微創清除顱內血腫降低病灶周圍組織谷氨酸水平及BBB通透性*

李 昌，唐翠娥，付 蓉，王麗琨，伍國鋒△

(1.貴州省貴陽市第二人民醫院神經內科 550081；2.貴州醫科大學計算機教研室，貴陽 550004；3.貴州醫科大學神經病學教研室，貴陽 550004)

微創清除顱內血腫降低病灶周圍組織谷氨酸水平及BBB通透性*

李 昌1，唐翠娥2，付 蓉1，王麗琨3，伍國鋒3△

(1.貴州省貴陽市第二人民醫院神經內科 550081；2.貴州醫科大學計算機教研室，貴陽 550004；3.貴州醫科大學神經病學教研室，貴陽 550004)

目的 探討微創顱內血腫清除對降低病灶周圍腦組織谷氨酸(Glu)水平、血腦屏障(BBB)通透性及腦水腫的影響。方法 將30只體質量2.80～3.40 kg的家兔制作自發性腦出血(ICH)模型，模型制作成功后，分成對照組(MC組)和微創組(MI組)，MI組于造模后6 h內通過立體定向儀行微創顱內血腫清除術，于術后1、3、7 d提取腦組織，檢測血腫周圍腦組織Glu水平、BBB通透性及腦含水量，并與對照組進行比較分析。結果 MI組在術后1、3、7 d血腫周圍腦組織Glu水平、BBB通透性及腦含水量均低于MC組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 微創技術清除顱內血腫有利于降低血腫周圍Glu水平、BBB透性及腦含水量。

腦出血；微創技術清除顱內血腫；谷氨酸；血腦屏障；腦含水量

自發性腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后由于血腫本身對周圍腦組織的機械壓迫及炎癥介質、興奮性氨基酸等神經毒性物質的釋放導致了繼發性腦損害，在血腫附近的腦組織發生不可逆的損害[1]，而谷氨酸(Glu)介導的興奮性毒性作用可能對繼發性腦損害有重要影響[1]。近年來，微創清除顱內血腫的有效性已經得到臨床研究證實[2]；但是，關于微創外科手術清除顱內血腫后對病灶周邊腦組織神經化學變化和血腦屏障(BBB)通透性的變化依然有待進一步研究，對于病灶周圍腦組織在清除血腫后的病理生理改變少有報道。本課題組以Glu、BBB通透性和腦含水量為觀察指標，探討微創技術清除顱內血腫后血腫周圍腦組織Glu水平的變化和BBB通透性與腦含水量的關系。

1 材料及方法

1.1 材料 (1)動物：大耳白兔42只，由貴州醫科大學動物實驗中心提供，體質量2.80～3.40 kg，雌雄不分。(2)主要儀器：兔腦立體定位儀(ZH-藍星B型，淮北正華生物儀器設備有限公司)；電子天平(Satourious德國)；光柵分光光度計(彩虹722型，山東高密彩虹分析儀器有限公司)；5415R高速離心機(冷凍型，Heraeus公司)；202-2型電熱恒溫干燥箱(上海路達實驗儀器有限公司)；數顯恒溫水浴鍋HH-2(國華電器有限公司)；-80 ℃低溫冰箱(Forman Scientific公司)；高效液相色譜儀(HP-1100，美國Agilent Technologies)；G1315A二極管陣列檢測器(DAD,美國Agilent Technologies)；pH計(410A型，美國ORION)；安捷倫1313A自動進樣器(美國Agilent Technologies)；柱溫箱(美國Agilent Technologies)。(3)主要試劑：甲酰胺(HCONH2，重慶川江化學試劑廠)；烏拉坦(C3H7NO2，無錫陽山生化有限責任公司)；伊文思藍(EB，北京恒業中遠化工有限公司)；4%多聚甲醛溶液(博士徳生物工程有限公司)；尿激酶(廣東麗珠公司)；氨基酸標準品(Sigma公司)；衍生化試劑(硼酸鹽緩沖液)、FMOC試劑(安捷倫PN5061-3337)、OPA試劑(安捷倫PN5061-3335均為美國Agilent Technologies公司產品；2,4-二硝基氟苯(日本)；乙腈、甲醇色譜純(德國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將30只大耳白兔制作ICH模型，并分為模型對照組(MC 組)和微創組(MI 組)，每組各15只，再把每組15只動物在組內再平均分成3組(分別于模型制作成功后第1、3、7天處死)，MI組全部動物在模型制作成功后6 h內行微創血腫清除術。將另12只健康大耳白兔，平均分為3組，分別于第1、3、7天處死作為正常對照組(NC 組)。

