanodine受體拮抗劑 (RyR)丹曲林 (Dantrolene)可以通過抑制Ca2+外流、PERK的激活[41]，從而減少Aβ的生成[42]；同時也有一些經典的藥物被用于這方面，比如最近在體外實驗中發現丙泊酚被認為可以抑制肉質網內Ca2+外流，從而減少細胞凋亡[43]。以上提示，刺激蛋白質正確折疊，維持蛋白質的正確構象和抑制ERS可能是是防治AD的有效手段之一。

近年來ERS信號轉導及其與AD關系的研究很多，UPR作為細胞應激后的反應，既有保護作用，又有致凋亡作用，在不同疾病中的角色各不相同。但總體上來說，都是通過上調與蛋白質折疊有關的分子伴侶、使eIF2α磷酸化從而減少蛋白質的合成而發揮保護作用。但當ERS持續發生時，為了避免更大程度的組織損傷，內質網負荷過重的部分細胞會走向凋亡，UPR可能在疾病進展中起到一定作用，但具體機制仍還需進一步詳細闡述。如何有效調控具有保護作用的UPR機制可以作為研究重點，能夠調控UPR進程的化合物，或者干擾UPR對Aβ生成或Tau蛋白磷酸化的途徑，都能夠進一步影響AD的發展，從而為AD的早期防治提供新的思路和靶點。

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國家自然科學基金面上項目(81373459)；重慶市杰出青年基金項目 (cstc2014jcyjjq10003)；重慶市研究生創新基金資助的項目(CYS16216)。 作者簡介：鄧蒙生(1991-)，在讀碩士研究生，主要從事藥理學研究?！?/p>

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