1.2.2 制作ICH模型 動物模型制作前12 h禁食、4 h禁水，烏拉坦(5 mL/kg)麻醉后固定于兔腦立體定向儀，取兔兩眼眶后緣連線正中線做長約3.0 cm皮膚切口，隨即分離至骨膜，參照兔腦立體定向圖譜確定基底節區位置，從家兔耳中央動脈取自體未凝血，在兔腦立體定向儀的引導下緩慢注入未凝自體動脈血0.5 mL到右側基底節區注血時間3 min以上,保持針頭于原位8 min后再逐漸退針。造模3 h后行頭顱CT檢查,基底節區有高密度影且未破入腦室者提示造模成功。將通過CT掃描提示造模成功的大耳白兔(圖1)送入動物房飼養，所有實驗動物均在靜脈注射烏拉坦后5 h內清醒。

1.2.3 微創顱內血腫清除術的手術步驟 MI組動物均在ICH模型制作成功后6 h內行微創顱內血腫清除術，沿原穿刺孔作為微創手術進針的部位，向原穿刺點注入尿激酶5 000 U(溶于0.5 mL生理鹽水中)，針頭固定原位15 min后開始緩慢抽吸，邊抽吸邊緩慢退針。復查頭顱CT,見血腫基本清除后(圖2)。MC、NC組僅行外科進針程序，不作其他處理。

圖1 CT見右側基底節區血腫形成

1.2.4 采集標本 處置動物后快速斷頭取腦，取血腫周圍5 mm內腦組織置于冰盤，以針道為中心，將腦組織分為4部分(即前內、前外、后內、后外)，前外側部分用于測EB水平，前內側部分立即放入-80 ℃冰箱用于Glu水平檢測，后內側用于測量腦含水量。

圖2 復查頭顱CT見血腫消失

1.2.5 高校液相色譜分析測定血腫周圍Glu水平 色譜柱為ZORBAX clipse-AAA(4.6×150 mm,5 μm);流動相A:40 mmol/L Na2HPO4，pH7.8[5.5 g NaH2PO4(含1分子水)+1 000 mL水，用(10N)NaOH溶液調pH至7.8]，流動相B為ACN∶MeOH∶水(45∶45∶10，V/V/V)。流速為2 mL/min；梯度：0～<18.1 min，B從0上升至57%,18.1～<18.6 min，B從57%上升至100%,18.6～<22.3 min，B維持100%,22.3～<23.2 min，B從100%下降至0%。23.2～26 min,B仍然在0%。柱溫為40 ℃,進樣量為10 μL,二極管陣列檢測器(DAD)波長262 nm,參比波長324 nm。在1 mL甲醇中加入鄰苯二甲醛(OPA)25 mg，使其充分溶解后再加入0.4 mol/L硼酸氫二鈉、硼酸二氫鈉緩沖溶液(pH 10.4) 5 mL,混勻，置于4 ℃冰箱備用。稱取氨基酸標準品適量，用0.2 mol/L 碳酸氫鈉(NaHCO3，pH 9.8) 配制成濃度為1.0 g/L的標準儲備液。解凍腦組織，電子天平稱重后放入干燥玻璃勻漿器中，加0.1 mmol/L稀鹽酸1∶5(W/V)，超聲粉碎(溫度：4 ℃，脈沖：運行2 s，停5 s；強度：20%，共15次)。離心(12 000 r/min，20 min,4 ℃)后，取2.5 μL硼酸緩沖液加入0.5 μL樣品上清液溶液，混合30 s,加入OPA 0.5 μL混合30 s后加入0.5 μL的FMOC混合30 s,加入32 μL水，混合30 s，進樣10 μL。通過色譜工作站積分氨基酸的峰面積，外標法定量，計算氨基酸濃度，再根據標質量可得出每克腦組織氨基酸濃度。

1.2.6 BBB通透率的測定 (1)采用EB作為示蹤劑檢測BBB的通透性。在各實驗點前2 h，經兔耳緣靜脈按2 mL/kg注入2% EB，循環2 h后,迅速提取腦組織，取血腫周圍腦組織用電子天平(精確到0.1 mg)稱質量，隨之把它放入盛有4 mL甲酰胺的試管中，放入54 ℃恒溫箱水浴24 h,離心后分光光度計(λ= 632 nm) 測定上清液吸光度,濾光波長為632 nm，甲酰胺為空白對照。(2)標準曲線的建立：電子天平(精確度0.1 mg)稱取EB 4 mg放入玻璃容器中，緩慢加入生理鹽水至總容積到100 mL，搖勻后用玻璃吸管取0.3 mL，加入5.7 mL甲酰胺配制成第1管標準液，再從第1管標準液中取3 mL加3 mL甲酰胺溶液配制成第2管，據此法依次配置7管標準液，則這7管標準液每毫升所含EB依次為8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg,加蓋橡皮塞，放入54 ℃恒溫水浴箱水浴24 h。然后用上述相同方法測量吸光度，求出它們與EB水平的直線回歸方程：Y=0.005 3X+0.060 8(R2=0.983 3) EB標準曲線,反映吸光度(A)與EB水平的關系。(3)腦組織EB水平計算方法：采用甲酰胺法測定腦組織EB水平以判定BBB的破壞程度。腦組織EB水平(μg/g濕腦)=B×甲酰胺量(mL)/腦組織濕質量(g)，公式中的B是根據標準曲線的直線回歸方程求得的樣本EB水平(μg/mL)。(4)腦組織含水量的測定：提取兔腦組織后先用電子天平稱取濕質量，隨后放入100 ℃電熱恒溫干燥箱，48 h后取出稱其干質量，腦組織含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

2 結 果

2.1 家兔ICH制模情況 本實驗成功制作出30只家兔ICH模型，其中MC組在實驗模型制作成功后不明原因死亡1只；MI組在制作模型時因烏拉坦注射過量死亡2只，模型制作成功后第5天死亡1只。最后MC組及MI組各以12只家兔來進行對比觀察。

2.2 各組家兔腦組織Glu水平比較 MI組家兔血腫周圍腦組織Glu水平在各時間點明顯少于MC組(P<0.05),MC組在各時間點明顯高于NC組(P<0.05)；MI組在第1、3天明顯高于NC組(P<0.05)，但第7天與NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組家兔腦組織Glu水平比較

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與MC組比較P<0.05。

2.3 各組家兔BBB通透性比較 MI組家兔血腫周圍腦組織EB水平在各時間點明顯少于MC組(P<0.05)，MC組和MI組各時間點EB水平均高于NC組(P<0.05)，見表2。

表2 各組家兔腦組織EB水平比較

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與MC組比較P<0.05。

表3 各組家兔組織含水量比較

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與MC組比較P<0.05。

2.4 各組家兔腦組織含水量比較 MI組家兔在各時間點血腫周圍腦組織含水量均明顯低于MC組(P<0.05)，且MC組和MI組血腫周圍腦組織含水量在各時間點均高于NC組(P<0.05)，見表3。

3 討 論

ICH占卒中患者的10%～15%，具有高傷殘率和高死亡率，目前治療主要是針對原發性損害和防止再出血，但所有這些治療都不能有效地減少致殘率和死亡率[3]。繼發性腦損傷是ICH預后不良的重要因素，Glu在繼發性腦損傷中起著重要作用[1]。有研究發現ICH后血腫周圍腦組織Glu水平明顯增高，而興奮性氨基酸水平與其預后密切相關[4-5]，Glu水平越高其預后越差[6]。血腫周圍腦組織Glu水平升高可導致BBB破壞，BBB通透性增加可加重腦水腫，如Glu的興奮性毒性作用被拮抗則可能減少BBB通透性，減少腦水腫。在實驗性蛛網膜下腔出血和彌漫性腦損傷中用Glu受體拮抗劑MK-801后有助于BBB通透性的恢復，有利于減輕腦水腫[7]；研究表明在不影響血腫體積的情況下，用免疫方法阻斷Glu NMDA受體，可明顯減少腦水腫和神經元細胞壞死，并有利于減少神經功能缺陷[8]。本實驗中，經微創技術清除顱內血腫后，血腫周圍腦組織Glu水平明顯下降，血腫的占位效應減少，從而減少BBB通透性及腦含水量。Miller等[9]學者也觀察到血腫周圍腦組織Glu水平增高，微創清除血腫后Glu水平降低。

BBB破壞導致腦水腫形成，ICH后釋放的神經毒性物質，除凝血酶、血紅蛋白對BBB的破壞外，Glu的興奮性毒性作用也可能是腦水腫形成的重要因素[3]。動物鼠模型實驗研究顯示，蛛網膜下腔出血后細胞外Glu水平明顯增加，而Glu轉運體明顯降低[10]。ICH后大量Glu釋放，血腫周圍能量代謝障礙，影響Glu/谷氨酰胺(Gln)比值、限制Glu的攝取，同時，細胞外興奮性神經傳遞物質增加而Glu脫羥酶抑制，導致能量代謝失調和神經毒性物質增加損害BBB，因此，腦水腫與顱內血腫和BBB通透性密切相關。

通過測量不同時間點腦組織EB水平來判斷BBB損害程度，有研究顯示腦內注血后6 h BBB開始有受損，隨著時間的推移逐漸加重，72 h達最高峰[8]，在本實驗中除上述現象外，同時發現腦含水量也有同樣的變化。

腦水腫是ICH后病情惡化的主要原因，ICH后如能盡早、有效地控制腦水腫，則可減少血腫周圍神經元的繼發性損害從而降低死亡率、減少致殘率。血腫清除不但可以減輕腦水腫，還清除了血腫破壞后釋放的凝血酶、Glu、基質金屬蛋白酶、血紅蛋白及其他降解產物對神經的毒害作用[11-12]，減少血腫對周圍腦組織的壓迫，改善局部微循環，加速Glu/Gln循環，促進Glu攝取，Glu在Glu脫羧酶作用下可以轉變成γ-氨基丁酸，減少細胞外興奮性神經遞質，而減少腦水腫、降低BBB通透性。因此，超早期清除顱內血腫對減輕腦水腫和保護BBB有重要的意義[2、13]。

綜上所述，微創清除顱內血腫有利于減少血腫周圍腦組織Glu水平、減少BBB通透性，預防繼發性腦損害的發展。

[1]Hwabejire JO,Imam AM,Jin G,et al.Differential effects of fresh frozen plasma and normal saline on secondary brain damage in a large animal model of polytrauma,hemorrhage and traumatic brain injury[J].J Trauma Acute Care Surg,2013,75(6):968-974.

[2]Lian L,Xu F,Hu Q,et al.No exacerbation of perihematomal edema with intraclot urokinase in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage[J].Acta Neurochir(Wien),2014,156(9):1735-1744.

[3]Zheng H,Chen C,Zhang J,et al.Mechanism and therapy of brain edema after intracerebral hemorrhage[J].Cerebrovasc Dis,2016,42(3/4):155-169.

[4]Bell JD,Thomas TC,Lass E,et al.Platelet-mediated changes to neuronal glutamate receptor expression at sites of microthrombosis following experimental subarachnoid hemorrhage[J].J Neurosurg,2014,121(6):1424-1431.

[5]Zhu HT,Bian C,Yuan JC,et al.Hyperbaric oxygen therapy ameliorates acute brain injury after porcine intracerebral hemorrhage at high altitude[J].Crit Care,2015,19(1):1-10.

[6]Lin BF,Kuo CY,Wen LL,et al.Rosiglitazone attenuates cerebral vasospasm and provides neuroprotection in an experimental rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Neurocrit Care,2014,21(2):316-331.

[7]Imer M,Omay B,Uzunkol A,et al.Effect of magnesium,MK-801 and combination of magnesium and MK-801 on blood-brain barrier permeability and brain edema after experimental traumatic diffuse brain injury[J].Neurol Res,2009,31(9):977-981.

[8]Gaberel T,Macrez R,Gauberti M,et al.Immunotherapy blocking the tissue plasminogen activator-dependent activation of N-methyl-D-aspartate glutamate receptors improves hemorrhagic stroke outcome[J].Neuropharmacol,2013,67(4):267-271.

[9]Miller CM,Vespa PM,Mcarthur DL,et al.Frameless stereotactic aspiration and thrombolysis of deep intracerebral hemorrhage is associated with reduced levels of extracellular cerebral glutamate and unchanged lactate pyruvate ratios[J].Neurocrit Care,2007,6(1):22-29.

[10]Wu CT,Wen LL,Wong CS,et al.Temporal changes in glutamate,glutamate transporters,basilar arteries wall thickness,and neuronal variability in an experimental rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Anesth Analg,2011,112(3):666-673.

[11]Liu Dz,Sharp FR.Excitatory and mitogenic signaling in cell death.blood-brain barrier breakdown,and BBB repair after intracerebral hemorrhage[J].Transl Stroke Res,2012,3(1):62-69.

[12]Cervera A,Amaro S,Chamorro A.Oral anticoagulant-associated intracerebral hemorrhage[J].J Neurol,2012,259(2):212-224.

[13]Wang WM,Jiang C,Bai HM.New insights in minimally invasive surgery for intracerebral hemorrhage[J].Front Neurol Neurosci,2015,37(1):155-165.

Minimally invasive surgery for removing intracranial hematoma and decreasing perihematomal glutamate content and permeability of blood-brain barrier*

LiChang1,TangCuie2,FuRong1,WangLikun3,WuGuofeng3△

(1.DepartmentofNeurology,GuiyangMunicipalSecondPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550081,China;2.TeachingandResearchingSectionofComputer,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China;3.TeachingandResearchingSectionofNeurology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To investigate the effects of minimally invasive intracranial hematoma clearance on the perihematomal glutamate(Glu) level,permeability of blood-brain barrier(BBB) and brain edema.Methods Thirty rabbits with body weight of 2.80-3.40 kg were used to established the model of spontaneous intracerebral hemorrhage(ICH) and randomly divided into the minimally invasive group(MI) and control group(MC) after the model was prepared successfully.The MI group underwent minimally invasive procedures for removing intracranial hematoma by stereotactic instrument within 6 h after establishing the ICH model.The brain tissue was extracted on postoperative 1,3,7 d,and the perihematomal brain tissues were taken to detect the Glu level,BBB permeability and water content of brain tissue,which were compared with those in the control group.Results The Glu level,BBB permeability and brain water content on 1,3,7 d in the MI group were lower than those in the MC group,and the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion The minimally invasive surgery for removing intracranial hematoma is helpful to reduce perihematoma Glu level,BBB permeability and brain water content.

cerebral hemorrhage;minimally invasive surgery for removing intracerebral hematoma;glutamate;blood-brain barrier;brain water content

貴陽市衛生和計劃生育委員會科學技術計劃項目[(2015)筑衛計科技合同字第074號]；貴州省高血壓性顱內出血微創診療科技創新人才團隊。 作者簡介：李昌(1976-)，副主任醫師，碩士研究生，主要從事腦血管疾病和癲癇的診治研究?！?/p>

，E-mail:wuguofeng3013@sina.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.008

R743.34

A

1671-8348(2017)18-2471-04

2017-01-07

2017-03-11)